具有小型啟動(dòng)子盒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2012年10月25日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第61/718, 610號(hào)的優(yōu) 先權(quán)，其公開(kāi)的內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開(kāi)涉及治療細(xì)胞增殖的逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制型載體（RRV)。本公開(kāi)還涉及使用這 些逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制型載體遞送和表達(dá)異源核酸。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 遞送基因和異源核酸至細(xì)胞和受試者的有效方法的發(fā)展一直是可能治療疾病和 病癥的目標(biāo)。
[0006] 復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（RRV;又名具有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒）已被用于選擇性 地感染動(dòng)物模型的腫瘤（Wang et al.，Hum. Gene. Ther.，14:117-127, 2003, Tai et al.，Mol Ther，12:842-851，2005)，其中通過(guò)腫瘤發(fā)生復(fù)制。對(duì)于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的常規(guī)策略一直使用 IRES元件，以允許翻譯從內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)開(kāi)始。在大小受限的載體中，該IRES組件 約600bp，離編碼序列大約900bp。如果該載體配備了前藥活化基因如由內(nèi)部IRES序列表 達(dá)的胞嘧啶脫氨酶或嘌呤核苷酸磷酸化酶，則通過(guò)前藥（例如，5-氟胞嘧啶，其由胞嘧啶脫 氨酶原位轉(zhuǎn)化為抗癌藥物5-氟尿嘧啶）的后續(xù)處理，腫瘤可以被消除或生長(zhǎng)/擴(kuò)散被抑 制（Tai et al.，Mol Ther. ,12:117-127, 2005, Ostertag et al.，Neuro Oncol.，2012)。 這樣的載體現(xiàn)在被用于臨床實(shí)驗(yàn)治療原發(fā)性腦腫瘤（參見(jiàn)萬(wàn)維網(wǎng)clinicaltrials. gov， NCT01156584)。然而，當(dāng)總的插入大小超過(guò)約1. 5kb時(shí)，這種RRV的遺傳穩(wěn)定性顯著降低，致 使若干潛在有用的基因或基因組合物對(duì)于簡(jiǎn)單可靠的治療應(yīng)用不能保證足夠穩(wěn)定。具體的 例子是源于皰瘆胸苷激酶（HSVtk)(SEQ ID N0:35)的常用前藥激活基因，可以通過(guò)原位磷 酸化激活常見(jiàn)的抗皰瘆藥物如更昔洛韋，阿昔洛韋，伐昔洛韋（Valtrex?)或其它類(lèi)似物， 導(dǎo)致細(xì)胞殺傷。HSVtk基因具有正好超過(guò)1. lkb的編碼序列，當(dāng)與IRES組合在一些表達(dá)構(gòu) 建體中使用時(shí)，形成大于約1.6kb的插入序列。這個(gè)大小對(duì)于臨床使用是不夠穩(wěn)定的。另 一例子是胞嘧啶脫氨酶基因（SEQ ID N0:1或3)與UPRT基因（SEQ ID N0:7)或0PRT基因 (W02010036986, Perez et al.，Mol. Ther.，2005)的組合，其中這些融合基因大約 1200bp。 雖然缺失發(fā)生之前的表達(dá)是令人滿(mǎn)意的，但是與IRES組合時(shí)大小超過(guò)1. 8kb并表現(xiàn)出不期 望的不穩(wěn)定性。
[0007] Logg等人（PNAS，105(12) : 4733-4738, 2008)嘗試過(guò)各種較短序列的IRES構(gòu)建體， 以改善整合至RRV中的外源基因大小，僅獲得了有限的成功。具體地講，Logg等人證明可 以得到表達(dá)，但是由于IRES具有的剪接供體/受體作用較小的性質(zhì)，其穩(wěn)定性被降低。
[0008] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0009] 本公開(kāi)提供了允許復(fù)制型載體中總體大小超過(guò)約0.9kb的基因或多個(gè)基因在體 內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的方法和組合物。本公開(kāi)提供了包含至少一個(gè)小型啟動(dòng)子盒的載體，其能夠表 達(dá)大于1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,或1. 9kb的異源基因。如果考慮的治療盒是多個(gè)小 型啟動(dòng)子盒，或者單一小型啟動(dòng)子盒與包含可操作地連接至第二治療分子的polIII啟動(dòng) 子或IRES的第二盒，則整個(gè)治療盒可包含約1. 2-2. Okb。例如，當(dāng)治療盒中存在兩個(gè)小型啟 動(dòng)子盒時(shí)，第一小型盒可以表達(dá)第一基因或治療性分子，而第二盒可以表達(dá)第二基因或治 療性分子。
