具有人血紅素加氧酶基因核心啟動(dòng)子，選定 增強(qiáng)子區(qū)段和Kozak序列的雜合啟動(dòng)子的基于pAC3的載體pAC3-H0El. y⑶2, pAC3-H0E2. yCD等的構(gòu)建，配置和測(cè)試
[0174] 載體中的pAC3骨架由核酸內(nèi)切酶消化pAC3-y⑶2質(zhì)粒DNA的Mlu I和NotI來(lái) 分咼。
[0175] 表2中列出了編碼元件的六個(gè)雙鏈合成DNA片段，并且使用包含Mlul識(shí)別位 點(diǎn)（ACGCGT)的雙鏈合成DNA片段。表2中的每個(gè)片段也具有為了彼此連接的5'突出 5-GATC-3,如Mlul位點(diǎn)一樣。各個(gè)片段通過(guò)加熱到90°C并緩慢冷卻進(jìn)行退火，在5'端用 T4多核苷酸激酶反應(yīng)磷酸化，然后以等摩爾量與1/10和1/100摩爾激酶化的Mlul位點(diǎn)混 合并連接。用Mlul消化連接混合物，其產(chǎn)物在凝膠上電泳，將40-200bp部分從凝膠切出并 純化。
[0176] 對(duì)應(yīng)于與Kozak起始位點(diǎn)和y⑶2基因融合的人血紅素加氧酶1基因核心啟動(dòng)子 序列在3'端Notl和5'端Mlul位點(diǎn)合成，并用兩種酶消化。
[0177] 合成的片段是：
[0178] 5' -
[0179] ACGCGTGGGGCGGGCTGGGCGCGGGCCCCTGCGGGTGTTGCAACGCCCGGCCAGAAAGTGGGCATCAGC TGTTCCGCCTGGCCCACGTGACCCGCCGAGCATMATGTGACCGGCCGCGGCTCCGGCAGTCMCGCCACCilZCGT GACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTACGAGGAGGCCCTGCTGGGCTACAAGG AGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAACAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGG TTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCTGCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTA CAAGGACACCACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCCCTA GGTGTGTGATCGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCAGGGGCCACGAGGTGGTG GTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGCTGATGAAGCAGTTCATCGACGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATAT CGGCGAGTGAGCGGCCGC-3' (SEQ ID NO:56)；
[0180] 其中大C是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，第一個(gè)劃線序列是包括yCD2基因的ATG起始密碼子 (斜體）的Kozak序列，并且第二個(gè)下劃線序列是y⑶2的終止密碼子。該片段是625個(gè)核 苷酸，具有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的126bp片段，其為血紅素加氧酶啟動(dòng)子。在攜帶轉(zhuǎn)錄因子結(jié) 合位點(diǎn)混合物的過(guò)量Mlul片段存在下，將該片段連接到如上分離的pAC3Mlul-Not骨架片 段上，并且通過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)染分離單個(gè)的克隆，之后分析DNA小量制備的限制性消化，以鑒定具 有pAC3骨架的血紅素加氧酶啟動(dòng)子和CD的質(zhì)粒，并且結(jié)合位點(diǎn)混合物的單個(gè)拷貝低于約 200bp〇
[0181] 將攜帶所需序列的質(zhì)粒隨后通過(guò)瞬時(shí)感染用于制備感染性載體，感染U87細(xì)胞并 通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)⑶蛋白。鑒定并測(cè)序表達(dá)⑶蛋白與pAC3-y⑶2等量或以上的載體，以 表征轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)混合物。將鑒定的小至40bp的合適結(jié)合位點(diǎn)混合物與其他基因一 起用于制備載體。如前所述，通過(guò)連續(xù)傳代測(cè)試載體的穩(wěn)定性。
[0182] 可選擇地，將轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，核心啟動(dòng)子-CD和pAC3骨架的連接混合物用于 PALA選擇法在諸如U87的靶細(xì)胞中篩選高水平表達(dá)CD蛋白的載體。
[0183] 實(shí)施例19:含有驅(qū)動(dòng)yCD2基因表達(dá)的具有皰瘆病毒1胸苷激酶基因啟動(dòng)子，選定 增強(qiáng)子區(qū)段和Kozak序列的雜合啟動(dòng)子的基于pAC3的載體pAC3-cTK. y⑶2的構(gòu)建，配置和 測(cè)試
[0184] 已知皰瘆胸苷激酶基因序列在正常mRNA編碼序列的第一和第三ATG之間具有 隱藏的核心啟動(dòng)子（Al-shawi et al.Mol.Cell.Biol.ll:42071991，Salamon et al Mol. Cell. Biol. 15:53221995)。這 180bp 序列：
[0185] ATGGCTTCGTACCCCTGCCATCAACACGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGC AACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCTGGAGCAGAAAATGCCCACGCT ACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCTCACGGGATG(SEQ ID NO:57)
