）中進(jìn)行了評(píng)估。在感染前一天，將初始細(xì)胞以1E5細(xì)胞（U87-MG) 或5E4細(xì)胞（EMT6)接種于6孔板。在4yg/mL聚凝胺存在下，根據(jù)計(jì)算滴度（TU/mL)以 0. 1的M0I(U87-MG)或1的M0I(EMT6)進(jìn)行病毒感染。在整個(gè)感染過程中，每次傳代（對(duì) U87-MG每2天，對(duì)EMT6細(xì)胞每3-4天）接種相同數(shù)量的受感染細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)收集受 感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒上清并保存于-80°C冰柜中。處理收集的病毒上清液樣品，以獲得病 毒 RNA(Maxwell 16LEV simplyRNA Cells Kit, Promega)，隨后進(jìn)行 qRT-PCR。每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 的病毒RNA拷貝/ml的數(shù)目由包括于qRT-PCR中的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。
[0132] 圖5A和圖5B顯示了載體的生長動(dòng)力學(xué)結(jié)果，表明該載體在所有靶細(xì)胞中的增殖 具有相似于原型PAC3-EMD載體在人和小鼠細(xì)胞中的動(dòng)力學(xué)。
[0133] 早期傳代的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG在完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在感染前一 天，將初始細(xì)胞以每孔2e5細(xì)胞接種于6孔板中。在44 y g/mL凝聚胺存在下，用源自 pAC3-hGMCSF，pAC3-Sl. hGMCSF和pAC3-emd的感染病毒載體根據(jù)計(jì)算滴度（TU/毫升）以 0. 1的MOI進(jìn)行感染的第一個(gè)周期。在隨后的感染中，將受感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒上清液的十 分之一用于感染初始細(xì)胞。在每個(gè)感染周期中，在感染后d4,將受感染細(xì)胞在6孔板中進(jìn)行 傳代。在感染后d7,收集受感染細(xì)胞的病毒上清液用于后續(xù)感染，收獲細(xì)胞用于基因組提 取，通過IRES-PCR評(píng)估載體穩(wěn)定性。用于PCR的引物是：IRES-F :5' -CTGATCTTACTCTTTGGA CCTTG-3'（SEQ ID NO :54)和IRES-R :5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3'（SEQ ID NO :55)。 連續(xù)傳代的穩(wěn)定性曲線示于圖3中，表明具有S1啟動(dòng)子的載體與IRES-hGMCSF載體至少是 一樣穩(wěn)定的，而對(duì)于小鼠GMCSF，S1載體比IRES版本更穩(wěn)定。
[0134]構(gòu)建基于 pAC3 的具有驅(qū)動(dòng)人和小鼠 GM-CSF (PAC3-S1. hGMCSF 和 PAC3-S1. mGMCSF) 表達(dá)的核心啟動(dòng)子的載體，并分別與PAC3-IRES. hGMCSF和pAC3-IRES. mGMCSF進(jìn)行比較。 如前所述，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染由構(gòu)建體制備了載體制劑。測(cè)定該載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞產(chǎn)生的 hGMCSF和mGMCSF，圖4D和圖4G表明，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中觀測(cè)到這些蛋白的表達(dá)，并且由IRES 表達(dá)系統(tǒng)的載體和S1核心啟動(dòng)子系統(tǒng)的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別產(chǎn)生大約相同水平的人或小 鼠GMCSF。