[0010] 還公開(kāi)了，用于驅(qū)動(dòng)約1.2kb的基因表達(dá)的新的小型啟動(dòng)子構(gòu)建體，其位于具有 復(fù)制能力的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒（RRV)中。考慮到前述的一般概念，本公開(kāi)提供了具有復(fù)制能 力的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒（RRV)，其包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白；逆轉(zhuǎn)錄病毒POL蛋白；逆轉(zhuǎn)錄病 毒包膜（ENV);逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸，其包含位于逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列3'端的長(zhǎng)末端 重復(fù)（LTR)序列，位于逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸5'端的啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子適于在哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中表達(dá)，gag核酸結(jié)構(gòu)域，pol核酸結(jié)構(gòu)域和env核酸結(jié)構(gòu)域；治療盒，其包含至少一 個(gè)可操作地連接至異源多核苷酸的小型啟動(dòng)子，其中所述盒位于到3'端LTR的5'端和編 碼逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜的env核酸結(jié)構(gòu)域的3'端；以及在靶細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄、包裝和整合所必需 的順式作用序列。在一實(shí)施方案中，治療盒包含至少一個(gè)可操作地連接至異源多核苷酸的 核心啟動(dòng)子或小型啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。在一實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列源自Y逆 轉(zhuǎn)錄病毒，如鼠白血病病毒（MLV)，莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV)，貓白血病病毒（FeLV)，狒 狒內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（BEV)，豬內(nèi)源性病毒（PERV)，源自貓的逆轉(zhuǎn)錄病毒RD114,松鼠猴逆 轉(zhuǎn)錄病毒，異嗜性鼠白血病病毒相關(guān)病毒（XMRV)，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒（REV)，或長(zhǎng) 臂猿白血病病毒（GALV)。在另一實(shí)施方案中，MLV是兼嗜性MLV或親嗜性MLV，具有雙嗜性 或GALV包膜基因。在又一實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒或y逆轉(zhuǎn)錄病毒。在 又一實(shí)施方案中，載體包含能夠感染哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞的小型啟動(dòng)子盒。在另一實(shí)施方案中， 靶細(xì)胞是具有異常增殖能力的細(xì)胞，例如那些與細(xì)胞增殖性病癥有關(guān)的細(xì)胞。所述細(xì)胞增 殖性病癥可以選自但不限于瘤形成和自身免疫性疾病。在一實(shí)施方案中，用于RRV基因組 轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子包括CMV啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域多核 苷酸。在一實(shí)施方案中，CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域包含連接至MLV R-U5區(qū)的來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的立 即早期啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，gag和pol多核苷酸源自致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒或Y逆轉(zhuǎn)錄 病毒。在一實(shí)施方案中，env結(jié)構(gòu)域編碼兼嗜性ENV蛋白。在任一前述的又一實(shí)施案例中， 治療盒包含至少一個(gè)小型啟動(dòng)子盒并且還可包含增強(qiáng)子，其包含表達(dá)時(shí)編碼治療性蛋白的 治療性（異源的）多核苷酸序列或治療性核酸（如siRNA，shRNA，microRNA等）。