[0186] 與諸如實(shí)施例18中分離的那些混合物的兩個(gè)增強(qiáng)子或在此情況下與來(lái)自 SV40 的 72bp 增強(qiáng)子重復(fù)共同合成（Gruss et al PNAS 78:943-9471981，NCBI 參考序 列：NC_001669. 1)，其單個(gè)副本是：
[0187] 5，-
[0188] TGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTT CCACACC-3'（SEQ ID N0:58)，位于TK隱藏啟動(dòng)子上游，并且具有y⑶2序列下游，起始于該 隱藏啟動(dòng)子3'端的ATG起始密碼子?？偟暮铣尚蛄性?'端和3'端分別具有MLul和Notl 位點(diǎn)，并且插入如實(shí)施例18中分離的pAC3MLul-Notl骨架片段。將連接混合物用于轉(zhuǎn)染細(xì) 菌，分離期望的分子克隆，并通過(guò)如實(shí)施例所述的蛋白印跡法檢測(cè)穩(wěn)定性和CD蛋白。CD表 達(dá)水平至少與pAC3-y⑶2中一樣好。
[0189] 實(shí)施例20 :含有SV40啟動(dòng)子，RSV啟動(dòng)子，具有選定增強(qiáng)子區(qū)段的合成啟動(dòng)子的基 于PAC3的載體的構(gòu)建，配置和轉(zhuǎn)基因表達(dá)的測(cè)試
[0190] 載體中的pAC3骨架由核酸內(nèi)切酶消化pAC3-y⑶2質(zhì)粒DNA的Mlu I和NotI位 點(diǎn)，或由核酸內(nèi)切酶消化pAC3-Gluc質(zhì)粒DNA的Mlu I和PsiI位點(diǎn)來(lái)分離。
[0191]逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制型載體pAC3-SV40-GFP-R，pAC3-SV40-Gluc，pAC3-RSV-Gluc和 pAC3. ESl-Gluc源自pAC3-y⑶2的骨架。pAC3骨架由核酸內(nèi)切酶消化pAC3-y⑶2質(zhì)粒DNA 的Mlu I和Not I分離。用在DNA片段各端的Mlu I和Psi I通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)合 成或擴(kuò)增SV40-GFP-R的DNA序列，用于亞克隆至pAC3-Gluc骨架，以替換在相應(yīng)限制性位 點(diǎn)上的IRES序列。
[0192] 在pAC3-SV40-GFP-R構(gòu)建體上，將SV40-GFP盒以與3' UTR相反的方向放置，以使 啟動(dòng)子對(duì)前病毒DNA配置的干擾最小。
[0193] 如前所述，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備pAC3-SV40-GFP-R病毒。用這些載體以 0. 01的M0I感染初始U87細(xì)胞。在感染后第13天，收獲并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)由門(mén)控的GFP陽(yáng) 性細(xì)胞分析細(xì)胞，測(cè)定GFP陽(yáng)性群體的平均熒光強(qiáng)度。圖7顯示pAC3-SV40-GFP-R的GFP 表達(dá)水平高于PAC3-S1-GFP，但仍顯著低于通過(guò)IRES介導(dǎo)的pAC3-GFP的表達(dá)水平。
[0194] 如前所述，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備pAC3-Gluc，pAC3-SV40-Gluc， pAC3-RSV-Gluc和pAC3. ESl-Gluc病毒。用這些載體以0. 01的M0I感染初始U87細(xì)胞。收 集每代細(xì)胞的上清液（感染后第3天，第6天以及第9天）。在每次細(xì)胞傳代時(shí)，將相同數(shù) 量的細(xì)胞接種并培養(yǎng)于等體積的培養(yǎng)基中。制備1 :5連續(xù)稀釋的各時(shí)間點(diǎn)每個(gè)樣品上清 液，以測(cè)量在底物腸腔素以15uM終濃度存在時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)表明，用SV40，RSV和ESI 啟動(dòng)子介導(dǎo)的Glue表達(dá)水平少于由IRES介導(dǎo)的水平2-3倍。
[0195] 實(shí)施例21 :含有RSV啟動(dòng)子，SV40啟動(dòng)子，S1核心啟動(dòng)子，EC1合成子和ESI合成 啟動(dòng)的基于PAC3的載體的構(gòu)建，配置和轉(zhuǎn)基因表達(dá)測(cè)試
[0196] 如前所述，載體中的pAC3骨架由核酸內(nèi)切酶消化pAC3-y⑶2質(zhì)粒DNA的Mlu I和 NotI位點(diǎn)，或由核酸內(nèi)切酶消化pAC3-Gluc質(zhì)粒DNA的Mlu I和Psi I位點(diǎn)來(lái)分離。
[0197]逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制型載體 pAC3-SV40-GFP-R，pAC3-SV40-Gluc，pAC3-RSV-Gluc 和 pAC3. ESl-Gluc源自pAC3-y⑶2的骨架。該pAC3骨架由核酸內(nèi)切酶消化pAC3-y⑶2質(zhì)粒 DNA的Mlu I和Not I來(lái)分離。在DNA片段各端的Mlu I和Psi I通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR) 分別合成或擴(kuò)增SV40-GFP-R、SV40-Gluc、RSV-Gluc和ESl-Gluc的DNA序列，用于亞克隆 至pAC3-Gluc骨架，以替換相應(yīng)限制性位點(diǎn)的IRES序列。在pAC3-SV40-GFP-R構(gòu)建體中， 將SV40-GFP盒以與3' UTR相反的方向放置，以使啟動(dòng)子對(duì)前病毒DNA配置的干擾最小。