然而，圖4E和圖4F表明在完全感染的U87和PC3細(xì)胞中，由S1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 hGMCSF表達(dá)比IRES結(jié)構(gòu)少3倍以下。類似地，圖4H示出了對(duì)于受感染后mGMCSF的表達(dá)， S1啟動(dòng)子在小鼠EMT6細(xì)胞中不如IRES載體有效。
[0135] 實(shí)施例9 :含有C1和S1核心啟動(dòng)子基于pAC3的載體驅(qū)動(dòng)y⑶2相對(duì)于pAC3_y⑶2 的轉(zhuǎn)基因表達(dá)較差
[0136] 在293T細(xì)胞中，使用抗⑶的抗體通過免疫印跡檢測(cè)⑶表達(dá)的水平（圖4B)。轉(zhuǎn)染 前一天，初始細(xì)胞以每l〇cm板2E6細(xì)胞接種。使用編碼每個(gè)載體中病毒基因組的質(zhì)粒DNA 通過磷酸鈣法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后40小時(shí)，收獲細(xì)胞并裂解以獲得細(xì)胞裂解物。確定 細(xì)胞裂解物的蛋白濃度以使得如GAPDH所示的等量蛋白上樣。圖4B顯示的結(jié)果證明，所有 這些載體的表達(dá)，IRES系統(tǒng)產(chǎn)生比S1啟動(dòng)子構(gòu)建體更高約15倍的表達(dá)水平。此外，圖4C 顯示了在用來自pAC3-yCD2的載體（IRES載體）完全感染的U87-MG細(xì)胞中蛋白免疫印跡 ⑶蛋白的表達(dá)，但是在Cl. y⑶2和SI. y⑶2載體中未檢測(cè)到y(tǒng)⑶2的表達(dá)。
[0137] 實(shí)施例10 :在人細(xì)胞中使用pAC3-Sl. y⑶2載體體外陽性篩選以增加y⑶2表達(dá)
[0138] 陽性篩選完全感染的pAC3. SI. y⑶2載體是通過同時(shí)給予從頭合成嘧啶的抑制劑 N-(磷乙酰）-L-天冬氨酸（PALA)進(jìn)行的，這導(dǎo)致嘧啶耗盡介導(dǎo)的非感染細(xì)胞或yCD2低水 平表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞死亡。通過在培養(yǎng)物中加入胞嘧啶，通過嘧啶補(bǔ)救途徑挽救yCD2基因高 水平表達(dá)的細(xì)胞。下面描述的方法適用于在實(shí)驗(yàn)室中使用的U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤衍生的細(xì)胞 系，但同樣的程序可以用于來自不同腫瘤類型的多種不同的細(xì)胞系。在這些情況下，試劑的 實(shí)際濃度和步驟時(shí)間將由細(xì)胞的生長速率和細(xì)胞系的初始感染率來確定。這樣的調(diào)整可由 本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要來做出，并且在實(shí)施該方法的過程中來確定。此外，該優(yōu)化程序可 以使用在復(fù)制型載體中驅(qū)動(dòng)可選基因的任何啟動(dòng)子。實(shí)際試劑濃度和選擇的時(shí)間點(diǎn)的其他 改變也是可能的。
[0139] 首先確定殺死初始U87細(xì)胞所需的PALA濃度，用pAC3-y⑶2載體感染U87細(xì)胞， pAC3. Sl-y⑶2載體感染U87細(xì)胞。在前一天將細(xì)胞以3E3細(xì)胞接種于96孔板中。在細(xì)胞 接種后 24 小時(shí)，將 0? 00975,0? 039,0? 156,0? 625, 2. 5,10,40 和 160uM 的 PALA 加入到培養(yǎng) 物中，連續(xù)5天，接著通過MTS測(cè)定來確定細(xì)胞活力。圖6示出8-30uM范圍內(nèi)PALA的IC5Q。 在培養(yǎng)物中的胞嘧啶濃度范圍（0.2, l，5，10mM)也通過進(jìn)行與上述相同的實(shí)驗(yàn)來確定。這 表明，該細(xì)胞可以耐受所有測(cè)試濃度下胞嘧啶。