在一實(shí) 施方案中，小型啟動(dòng)子盒是RNA聚合酶II的啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，小型啟動(dòng)子盒是 RNA聚合酶III的啟動(dòng)子（例如U6啟動(dòng)子）。在一實(shí)施方案中，治療盒包含單一小型啟動(dòng) 子盒，其包含可操作地連接至治療性分子或分子編碼序列的小型啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。在另一 實(shí)施方案中，治療盒包含至少一個(gè)小型啟動(dòng)子盒和第二盒。第二盒可以是第二小型啟動(dòng)子 盒，IRES盒或polIII啟動(dòng)子盒。小型啟動(dòng)子促進(jìn)可操作地連接的基因或編碼核酸序列的 轉(zhuǎn)錄。
[0011] 小型啟動(dòng)子，正如其名稱(chēng)所指，包括對(duì)于有效轉(zhuǎn)錄和/或翻譯所必需的可操作地 連接至編碼序列的最少量元件，并且具有比核心啟動(dòng)子更好的表達(dá)。小型啟動(dòng)子可以包括 核心啟動(dòng)子，而且還包括其他促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控結(jié)構(gòu)域。小型啟動(dòng)子長(zhǎng)度為約100-600bp，而 核心啟動(dòng)子通常小于約l〇〇bp(例如約70-80bp)。治療盒包含核心啟動(dòng)子時(shí)，將存在第二 盒（例如第二小型啟動(dòng)子盒，polIII啟動(dòng)子盒或IRES盒），或者核心啟動(dòng)子將伴隨有增強(qiáng) 子。此外，核心啟動(dòng)子存在時(shí)，盒一般包含位于核心啟動(dòng)子序列上游或下游的增強(qiáng)子元件或 另一元件，其促進(jìn)可操作地連接的編碼序列的表達(dá)高于核心啟動(dòng)子單獨(dú)的表達(dá)水平。
[0012] 相應(yīng)地，本公開(kāi)提供了確定為"核心啟動(dòng)子"元件的源自任一細(xì)胞元件的較小調(diào)控 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)域（如改良的核心啟動(dòng)子）（〈100,〈200,〈400或<600bp)，其允許在靶細(xì)胞中 以顯著水平普遍表達(dá)，在一般情況下用于穩(wěn)定整合入載體，特別是復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體， 以允許轉(zhuǎn)基因的有效表達(dá)。還提供的是仍在200,400或600bp以下的核心啟動(dòng)子加上最小 增強(qiáng)子序列，以允許更好的基因表達(dá)。這種增強(qiáng)的啟動(dòng)子包括改良過(guò)的核心啟動(dòng)子，天然存 在的組織特異性啟動(dòng)子，小的病毒啟動(dòng)子，如源自勞氏肉瘤病毒的啟動(dòng)子。在其他實(shí)施方 案中，所述治療性盒包含至少一個(gè)小型啟動(dòng)子盒，其對(duì)相同基因的表達(dá)水平大于或約等于 IRES盒的表達(dá)水平，或者小于RES盒的表達(dá)水平1倍至2倍。
[0013] 所述載體可包含可操作地連接至核心啟動(dòng)子或小型啟動(dòng)子的任何數(shù)量的不同 異源多核苷酸。例如，該異源多核苷酸可包括細(xì)胞因子基因，siRNA，microRNA或RNAi 分子，靶向序列，結(jié)合結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞毒性基因，單鏈抗體或它們的任意組合。當(dāng)該異源 多核苷酸是非翻譯的RNA如siRNA，microRNA或RNAi時(shí)，則可能無(wú)需小型啟動(dòng)子，但 也可以包含在轉(zhuǎn)錄基因的組合中。在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，異源多核苷酸包含具有 如 SEQ ID N0:3(CDopt-3pt)、5(CDopt)，ll(CDopt-UPRT)、13(CDopt-linker-UPRT)、 15(CDopt3-0PRT)、17(CDopt3-linker-0PRT)或 75(HSVtkopt)所示序列的多核苷酸。在進(jìn) 一步的實(shí)施方案中，異源序列編碼包含如SEQ ID NO :4或76所示序列的多肽。在一實(shí)施方 案中，所述異源核酸是優(yōu)化的人密碼子且編碼如SEQ ID N0:4或76所示序列的多肽。
[0014] 本公開(kāi)提供了分離的多核苷酸，其從5'至3'包含：來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的立即早期 啟動(dòng)子融合至MLV R-U5區(qū)域的CMV-R-U5 ;PBS，逆轉(zhuǎn)錄酶的引物結(jié)合位點(diǎn)；5'剪接位點(diǎn)；步 包裝信號(hào)；MLV組特異性抗原的編碼序列g(shù)ag;MLV聚合酶多蛋白的編碼序列pol ;3'剪接位 點(diǎn)；MLV 4070A株系包膜蛋白的編碼序列4070A env ;至少一個(gè)可操作連接至治療性基因的 小型啟動(dòng)子盒；多嘌呤區(qū)；以及U3-R-U5MLV長(zhǎng)末端重復(fù)。在一實(shí)施方案中，3'端LTR源自 致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒或Y-逆轉(zhuǎn)錄病毒。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，3'端LTR包含U3-R-U5結(jié)構(gòu) 域。