[0198]將具有 Mlu I 和 Psi I 位點(diǎn)的 SV40-Gluc，RSV-Gluc 和 ECl-Gluc，Sl-Gluc 和ESl-Gluc盒以與LTR相同的方向放置。RVS啟動(dòng)子長(zhǎng)度為271nts ;SV40啟動(dòng)子長(zhǎng) 度為324nts。合成S1核心啟動(dòng)子長(zhǎng)度為80nts。由CRE的串聯(lián)重復(fù)（Schlabach et al.，2010PNAS)和 C 1 核心啟動(dòng)子（Juven-Gershon et al.，2006Nature Methods)組成的 雜合啟動(dòng)子EC1的長(zhǎng)度為181nts。CRE的串聯(lián)重復(fù)和SI核心啟動(dòng)子（Juven-Gershon et al.，2006Nature Methods)的雜交體 ESI 的長(zhǎng)度為 188nts。
[0199]在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的 293T 和 Hela 細(xì)胞中評(píng)估了 pAC3-Gluc，pAC3-RSV-Gluc， pAC3-SV40-Gluc，pAC3-ECl-Gluc，pAC3-Sl-Gluc 和 pAC3-ESl-Gluc 的 Glue 表達(dá)。在感染 后48小時(shí)，收集上清液，通過(guò)與15uM終濃度的腸腔素共孵育1 :3或1 :4連續(xù)稀釋的上清液 來(lái)測(cè)定Glue表達(dá)水平。
[0200] 數(shù)據(jù)示于圖9中。在293T細(xì)胞中，由RSV介導(dǎo)的Glue表達(dá)水平高于由IRES介導(dǎo) 的Glue表達(dá)大約3倍。由SV40, EC1啟動(dòng)子介導(dǎo)的Glue表達(dá)水平與IRES介導(dǎo)的表達(dá)相 當(dāng)。如所預(yù)期的，S1核心啟動(dòng)子介導(dǎo)的Glue表達(dá)少于IRES介導(dǎo)的表達(dá)3倍。對(duì)ESI而言， 啟動(dòng)子活性小于IRES和EC1約1/3,但高于單獨(dú)的S12倍。
[0201] 在HeLa細(xì)胞中，由RSV，SV40和ESI介導(dǎo)的Glue表達(dá)水平低于IRES介導(dǎo)的Glue 表達(dá)水平大約2. 5倍。RSV結(jié)果與見(jiàn)于293T細(xì)胞中的結(jié)果（比高于IRES3倍）的差異如所 預(yù)期的，雖然已知RSV LTR啟動(dòng)子是普遍表達(dá)的，但異常地，在Hela細(xì)胞中，它被在大多數(shù) 其它細(xì)胞類型中不存在的21kD抑制蛋白特異性抑制。由單獨(dú)的S1核心啟動(dòng)子介導(dǎo)的Glue 表達(dá)水平小于由IRES介導(dǎo)的表達(dá)約10倍。然而，合成增強(qiáng)子（ESI)的整合提高啟動(dòng)子活 性4倍。通過(guò)EC1介導(dǎo)的Glue表達(dá)水平略高于由IRES介導(dǎo)的表達(dá)（圖9)。
[0202] 通過(guò)瞬時(shí)感染 293T 細(xì)胞制備 pAC3-Gluc，pAC3-CMV-Gluc，pAC3-RSV-Gluc 和 pAC3-SV40-Gluc病毒。這些載體以0. 01的MOI感染初始U87細(xì)胞。收集每次細(xì)胞傳代的 上清液（感染后第3天，第6天以及第9天）。在每次細(xì)胞傳代中，將相同數(shù)量的細(xì)胞接種 并在相同體積的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。制備各時(shí)間點(diǎn)的每個(gè)樣品的上清液的1 :3連續(xù)稀釋，以測(cè) 量15uM終濃度的腔腸素底物存在下的熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)顯示，由RSV，SV40, EC1和ESI啟動(dòng) 子介導(dǎo)的Glue的表達(dá)水平與由IRES介導(dǎo)的表達(dá)水平相當(dāng)。
[0203] 已描述了本公開(kāi)的大量實(shí)施方案。然而，將理解的是，不脫離本公開(kāi)的精神和范圍 可進(jìn)行各種修改。因此，其他實(shí)施方案在以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有復(fù)制能力的重組Y逆轉(zhuǎn)錄病毒，其包含： 逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白； 逆轉(zhuǎn)錄病毒POL蛋白； 逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜； 逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸，其包含位于所述逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列3'端的長(zhǎng)末端重復(fù) (LTR)序列、位于所述逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸5'端的啟動(dòng)子序列、gag核酸結(jié)構(gòu)域、pol核酸 結(jié)構(gòu)域和env核酸結(jié)構(gòu)域，所述啟動(dòng)子適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)； 治療盒，其包含具有可操作地連接至異源多核苷酸的小型啟動(dòng)子的至少一個(gè)小型啟動(dòng) 子盒，其中所述治療盒位于3' LTR的5'端和編碼所述逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜的env核酸結(jié)構(gòu)域 的3'端，并且其中當(dāng)僅有一個(gè)小型啟動(dòng)子盒存在時(shí)，所述異源多核苷酸的長(zhǎng)度為I. 2kb至 2. Okb ;以及 在靶細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄、包裝和整合所必需的順式作用序列。