[0140] 對(duì)于體外陽性篩選，在前一天將初始U87細(xì)胞以le5細(xì)胞接種于6孔板中。第二 天，將細(xì)胞分別用pAC3-y⑶2載體（陽性對(duì)照）和pAC3. Sl-y⑶2載體以0. 1的MOI感染。在 感染后48小時(shí)（~20 %的感染率），將1 y M的PALA和10mM的胞嘧啶加入到含有初始U87 細(xì)胞（陰性對(duì)照），用pAC3-y⑶2載體感染的U87細(xì)胞（陽性對(duì)照）以及用pAC3. Sl-y⑶2感 染的U87細(xì)胞的培養(yǎng)物中，連續(xù)5天，在此時(shí)間點(diǎn)，收集培養(yǎng)上清液用于新一輪感染初始U87 細(xì)胞。在PALA和胞嘧啶存在下的感染周期，用增加濃度的PALA重復(fù)12輪（周期1-2: luM; 周期3-4:3. 3uM ;周期5-6:10uM，周期7-8:20uM和周期9-12:30uM))。在篩選結(jié)束時(shí)，在 30uM PALA和10mM胞嘧啶的存在下，將細(xì)胞分離并擴(kuò)增。進(jìn)行MTS測(cè)定以顯示由于陰性篩 選而細(xì)胞活力增加。篩選之前，用PAC3. SI. yCD2載體感染的細(xì)胞由于低CD表達(dá)而不能有 效地利用補(bǔ)救途徑。與此相反，用pAC3. Sl-y⑶2載體感染的細(xì)胞表現(xiàn)出與用pAC3-y⑶2載 體感染的細(xì)胞相當(dāng)?shù)母呒?xì)胞活力。
[0141] 為了證實(shí)高細(xì)胞活力是由于⑶表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)行蛋白印跡來檢測(cè)⑶的表達(dá)。收 獲細(xì)胞并裂解以獲得細(xì)胞裂解物。確定細(xì)胞裂解物的蛋白濃度以使得在免疫印跡中如由 GAPDH所示的等量蛋白上樣。數(shù)據(jù)顯示，用pAC3. S1-YC2載體感染的U87細(xì)胞的細(xì)胞提取 物的⑶表達(dá)與pAC3-y⑶2的⑶表達(dá)相當(dāng)。然后從用pAC3. Sl-y⑶2載體感染的U87細(xì)胞 中分離基因組DNA，并使用以下引物組通過PCR擴(kuò)增Sl-yCD2區(qū)域。IRES-F :5'-CTGATCTT ACTCTTTGGACCTTG-3' （SEQ ID N0:54)和 IRES-R:5'-CCCCTTTTTCTGGAGACTAAATAA-3' （SEQ ID NO :55)。將所得的PCR產(chǎn)物分離用于PCR克隆測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果顯示，S1核心啟動(dòng) 子中發(fā)生多種突變。接著，如上所述，合成含有被鑒定突變的S1啟動(dòng)子，將其DNA片段各端 的Mlu I和Not I位點(diǎn)亞克隆至pAC3骨架。所得到的具有優(yōu)化S1啟動(dòng)子的載體被命名為 pAC3. mtSl-yCD2。
[0142] 如前所述，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備感染性pAC3. mtSl-y⑶2載體。用pAC3. mtSl-y⑶2載體以0. 1的M0I感染初始U87細(xì)胞。在感染后第7天，收獲細(xì)胞并裂解以獲 得細(xì)胞裂解物。確定細(xì)胞裂解物的蛋白濃度以使得在免疫印跡中如由GAPDH所示的等量蛋 白上樣。數(shù)據(jù)表明，用pAC3. mtSl-y⑶2載體感染的U87細(xì)胞的細(xì)胞提取物的⑶表達(dá)與由 IRES驅(qū)動(dòng)的pAC3-y⑶2載體的⑶表達(dá)相當(dāng)。