[0015] 本公開(kāi)提供了治療受試者細(xì)胞增殖性病癥的方法，包括將受試者或細(xì)胞與本公開(kāi) 中的逆轉(zhuǎn)錄病毒接觸，其中所述的異源核酸序列編碼抑制贅生性細(xì)胞增殖的治療性蛋白。 在一實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒包含編碼具有如SEQ ID NO :4,12,14,16,18或76所示序列的 多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地連接至小型啟動(dòng)子上。
[0016] 本公開(kāi)提供了具有可操作地連接至細(xì)胞毒素基因的啟動(dòng)子盒的某些RRV序列。例 如，SEQ ID NO :19顯示了 PAC3-C1. yO)2載體，其中該載體包含gag，pol和env序列，env 序列后緊跟著啟動(dòng)子CMV核心啟動(dòng)子和具有3個(gè)熱穩(wěn)定突變的人源化胞嘧啶脫氨酶，其后 接3'LTR。SEQ ID N0:20顯示了相似的結(jié)構(gòu)，但是該盒包含S1啟動(dòng)子，其后接轉(zhuǎn)基因的人 GMCSF。SEQ ID N0:21 顯示了 RRV 載體"PACE-CD"的序列。SEQ ID N0:22 顯示了除了其啟 動(dòng)子盒包含可操作地連接到鼠GMCSF的S1啟動(dòng)子外，與SEQ ID NO : 19和20相似的序列。 SEQ ID N0:39顯示了具有Sl-yCD2盒的RRV序列。SEQ ID N0:40示出了具有C1-GFP盒的 RRV序列。SEQ ID N0:41示出了具有S1-GFP盒的RRV序列。本公開(kāi)的其他載體包括連接 至異源核酸的小型啟動(dòng)子如SEQ ID NO :77-85和86所示。
[0017] 本公開(kāi)提供了包含具有復(fù)制能力的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒（RRV)和具有小型啟動(dòng)子盒 的載體，其中該載體感染靶細(xì)胞多次，導(dǎo)致每個(gè)靶細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組平均3個(gè)或更 多個(gè)拷貝數(shù)。多個(gè)拷貝數(shù)在體內(nèi)和體外為基因遞送和蛋白生產(chǎn)提供了有用的"超級(jí)"感染。 在一實(shí)施方案中，RRV包含：逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白；逆轉(zhuǎn)錄病毒POL蛋白；逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜； 逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸，其包含位于逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列3'端的長(zhǎng)末端重復(fù)（LTR)序 列，位于逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸5'端的啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表 達(dá)，gag核酸結(jié)構(gòu)域，pol核酸結(jié)構(gòu)域和env核酸結(jié)構(gòu)域；盒，其包含至少一個(gè)可操作地連接 至異源多核苷酸的小型啟動(dòng)子或核心啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，其中所述盒被定位于3' LTR的5'端 和編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜的env核酸結(jié)構(gòu)域的3'端；在靶細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄、包裝和整合所必需 的順式作用序列，其中與PACE質(zhì)粒相比，在6次傳代后該RRV保持較高的復(fù)制能力（SEQ ID N0:21,即 Logg等（Hum Gene Ther.2001May 20 ;12(8):921-32)所述的載體）。在一實(shí)施方 案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒多核苷酸序列源自鼠白血病病毒（MLV)，莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV)， 貓白血病病毒（FeLV)，狒狒內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（BEV)，豬內(nèi)源性病毒（PERV)，源自貓的逆轉(zhuǎn) 錄病毒RD114,松鼠猴逆轉(zhuǎn)錄病毒，異嗜性鼠白血病病毒相關(guān)病毒（XMRV)，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織 增殖病病毒（REV)，或長(zhǎng)臂猿白血病病毒（GALV)。