2. 重組復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其包含： 逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白； 逆轉(zhuǎn)錄病毒POL蛋白； 逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜； 逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸，其包含位于所述逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列3'端的長(zhǎng)末端重復(fù) (LTR)序列、位于所述逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸5'端的啟動(dòng)子序列、gag核酸結(jié)構(gòu)域、pol核酸 結(jié)構(gòu)域和env核酸結(jié)構(gòu)域，所述啟動(dòng)子適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)； 治療盒，其包含含有可操作地連接至異源多核苷酸的小型啟動(dòng)子的小型啟動(dòng)子盒，其 中所述小型啟動(dòng)子盒位于3' LTR的5'端和編碼所述逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜的env核酸結(jié)構(gòu)域的 3'端，其中所述小型啟動(dòng)子缺少SCP1，Ad或CMV核心啟動(dòng)子；以及 在靶細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄、包裝和整合所必需的順式作用序列。3. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列源自選自 以下的病毒：鼠白血病病毒（MLV)，莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV)，貓白血病病毒（FeLV)，狒 狒內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（BEV)，豬內(nèi)源性病毒（PERV)，源自貓的逆轉(zhuǎn)錄病毒RD114,松鼠猴逆 轉(zhuǎn)錄病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒（REV)，或長(zhǎng)臂猿白血病病毒（GALV)。4. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜為兼嗜性MLV包膜。5. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述靶細(xì)胞為具有細(xì)胞增殖性病癥的細(xì) 胞。6. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述靶細(xì)胞為贅生性細(xì)胞。7. 如權(quán)利要求5所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述細(xì)胞增殖性病癥選自：肺癌，結(jié)腸-直腸 癌，乳腺癌，前列腺癌，尿道癌，子宮癌，腦癌，頭頸癌，胰腺癌，黑素瘤，胃癌和卵巢癌，淋巴 瘤，白血病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它自身免疫性疾病。8. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述啟動(dòng)子序列與生長(zhǎng)調(diào)控基因相關(guān)。9. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述啟動(dòng)子序列包含組織特異性啟動(dòng)子 序列。10. 如權(quán)利要求9所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述組織特異性啟動(dòng)子序列包含至少一個(gè) 雄激素應(yīng)答元件（ARE)。11. 如權(quán)利要求9所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述組織特異性啟動(dòng)子序列包含至少一個(gè) 糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件。12. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述啟動(dòng)子包含CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域多核 苷酸。13. 如權(quán)利要求12所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域包含連接至MLV R-U5 區(qū)的來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子。14. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述gag多核苷酸源自Y逆轉(zhuǎn)錄病毒。15. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述pol多核苷酸結(jié)構(gòu)域源自Y逆轉(zhuǎn) 錄病毒。16. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述小型啟動(dòng)子是核心啟動(dòng)子。17. 如權(quán)利要求1，2或16所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述小型啟動(dòng)子是優(yōu)化的核心啟動(dòng) 子。18. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述治療盒包含（a)至少兩個(gè)小 型啟動(dòng)子盒，（b)至少一個(gè)小型啟動(dòng)子盒和polIII啟動(dòng)子盒，或（c)至少一個(gè)小型啟動(dòng)子 盒和IRES盒。19. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述小型啟動(dòng)子長(zhǎng)度為約70-500bp。20. 如權(quán)利要求1，2或19所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述小型啟動(dòng)子包含核心啟動(dòng)子，并 且還包含增強(qiáng)子元件。21. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述小型啟動(dòng)子包含TATA盒和起始 子位點(diǎn)，基序十元件（MTE)，下游啟動(dòng)子元件（DPE)和至少一種選自以下的附加元件：(a) TFIIB識(shí)別元件，上游（BREu) ;(b) TFIIB識(shí)別元件，下游（BREd) ; (C)HBV X核心啟動(dòng)子元件 I(XCPEl) ;(d)HBV X核心啟動(dòng)子元件2(XCPE2) ;(d)下游核心元件位點(diǎn)I(CDE SI) ;(e)下 游核心元件位點(diǎn)II (⑶E SII);以及（f)下游核心元件位點(diǎn)III (⑶E SIII)。22. 如權(quán)利要求21所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述小型啟動(dòng)子還包含增強(qiáng)元件。23. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述異源核酸包含具有如SEQ ID NO : 3, 5,11，13,15或17所示序列的多核苷酸。24. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述異源核酸編碼包含如SEQ ID NO : 4所示序列的多肽。25. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述異源核酸為人密碼子優(yōu)化的，并且 編碼如SEQ ID N0:4所示的多肽。26. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述3'LTR源自Y逆轉(zhuǎn)錄病毒。27. 如權(quán)利要求26所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述3' LTR包含U3-R-U5結(jié)構(gòu)域。28. 如權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述異源核酸序列編碼生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑或 免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子。29. 如權(quán)利要求28所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子選自：白細(xì)胞介素1 至15,干擾素，腫瘤壞死因子（TNF)，以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子（GM-CSF)。30. 如權(quán)利要求28所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子為干擾素Y。31. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述異源核酸編碼將無(wú)毒性前藥轉(zhuǎn)化為 毒性藥物的多肽。32. 如權(quán)利要求31所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述將無(wú)毒性前藥轉(zhuǎn)化為毒性藥物的多肽 是胸苷激酶，嘌呤核苷磷酸化酶（PNP)或胞嘧啶脫氨酶。33. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述異源核酸序列編碼受體結(jié)構(gòu)域，抗 體或抗體片段。34. 如權(quán)利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述異源核酸序列包括抑制性多核苷 酸。35. 如權(quán)利要求34所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述抑制性多核苷酸包括miRNA，RNAi或 siRNA序列。36. 如權(quán)利要求35所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中所述治療盒包含可操作地連接至異源核酸 的小型啟動(dòng)子和可操作地連接至所述miRNA、RNAi或siRNA編碼結(jié)構(gòu)域的polIII啟動(dòng)子。37. 用于產(chǎn)生權(quán)利要求1或2所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸基因組。38. 將治療分子遞送至受試者的方法，其包括使受試者與前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述 的逆轉(zhuǎn)錄病毒接觸。39. 治療細(xì)胞增殖性病癥的方法，其包括在使胞嘧啶脫氨酶多核苷酸表達(dá)的條件下使 受試者與權(quán)利要求23所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒接觸，以及使受試者與5-氟胞嘧啶接觸。40. 如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述細(xì)胞增殖性病癥是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。41. 