[0143] 為了使⑶表達(dá)與5-FC敏感性相關(guān)，將無載體的U87細(xì)胞，具有pAC3-y⑶2載體 和pAC3. mtSl-yCD2載體的U87細(xì)胞分別以每孔le3細(xì)胞接種于96-孔板。它們?cè)谟貌煌?濃度的5-FC處理后進(jìn)行為期八天的監(jiān)測(cè)，其中在接種后第一天首次加入5-FC，然后每兩天 用加有5-FC的全培養(yǎng)基補(bǔ)充。通過MTS測(cè)定每兩天評(píng)估細(xì)胞活力。該數(shù)據(jù)表明，用pAC3. mtSl-y⑶2載體感染的U87細(xì)胞的IC50值與用pAC3-y⑶2載體感染的那些細(xì)胞（0. 5ug/mL ; Perez et al.，2012)相當(dāng)?？墒褂眠@些技術(shù)優(yōu)化其它啟動(dòng)子配置的基因表達(dá)。
[0144] 實(shí)施例11 :核心啟動(dòng)子下游整合Kozak序列增加y⑶2基因表達(dá)而不改變載體穩(wěn) 定性
[0145] 大多數(shù)真核生物的mRNA含有促進(jìn)蛋白翻譯起始的Kozak序列。核心啟動(dòng)子的下 游整合Kozak序列增加yCD2在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和完全感染的細(xì)胞中的表達(dá)。優(yōu)化的酵母CD基因 y⑶2在編碼區(qū)的前15個(gè)氨基酸內(nèi)具有3個(gè)框中的ATG。5' UTR上的間距和y⑶2mRNA的起 始密碼子側(cè)翼缺乏Kozak序列被認(rèn)為對(duì)于高效的蛋白翻譯起始是不夠理想的。整合Kozak 序列和/或其他翻譯增強(qiáng)子元件可大大提高翻譯起始，從而生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的蛋白。
[0146] pAC3. Sl-y⑶2載體含有的核心啟動(dòng)子不含Kozak序列。雖然核心啟動(dòng)子已經(jīng)被證 明對(duì)轉(zhuǎn)錄有用，高效的蛋白翻譯對(duì)基因表達(dá)同樣重要。對(duì)于改進(jìn)的核心啟動(dòng)子或其他改進(jìn) 的小型啟動(dòng)子，這種改進(jìn)可以與本說明書中的其他相結(jié)合。
[0147] pAC3-kozakSl. yCD2 (即為 pAC3. SlK-yCD2)和 pAC3. kozakS2-yCD2 (即為 pAC3. S2K-y⑶2)源自pAC3-y⑶2的骨架。該pAC3骨架由核酸內(nèi)切酶消化pAC3-y⑶2質(zhì)粒DNA的 Mlu I和Not I分離。kozakSlyCD2和kozakS2yCd2的DNA序列用存在于該DNA片段各端 的Mlu I和Not I限制性酶位點(diǎn)合成，隨后克隆至pAC3骨架的相應(yīng)位點(diǎn)。
[0148] 如前所述，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備感染性載體。以0. 1的M0I載體感染初始 U87細(xì)胞。在感染后第7天，將細(xì)胞收獲并裂解以獲得細(xì)胞裂解物。確定細(xì)胞裂解物的蛋白 濃度以使得在免疫印跡中如GAPDH所示的等量蛋白上樣。圖4B顯示了用pAC3. SIK-y⑶2載 體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T的細(xì)胞提取物的CD表達(dá)比pAC3. Sl-yCD2載體更高大約2-5倍。同樣 地，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中，pAC3. S2K-yCD2的CD表達(dá)比pAC3-S2-yCD2載體更高大約2-5 倍。此外，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中，pAC3-SlK-yCD2和pAC3-S2K-yCD2之間的CD表達(dá)相 當(dāng)。相反地，圖4C示出用四個(gè)載體中的任何一個(gè)最大感染的U87細(xì)胞都檢測(cè)不到CD表達(dá)。
[0149] 數(shù)據(jù)表明，用pAC3-k〇zakSl. yC2載體感染的U87細(xì)胞的細(xì)胞提取物的CD表達(dá)比 PAC3-S1. yCD2載體更高大約2-5倍。