在另一實(shí)施方案中，MLV是兼嗜性MLV。 在又一實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒或Y逆轉(zhuǎn)錄病毒。在又一實(shí)施方案中， 靶細(xì)胞是具有異常細(xì)胞增殖能力的細(xì)胞，如那些與有細(xì)胞增殖性病癥（例如癌癥細(xì)胞）相 關(guān)聯(lián)的細(xì)胞。所述細(xì)胞增殖性病癥可以選自以下，但不限于：肺癌，結(jié)腸-直腸癌，乳腺癌， 前列腺癌，尿道癌，子宮癌，腦癌，頭頸癌，胰腺癌，黑素瘤，胃癌和卵巢癌，淋巴瘤，白血病， 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他自身免疫性疾病。在一實(shí)施方案中，載體可包括啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)gag、 pol和env的轉(zhuǎn)錄，例如具有如SEQ ID NO: 19, 20或22所示核苷酸1至核苷酸約582的序 列的CMV啟動(dòng)子，且可包括對(duì)一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的修飾從而能夠指導(dǎo)和起始轉(zhuǎn)錄。在又 進(jìn)一步的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含如SEQ ID NO: 19, 20或22所示核苷酸1至核苷酸約582 的序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域多核苷酸。在一實(shí)施方案 中，CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域包含連接至MLV R-U5區(qū)的來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子。在 又一實(shí)施方案中，CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域多核苷酸包含如SEQ ID勵(lì)：19,20或22所示核苷酸約1 至核苷酸約1202的序列，或者與SEQ ID NO :19, 20或22所示序列具有至少95% -致性的 序列，其中該多核苷酸促進(jìn)與其可操作地連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄。在另一實(shí)施方案中，多核 苷酸gag和pol源自致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒或y逆轉(zhuǎn)錄病毒。該gag核酸結(jié)構(gòu)域可包含SEQ ID NO : 19或22中核苷酸編號(hào)約1203至核苷酸約2819的序列，或者與其具有至少95 %、98 %、 99%或99. 8%-致性的序列。該pol結(jié)構(gòu)域可包含SEQ ID NO :19或22中核苷酸編號(hào)約 2820至核苷酸約6358的序列，或者與其具有至少95 %、98 %、99 %或99. 9 % -致性的序列。 在一實(shí)施方案中，env結(jié)構(gòu)域編碼兼嗜性env蛋白。該env結(jié)構(gòu)域可包含SEQ ID NO :19或 22中核苷酸編號(hào)約6359至核苷酸約8323的序列，或者與其具有至少95%、98%、99%或 99.8%-致性的序列。該載體的小型啟動(dòng)子可以是小于60(^口（如約60(^口，55(^口，50(^口，4 50bp, 400bp, 350bp, 300bp, 250bp, 200bp, 150bp, 100bp,約 90bp,約 80bp,約 76bp,約 74bp 或更?。┑娜魏握{(diào)控結(jié)構(gòu)域，并允許可操作地連接至編碼序列或非編碼序列的轉(zhuǎn)錄。在一 實(shí)施方案中，小型啟動(dòng)子包括SEQ ID NO :19或22中核苷酸編號(hào)約8330至核苷酸約8406 的序列，或者與其具有至少95%、98%或99%-致性的序列。在另一實(shí)施方案中，小型啟動(dòng) 子包含選自 SEQ ID NO :56,57,59,65,67,68,69,71，72,73 和 74 的序列。
[0018] 本公開(kāi)的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)內(nèi)容闡述于附圖和以下的說(shuō)明書(shū)中。其他特 征、目的和優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在說(shuō)明書(shū)和附圖及權(quán)利要求書(shū)中。
[0019] 附圖簡(jiǎn)述