如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述細(xì)胞增殖性病癥選自：肺癌，結(jié)腸-直腸癌， 乳腺癌，前列腺癌，尿道癌，子宮癌，腦癌，頭頸癌，胰腺癌，黑素瘤，胃癌和卵巢癌。42. 治療受試者細(xì)胞增殖性病癥的方法，其包括使受試者與權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)錄 病毒接觸，其中所述異源核酸序列編碼抑制贅生性細(xì)胞增殖的治療性蛋白。43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述治療性蛋白包含將非細(xì)胞毒性藥物轉(zhuǎn)化為細(xì) 胞毒性藥物的多肽。44. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述多肽具有胞嘧啶脫氨酶活性。45. 如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述多肽包含如SEQ ID NO :4,12,14,16或18所 示的序列。46. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述非細(xì)胞毒性藥物為5-氟胞嘧啶。47. 治療細(xì)胞增殖性病癥的方法，其包括在使逆轉(zhuǎn)錄病毒感染患病細(xì)胞的條件下，將權(quán) 利要求1或2所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒給予患有細(xì)胞增殖性病癥的受試者，以及使受試者與抗癌 劑或化療劑接觸。48. 如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述抗癌劑選自：貝伐單抗（bevacizumab)， 哌加他尼（pegaptanib)，雷珠單抗（ranibizumab)，索拉非尼（sorafenib)，舒尼替尼 (sunitinib)，AE_941，VEGF Trap，帕挫帕尼（pazopanib)，凡德他尼（vandetanib)，瓦他拉 尼（vatalanib)，西地尼布（cediranib)，芬維 A 胺（fenretinide)，角藍(lán)胺（squalamine)， INGN-241，口服四硫鉬酸鹽，四硫鉬酸鹽，Panzem NCD，2-甲氧雌二醇，AEE-788，AG-013958， bevasiranib 鈉，AMG-706,阿西替尼（axitinib)，BIBF-1120, CDP-791，CP-547632, PI-88， SU-14813, SU-6668, XL-647, XL-999, MC-1121B， ABT-869, BAY-57-9352, BAY-73-4506， BMS-582664, CEP-7055, CHIR-265, CT-322, CX-3542, E-7080, ENMD-1198, 0SI-930, PTC-299， Sirna-027, TKI-258, Veglin，XL-184,或 ZK-304709。49. 如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒按約10 3至10 7TU/g腦重量給予。50. 如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒按約10 4至10 6TU/g腦重量給予。51. 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制型載體（RRV)，其包含： 逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白； 逆轉(zhuǎn)錄病毒POL蛋白； 逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜； 逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸，其包含位于所述逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列3'端的長(zhǎng)末端重復(fù) (LTR)序列、位于所述逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸5'端的啟動(dòng)子序列、gag核酸結(jié)構(gòu)域、pol核酸 結(jié)構(gòu)域和env核酸結(jié)構(gòu)域，所述啟動(dòng)子適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)； 治療盒，其包含可操作地連接至異源多核苷酸的小型啟動(dòng)子盒，包含連接至miRNA的 初級(jí)前體miRNA(pri-miRNA)或siRNA序列的POLIII PROMOTER啟動(dòng)子的miRNA盒；以及 在靶細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄、包裝和整合所必需的順式作用序列。52. 如權(quán)利要求51所述的RRV，其中所述miRNA選自：miR-142-3p，miR-181，miR-223， miR128-l和 miR128-2。
【專利摘要】本公開(kāi)提供了用于基因遞送的逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制型載體，其包括含有至少一個(gè)與待表達(dá)的基因相連接的小型啟動(dòng)子的治療盒。
【IPC分類】A61P35/00, C12N15/867, C12N7/01
【公開(kāi)號(hào)】CN104884627
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380067486
【發(fā)明人】海瑞·E·格魯伯, 道格拉斯·J·喬利, 艾米·H·林, 克里斯多弗·R·洛格, 笠原典之
【申請(qǐng)人】托卡根公司
【公開(kāi)日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2013年10月24日
【公告號(hào)】EP2909324A1, US20150273029, WO2014066700A1