[0150] 為了使⑶表達(dá)與5-FC敏感性相關(guān)，將無載體的U87細(xì)胞，具有pAC3-y⑶2載體 和pAC3-k 〇zakSl. y⑶2載體的U87細(xì)胞分別以每孔1E3細(xì)胞接種于96孔板。它們?cè)谟貌?同濃度的5-FC處理后進(jìn)行為期八天的監(jiān)測(cè)，其中在接種后第一天首次加入5-FC，然后每 兩天用加有5-FC的全培養(yǎng)基補(bǔ)充。通過MTS測(cè)定每兩天評(píng)估細(xì)胞活力。該數(shù)據(jù)表明，用 pAC3-kozakSl. yCD2載體感染的U87細(xì)胞的IC50值比用pAC3-Sl. yCD2載體感染的那些細(xì) 胞更高大約5倍，且在pAC3-yCD2載體的10倍以內(nèi)（0? 5ug/mL ;Perez et al.，2012)。
[0151] 對(duì)于載體穩(wěn)定性，在感染前一天，將初始U87細(xì)胞以每孔2E5細(xì)胞接種于6孔板。 在4yg/mL的聚凝胺存在下，根據(jù)計(jì)算滴度（TU/mL)以0. 1的M0I進(jìn)行感染的第一個(gè)周期。 在隨后的感染，將受感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒上清液的十分之一用于感染初始細(xì)胞。在每個(gè)感 染周期中，在感染后d4,將受感染細(xì)胞于6孔板中傳代。在感染后d7,收集受感染細(xì)胞的病 毒上清液用于后續(xù)感染，收獲細(xì)胞用于基因組提取，并通過IRES-PCR評(píng)估載體穩(wěn)定性。用 于 PCR 的引物是：IRES-F :5' -CTGATCTTACTCITTGGACCTTG-3'（SEQ ID NO :54)和 IRES-R : 5'-CCCCTmTCTGGAGACTAAATAA-3'（SEQ ID N0:55)。數(shù)據(jù)表明，pAC3.kozakSl-yCD2 載體 的穩(wěn)定性與pAC3-yCD2和pAC3. Sl-yCD2載體相當(dāng)。
[0152] 實(shí)施例12 :含有驅(qū)動(dòng)y⑶2-UPRT的優(yōu)化S1核心啟動(dòng)子的基于pAC3載體的構(gòu)建和 配置
[0153] y⑶2-UPRT為~1.2kB。該mtSl啟動(dòng)子=優(yōu)化的S1啟動(dòng)子（參見實(shí)施例11)。 pAC3-mtS 1. y⑶2-UPRT載體源自pAC3-y⑶2的骨架。pAC3骨架由核酸內(nèi)切酶消化pAC3-y⑶2 質(zhì)粒DNA的MluI和Not I分離。mtSl. yCD2-UPRT的DNA序列用存在于該DNA片段各端的 MluI和Not I限制酶位點(diǎn)合成，隨后克隆至pAC3骨架的相應(yīng)位點(diǎn)。
[0154] 實(shí)施例13 :含有驅(qū)動(dòng)y⑶2-UPRT表達(dá)的優(yōu)化S1核心啟動(dòng)子的基于pAC3的載體的 載體穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)基因表達(dá)
[0155] 使用如上所述的技術(shù)來構(gòu)建具有驅(qū)動(dòng)y⑶2-UPRT表達(dá)的優(yōu)化核心啟 動(dòng)子的基于PAC3的載體，并與pAC3-yCD2-U (又名150003，？6代26七&1.，]?〇1. Ther.，2012, W02010045002)相比較，所述 pAC3-yCD2-U 是使用內(nèi)部 IRES 驅(qū)動(dòng) yCD2-UPRT 融 合基因表達(dá)的等效載體。
[0156] 通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備感染性pAC3-mtSl. yCD2-UPRT載體。pAC3kozakSl. yCD2載體以0. 1的M0I感染初始U87細(xì)胞。在感染后第7天，收獲細(xì)胞并裂解以獲得細(xì)胞 裂解物。確定細(xì)胞裂解物的蛋白濃度以使得在免疫印跡中如由GAPDH所示的等量蛋白上 樣。數(shù)據(jù)表明，用pAC3-mtSl. y⑶2-UPRT載體感染的U87細(xì)胞的細(xì)胞提取物的⑶-UPRT表 達(dá)（~44KDa)與pAC3-yCD2-U和pAC3-yCD2載體相當(dāng)。