[0020] 圖1顯示了核心啟動(dòng)子和各種可存在的元件的一般結(jié)構(gòu)基序（Juven-Gershon&Ka donaga, Developmental Biology 339:225 - 2292010)。通常，核心啟動(dòng)子從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 上游約-40bp延伸至翻譯起始密碼子的起始位點(diǎn)下游約40bp?？s寫(xiě)具有下列含義：BREu-上 游TFIIB識(shí)別元件；TATA- "tata盒";BREd-下游TFIIB識(shí)別元件；Inr-轉(zhuǎn)錄的起始子位 點(diǎn)；MTE-基序十元件團(tuán)；DPE-下游啟動(dòng)子元件；DCE-下游核心元件；XCPE1-X核心啟動(dòng)子元 件1。
[0021] 圖2A至圖2B顯示了含有驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因（A)GFP和⑶⑶表達(dá)的C1和S1核心啟動(dòng) 子的PAC骨架中的RRV載體的穩(wěn)定性。每列上方的數(shù)字表示感染周期數(shù)。箭頭指示預(yù)期的 片段大小。
[0022] 圖3顯示了含有驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因（人和鼠GM-CSF)表達(dá)的IRES元件或S1核心啟動(dòng)子 的PAC骨架中的RRV載體的穩(wěn)定性。每列上方的數(shù)字表示感染周期數(shù)。箭頭指示預(yù)期的片 段大小。
[0023]圖 4A 至圖 4H 顯示了⑷在 pAC3-GFP，pAC3. C1-GFP 和 pAC3. S1-GFP 載體完全感 染的人腫瘤細(xì)胞系U87,1306-MG和T98s中，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選（FACS)測(cè)量的GFP蛋 白表達(dá)。MFI-平均螢光強(qiáng)度。（B)在 pAC3-yCD2, pAC3. Cl-yCD2 和 pAC3. Sl-yCD2 載體瞬 時(shí)轉(zhuǎn)染的 293T 細(xì)胞中的蛋白表達(dá)（Western Blot 法）。（C)在 pAC3-yCD2, pAC3. Cl-yCD2 和pAC3. Sl-yCD2載體完全感染的U87細(xì)胞中的蛋白表達(dá)（Western Blot法）。（D)至（F) pAC3-hGMCSF和pAC3. Sl-hGMCSF中GM-CSF蛋白的表達(dá)：(D)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T中；(E)在完 全感染的U87中；(F)在完全感染的PC3細(xì)胞中。（G)至（H)pAC3-mGMCSF和pAC3. Sl-mGMCSF 中的GM-CSF蛋白表達(dá)：(G)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T中；(H)在完全感染的EMT6細(xì)胞中。
[0024]圖 5A 至圖 5B 顯示了 ⑷載體 pAC3-EMD，pAC3-hGMCSF 和 pAC3Sl-hGMCSF 在 U87 細(xì)胞中的病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)。（B)載體pAC3-EMD，pAC3-mGMCSF和pAC3. Sl-mGMCSF在EMT6細(xì) 胞中的病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)。
[0025] 圖6顯示在用兩個(gè)不同的來(lái)源PALA處理U87細(xì)胞后具有幾乎相同結(jié)果的細(xì)胞殺 傷曲線。
[0026] 圖7顯示了 IRES-盒，S1盒和SV40盒的GFP表達(dá)。
[0027] 圖8A至圖8B顯示了本公開(kāi)中使用的構(gòu)建體的圖。
[0028] 圖9顯示了在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（293T，左側(cè)；Hela細(xì)胞，右側(cè)）由小型啟動(dòng)子和合 成啟動(dòng)子介導(dǎo)的基因表達(dá)。
[0029] 發(fā)明詳述
[0030] 如本文和所附權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式"一個(gè)/ 一種"，"和"和"所述"包括 復(fù)數(shù)引用，除非上下文另有明確說(shuō)明。因此，例如，提及"一種細(xì)胞"時(shí)包括多個(gè)這樣的細(xì)胞， 提及"所述載體"時(shí)包括一個(gè)或多個(gè)載體等。
[0031] 此外，使用"或"表示"和/或"，除非另有說(shuō)明。同樣，"包含"，"包括"，"含有"，"具 有"，"涵蓋"和"涉及"是可互換的，并且并非意在限制。
[0032] 要進(jìn)一步理解的是，描述各種實(shí)施方案時(shí)使用術(shù)語(yǔ)"包括"，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理 解，在一些特定情況下，可使用"基本上由......組成"或"由……組成"的語(yǔ)言來(lái)替代地描 述實(shí)施方案。
[0033] 除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本公開(kāi)所屬的技術(shù)領(lǐng)域中普通 技術(shù)人員通常理解的含義具有相同的含義。雖然類(lèi)似或等同于本文所述的那些方法和材料 可以在所公開(kāi)的方法和組成的實(shí)踐中使用，示例性的方法，裝置和材料如本文所述。
