T小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株，其中CT26. WT， NCI-H460, A549, SMMC-7721，Bel-7402, U251，購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研宄院細(xì)胞 資源中心；BGC-823, SGC-7901，SK-0V-3,購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院胖瘤細(xì)胞庫；HT29, HCT116， PC-3，K562,購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研宄所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。
[0027] 1. 2實(shí)驗(yàn)藥物
[0028] 化合物（I )為自制，峰面積歸一化法純度大于98 %;順鉑注射液（6ml: 30mg)，江 蘇豪森藥業(yè)股份有限公司。
[0029] L 3實(shí)驗(yàn)試劑
[0030] 試劑：RPMI1640 培養(yǎng)基，Solaris ;MDM 培養(yǎng)基，Hyclone ;DMEM-H 培養(yǎng)基， Solaris ;Ham' sF12 培養(yǎng)基，GIBCO ;F12K 培養(yǎng)基，Sigma ;臺盼藍(lán)，Sigma，批號；胰酶， Solaris ;EDTA分析純，上海青析化工科技有限公司；二甲基亞砜分析純，南京化學(xué)試劑有 限公司；生理鹽水，江西科倫藥業(yè)有限公司。
[0031] 試劑配制：
[0032] D/F12培養(yǎng)基：將Ham' sF12培養(yǎng)基配制后，與DMEM-H 1:1混勻，4°C備用；
[0033] MTT工作液：使用時(shí)用PBS配制成5mg/ml溶液，過濾，分裝，-20 °C備用；
[0034] PBS 緩沖液：精密稱取 NaCL 8g，KCL 0· 2g，Na2HPO4 · 12H20 2. 89g，KH2PO4O. 2g，溶 于IL超純水中，調(diào)PH至7. 2,高壓滅菌，4°C備用；
[0035] 消化液：0. 25%胰酵+0. 02% EDTA，PBS配制，過濾除菌，4°C備用；
[0036] 臺盼藍(lán)工作液：用PBS配制成0. 4%臺盼藍(lán)溶液，室溫避光保存?zhèn)溆谩?br>[0037] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0038] 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)
[0039] 細(xì)胞購進(jìn)后，用含10%胎牛血清的相應(yīng)培養(yǎng)基在37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)，傳3代 后，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
[0040] RPMI 1640 培養(yǎng)液的細(xì)胞：NCI-H460, SMMC-7721，Bel-7402, U251，BGC-823， SGC-7901，SK-0V-3, K562 ;
[0041] F12K 培養(yǎng)液的細(xì)胞：PC-3, A549 ;
[0042] D/F12培養(yǎng)液的細(xì)胞：HT29 ;MDM培養(yǎng)液的細(xì)胞：HCT116。
[0043] 2. 2受試藥物的配制
[0044] 化合物（I ):電子天平稱取少量受試藥物（1~3mg)，用少量DMSO溶解后（最終 DMSO含量在0. 1 %以內(nèi)），用相應(yīng)培養(yǎng)基配制成5個(gè)濃度梯度的藥液，首濃度過濾后，后面的 濃度對半稀釋配制，B卩100,50,25,12. 5,6.25 μ g/ml，備用；
[0045] 順鉑注射液：作為陽性對照藥物，用培養(yǎng)基配制成5個(gè)濃度梯度的藥液，即30,15， 7. 5, 3. 75, L 875 μ g/ml，備用。
[0046] 藥物均在種板24h后，臨時(shí)配制，再加入96孔板中。
[0047] 2. 3細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)
[0048] 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度為8 X IO4個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100 μ I，24h 后加入不同濃度含藥培養(yǎng)基100 μ 1，對照組每孔加培養(yǎng)基100 μ 1，對照組與藥物組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白對照組，不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的作為調(diào)零組。將96孔板置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，加入5mg/ml MTT 20μ1，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄上清，加入DMSO 150μ1，振蕩 溶解lOmin，酶標(biāo)儀于490nm測定OD值。
[0049] 2. 4觀察指標(biāo)
[0050] 抑制率（％ ):
[0051] 抑制率（％ ) = (1-用藥組平均OD值/對照組平均OD值）X 100%
[0052] 半數(shù)抑制濃度（IC50):
[0053] 按寇氏改良法公式：X50 = Xm_i (ΣΡ-0. 5)
[0054] 貝丨J :IC50 = log-1X50
[0055] (Xm:最大劑量組劑量的對數(shù)值；i :相鄰兩組劑量（d)對數(shù)值之差，或相鄰兩組高 劑量與低劑量之比的對數(shù)；P :各組細(xì)胞的死亡率，用小數(shù)表示；ΣΡ :為各組細(xì)胞死亡率的 總和），計(jì)算 IC5tl ( μ g/ml)。
[0056] 2. 5重復(fù)實(shí)驗(yàn)
[0057] 按上述實(shí)驗(yàn)方法，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，觀察實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，計(jì)算三次IC50均值。
[0058] 3、結(jié)果
[0059] 結(jié)果顯示，化合物（I )對12種人腫瘤細(xì)胞株均有很好的體外抑制作用，在 25 μ g/ml劑量對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率可達(dá)99%，且呈劑量依賴關(guān)系，三批實(shí)驗(yàn)重復(fù)性 較好，結(jié)果穩(wěn)定。化合物（I )對12種人腫瘤細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度（IC50)范圍為： 3. 44-9. 91 μ g/ml ;對結(jié)腸癌尤為敏感，對人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCTl 16和人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞 HT-29的抑制作用與順鉑效果相當(dāng)。見表2。
[0060] 表2三批實(shí)驗(yàn)化合物（I )及順鉑對不同人腫瘤細(xì)胞的IC50值（μ g/ml)
[0061]
[0062] 實(shí)施例3 :
[0063] 片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:8. 5的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0064] 實(shí)施例4 :
[0065] 口服液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制 成口服液。
[0066] 實(shí)施例5 :
[0067] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如 酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0068] 實(shí)施例6 :
[0069] 注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。
[0070] 實(shí)施例7 :
[0071] 無菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石 酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射 用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌 熔封得粉針劑。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I ):2. 藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物（I )和藥學(xué)上可接 受的載體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于，包含以下方法步驟： (a)取干燥的芫花花蕾依次用95%乙醇、70%乙醇熱回流提取，合并提取液，減壓濃縮至無 醇味，得濃縮液；(b)將步驟（a)中濃縮液依次用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯和水飽和的正 丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、醋酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（C) 對步驟（b)中的醋酸乙酯萃取物用正相硅膠分離，依次用體積比為70:1、40:1、20:1和5:1 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，得到4個(gè)組分；（d)將步驟（c)中的組分3用正相硅膠分離， 依次用體積比為25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)將步驟 (d)中的組分2用反相硅膠分離，用體積百分濃度為72%的甲醇水溶液等度洗脫，得到純的 化合物（I )。4. 權(quán)利要求1所述的化合物（I )在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求2所述的藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從芫花中分離得到的一種新的抗腫瘤化合物，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。該化合物為首次報(bào)道，體外活性試驗(yàn)證明其對多種腫瘤細(xì)胞株均有很好的抑制作用，對部分腫瘤細(xì)胞的抑制效果和陽性藥相當(dāng)，可以用來開發(fā)成抗腫瘤藥物。
【IPC分類】C07D407/06, A61P35/02, A61P35/00, A61K31/365
【公開號】CN104974144
【申請?zhí)枴緾N201510429055
【發(fā)明人】張作瑋
【申請人】張作瑋
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年7月21日