[0157] 為了使⑶表達(dá)與5-FC敏感性相關(guān)，將無載體的U87細(xì)胞，具有pAC3_y⑶2、 pAC3-y⑶2-U和pAC3-mtSl. y⑶2-UPRT載體的U87細(xì)胞分別以每孔1E3細(xì)胞接種于96孔 板。它們?cè)谟貌煌瑵舛鹊?-FC處理后進(jìn)行為期八天的監(jiān)測(cè)，其中在接種后第一天首次加入 5-FC，然后每兩天用加有5-FC的全培養(yǎng)基補(bǔ)充。通過MTS測(cè)定每兩天評(píng)估細(xì)胞活力。該數(shù) 據(jù)表明，用pAC3-mtSl. y⑶2-UPRT載體感染的U87細(xì)胞的IC50值至少等同于用pAC3-y⑶2 和pAC3-y⑶2-U載體感染的那些細(xì)胞。
[0158] 對(duì)于載體穩(wěn)定性，在感染前一天，將初始U87細(xì)胞以每孔2E5細(xì)胞接種于6孔板。 在4yg/mL的聚凝胺存在下，根據(jù)計(jì)算滴度（TU/mL)以0. 1的M0I進(jìn)行感染的第一個(gè)周期。 在隨后的感染中，將受感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒上清液的十分之一用于感染初始細(xì)胞。在每個(gè) 感染周期中，在感染后d4,將受感染細(xì)胞于6孔板中傳代。在感染后d7,收集受感染細(xì)胞 的病毒上清液用于后續(xù)感染，收獲細(xì)胞用于基因組提取并通過IRES-PCR評(píng)估載體穩(wěn)定性。 用于 PCR 的引物是：IRES-F :5' -CTGATCTTACTCITTGGACCTTG-3'（SEQ ID NO :56)和 IRES-R : 5'-CCCCTmTCTGGAGACTAAATAA-3'（SEQ ID N0:57)。數(shù)據(jù)表明，pAC3-Sl.yCD2-UPRT 載體 穩(wěn)定性顯著優(yōu)于IRES驅(qū)動(dòng)的pAC3-y⑶2-U載體。
[0159] 實(shí)施例14 :含有驅(qū)動(dòng)y⑶2表達(dá)和驅(qū)動(dòng)抗TGFb2的shRNA的人U6 (Pol III)啟動(dòng) 子的優(yōu)化S1核心啟動(dòng)子的基于pAC3的載體的構(gòu)建和配置
[0160] pAC3-Sl. yCD2-polIII啟動(dòng)子-shRNATGFb2載體源自pAC3-yCD2的骨架。該pAC3 骨架由核酸內(nèi)切酶消化pAC3-y⑶2質(zhì)粒DNA的Mlu I和Not I分離。mtSl.y⑶2和polIII 啟動(dòng)子-shRNATGFb2的DNA序列用該DNA片段各端的Mlu I和Not I限制性酶位點(diǎn)合成， 隨后克隆至PAC3骨架的相應(yīng)位點(diǎn)。
[0161] 實(shí)施例15 :含有驅(qū)動(dòng)y⑶2表達(dá)和人U6(Pol III)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗TGFb2的shRNA表 達(dá)的優(yōu)化S1核心啟動(dòng)子的基于pAC3的載體的載體穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)基因表達(dá)
[0162] 如前所述，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備感染性pAC3-Sl. y⑶2-polIII啟動(dòng) 子-shRNATGFb2載體。用pAC3-kozakSl. yCD2載體以0. 1的M0I感染初始U87細(xì)胞。在感 染后第7天，收獲一部分細(xì)胞并裂解以獲得細(xì)胞裂解物，并收獲了一部分細(xì)胞用于總RNA提 取。確定細(xì)胞裂解物的蛋白濃度以使得在免疫印跡中如由GAPDH所示的等量蛋白上樣。數(shù) 據(jù)表明，用PAC3-S1. y⑶2-polIII啟動(dòng)子-shRNATGFb2載體感染的U87細(xì)胞的細(xì)胞提取物 的y⑶2表達(dá)與pAC3-y⑶2和pAC3-mtSl. y⑶2載體的y⑶2表達(dá)相當(dāng)。