[0034] 通用教材和系列期刊描述了在本文中有用的分子生物學(xué)技術(shù)，涉及載體，啟動(dòng) 子和許多其它相關(guān)主題的應(yīng)用，這包括：Methods in Molecular Biology, Series John M. Walker編，Humana 出版社，ISSN: 1064-3745 ;Methods in Enzymology, Elsevier 出版社； 公司試劑事實(shí)清單和方法支持出版物；科學(xué)網(wǎng)站，如Researchgate (www. researchgate. net)和在線實(shí)驗(yàn)室測(cè)試（例如，http://labtestonline. org/understanding/features/ methods/)和個(gè)人實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站，如 http://www. cshl. edu。
[0035] 整個(gè)文本中討論的出版物僅在其公開(kāi)內(nèi)容早于本申請(qǐng)申請(qǐng)日時(shí)被提供。本文沒(méi)有 任何內(nèi)容可被解釋為承認(rèn)本發(fā)明人由于先前公開(kāi)內(nèi)容而無(wú)權(quán)先公開(kāi)這些發(fā)明。
[0036] 本公開(kāi)提供了用于將基因或蛋白遞送至細(xì)胞或受試者的方法和組合物?？蓪⑦@樣 的方法和組合物用于治療受試者的各種疾病和病癥，包括癌癥和其它細(xì)胞增殖性疾病和病 癥。本公開(kāi)提供了用于基因遞送的逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制型載體，利用可操作地連接至待表達(dá)的 異源多核苷酸的核心啟動(dòng)子和/或小型啟動(dòng)子盒。
[0037] 大小在約1. 5kb以上時(shí)，RRV載體上轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性可能變化。將IRES盒成功克 隆至MLV后的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的常規(guī)策略（Logg等人，同上）一直使用IRES元件，以允許翻譯從 內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)開(kāi)始。該IRES組件約600bp，離編碼序列約900bp。因此，連接至IRES 盒的多核苷酸的大小受穩(wěn)定性限制。增加待表達(dá)或遞送的多核苷酸的大小的一種替代方案 是使用促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的較小調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、或其它調(diào)控結(jié)構(gòu)域。
[0038] 大多數(shù)啟動(dòng)子是相當(dāng)大的；完整功能性的通常超過(guò)600bp，啟動(dòng)子的全長(zhǎng)可以是 幾千堿基。較小啟動(dòng)子可由允許轉(zhuǎn)基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可靠表達(dá)的載體生成，如復(fù)制型 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（RRVs)等。例如，一種可能的方案是使用由Kadanaga和合作者所描述 的"核心"啟動(dòng)子（Juven-Gershon et al.，Nature Methods, 11:917-922, 2006)。這些核 心啟動(dòng)子是基于腺病毒主要晚期（AdML)和巨細(xì)胞病毒（CMV)主要立即早期基因，以及合 成的"超級(jí)核心啟動(dòng)子" SCP 1。其他細(xì)胞核心啟動(dòng)子包括但不限于，人血紅素加氧酶近端 啟動(dòng)子（121bp;Tyrrell et al.，Carcinogenesis, 14:761-765, 1993) ;CTP:磷酸膽喊胞 苷酰轉(zhuǎn)移酶（CCT)啟動(dòng)子（240bp;Zhou et al.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol. ,30:61-68,2004);人 ASK(S 期激酶活化劑，也稱(chēng)為 HsDbf4 基因，63bp;Yamada et al.J. Biol. Chem.，277:27668 - 27681，2002);以及 HSVtk 基因內(nèi)核心（Al-Shawi et al.，Mol. Cell. Biol. ,11:4207, 1991 ;Salamon et al.，Mol. Cell. Biol. ,15:5322, 1995)。此外，這些"核 心"啟動(dòng)子可以作為進(jìn)一步改良的起點(diǎn)，以提高啟動(dòng)子的活性。例如，這樣的改良，包括在 "核心"啟動(dòng)子上附加其他結(jié)構(gòu)域和序列以改善其功能（例如增強(qiáng)子、Kozak序列等）。在實(shí) 施方案中，這樣進(jìn)一步的改良可包括加入增強(qiáng)子。
[0039] 這些核心啟動(dòng)子的長(zhǎng)度大約每個(gè)70-80bp