[0163] 為了使⑶表達(dá)與5-FC敏感性相關(guān)，將無載體的U87細(xì)胞，具有pAC3_y⑶2、 pAC3-mtSl. yCD2 和 pAC3-Sl. yCD2-polIII 啟動(dòng)子-shRNATGFb2 載體的 U87 細(xì)胞分別以每 孔1E3細(xì)胞接種于在96孔板。它們?cè)谟貌煌瑵舛鹊?-FC處理后進(jìn)行為期八天的監(jiān)測(cè)，其 中在接種后第一天首次加入5-FC，然后每兩天用加有5-FC的培養(yǎng)基補(bǔ)充。通過MTS測(cè)定每 兩天評(píng)估細(xì)胞活力。該數(shù)據(jù)表明，用PAC3-S1. y⑶2-polIII啟動(dòng)子-shRNATGFb2載體感染 的U87細(xì)胞的IC50值與用pAC3-y⑶2和pAC3-mtSl. y⑶2載體感染的那些細(xì)胞相當(dāng)。
[0164] 為了證明在用pAC3-Sl. yCD2-polIII啟動(dòng)子-shRNATGFb2載體感染的U87細(xì)胞中 TGFb2被有效敲除，如上所述，在感染后d7,從收獲的細(xì)胞中提取總RNA。為了標(biāo)準(zhǔn)化，使用 RNA polIII啟動(dòng)子作為內(nèi)參，通過qRT-PCR測(cè)量TGFb2的基因表達(dá)。使用AAC(t)法計(jì) 算TGFb2相對(duì)于初始U87細(xì)胞的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)顯示，在感染后d7，TGFb2下調(diào)超過70%。 培養(yǎng)受感染細(xì)胞至30天，并觀測(cè)TFGb2的持續(xù)敲除。
[0165] 對(duì)于載體穩(wěn)定性，在感染前一天，將初始U87細(xì)胞以每孔2E5細(xì)胞接種于6孔板。 在4yg/mL的聚凝胺存在下，根據(jù)計(jì)算滴度（TU/mL)以0. 1的M0I進(jìn)行感染的第一個(gè)周期。 在隨后的感染中，將受感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒上清液的十分之一用于感染初始細(xì)胞。在每個(gè) 感染周期中，在感染后d4,將受感染細(xì)胞于6孔板中傳代。在感染后d7,收集受感染細(xì)胞 的病毒上清液用于后續(xù)感染，收獲細(xì)胞用于基因組提取并通過IRES-PCR評(píng)估載體穩(wěn)定性。 用于 PCR 的引物是：IRES-F :5' -CTGATCTTACTCITTGGACCTTG-3'（SEQ ID NO :54)和 IRES-R : 5'-CCCCTmTCTGGAGACTAAATAA-3'（SEQ ID N0:55)。數(shù)據(jù)表明，pAC3-mtSl.yCD2-polIII 啟動(dòng)子_shRNATGFb2載體的穩(wěn)定性與pAC3-yCD2和pAC3-mtSl. yCD2載體相當(dāng)。
[0166] 實(shí)施例16 :含有驅(qū)動(dòng)y⑶2表達(dá)的優(yōu)化S1核心啟動(dòng)子和驅(qū)動(dòng)tko的優(yōu)化S1核心 啟動(dòng)子的基于PAC3的載體的構(gòu)建和配置。
[0167] 優(yōu)化胸苷激酶tko由于其較高的載體穩(wěn)定性被用于本實(shí)施例中。該pAC3_mtSl. y⑶2-mtSl. tko載體源自PAC3-y⑶2的骨架。該pAC3骨架由核酸內(nèi)切酶消化pAC3-y⑶2質(zhì) 粒DNA的MluI和Not I分離，用存在于該DNA各端的MluI和Not I限制酶合成mtSl. y⑶2-mtSl. tko的DNA序列，隨后克隆至pAC3骨架的相應(yīng)位點(diǎn)。
[0168] 實(shí)施例17 :含有驅(qū)動(dòng)y⑶2表達(dá)的優(yōu)化S1核心啟動(dòng)子和驅(qū)動(dòng)tko的優(yōu)化S1核心 啟動(dòng)子的基于PAC3的載體的載體穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)基因表達(dá)
[0169] 如前所述，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備感染性pAC3-mtSl. y⑶2-mtSl. tko載體。 用pAC3-k〇zakSl. y⑶2載體以0. 1的M0I感染初始U87細(xì)胞。在感染后第7天，收獲細(xì)胞 并裂解以獲得細(xì)胞裂解物。確定細(xì)胞裂解物的蛋白濃度以使得在免疫印跡如由GAPDH所示 的等量蛋白上樣。數(shù)據(jù)表明，用pAC3-mtSl. y⑶2-mtSl. tko載體感染的U87細(xì)胞的細(xì)胞提 取物的y⑶2和TK表達(dá)與由IRES介導(dǎo)的pAC3-y⑶2和pAC3-tko載體的那些細(xì)胞的表達(dá)相 當(dāng)。
[0170] 為了使⑶表達(dá)與5-FC敏感性相關(guān)，將無載體的U87細(xì)胞，具有pAC3-y⑶2和 PAC3-mtSl. y⑶2-mtSl. tko載體的U87細(xì)胞分別以每孔1E3細(xì)胞接種于96孔板。它們用不 同濃度的5-FC處理后進(jìn)行為期八天的監(jiān)測(cè)，在接種后第一天首次加入5-FC，然后每兩天用 加有5-FC的培養(yǎng)基補(bǔ)充。通過MTS測(cè)定每兩天評(píng)估細(xì)胞活力。該數(shù)據(jù)表明，用PAC3-mtSl. y⑶2-mtSl. tko載體感染的U87細(xì)胞的IC50值與用pAC3-y⑶2載體感染的那些細(xì)胞相當(dāng)。
[0171] 為了使tko表達(dá)與更昔洛韋（ganciclovir)的敏感性相關(guān)，將無載體的U87細(xì)胞， 具有pAC3-y⑶2和PAC3-mtSl. y⑶2-mtSl. tko載體的U87細(xì)胞分別以每孔1E3細(xì)胞接種 于96孔板。它們?cè)谟貌煌瑵舛鹊母袈屙f處理后進(jìn)行為期八天的監(jiān)測(cè)，在接種后第一天首 次加入更昔洛韋，然后每兩天用加有更昔洛韋的培養(yǎng)基補(bǔ)充。通過MTS測(cè)定每兩天評(píng)估細(xì) 胞活力。該數(shù)據(jù)表明，用PAC3-mtSl. y⑶2-mtSl. tko載體感染的U87細(xì)胞的IC50值與用 pAC3-tko載體感染的那些細(xì)胞相當(dāng)。
[0172] 對(duì)于載體穩(wěn)定性，在感染前一天，將初始U87細(xì)胞以每孔2E5細(xì)胞接種于6孔板。 在4yg/mL的聚凝胺存在下，根據(jù)計(jì)算滴度（TU/mL)以0. 1的M0I進(jìn)行感染的第一個(gè)周期。 在隨后的感染中，將受感染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒上清液的十分之一用于感染初始細(xì)胞。在每個(gè) 感染周期中，在感染后d4,將受感染細(xì)胞于6孔板中傳代。在感染后d7,收集受感染細(xì)胞 的病毒上清液用于后續(xù)感染，收獲細(xì)胞用于基因組提取并通過IRES-PCR評(píng)估載體穩(wěn)定性。 用于 PCR 的引物是：IRES-F :5' -CTGATCTTACTCITTGGACCTTG-3'（SEQ ID NO :54)和 IRES-R : 5'-CCCCTmTCTGGAGACTAAATAA-3'（SEQ ID N0:55)。數(shù)據(jù)表明，pAC3-mtSl.yCD2-mtSl.tko 載體的穩(wěn)定性與pAC3-y⑶2載體相當(dāng)，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于pAC3-tko載體。
[0173] 實(shí)施例18 :含有驅(qū)動(dòng)y⑶2基因表達(dá)的