，從而為轉(zhuǎn)基因序列留下大約1. 4kb的 大小。使用這些啟動子可提供有利于諸如HSVtk基因的基因表達，其長度大于1. lkb。然而， 對于獲得同等或者優(yōu)于IRES驅(qū)動表達載體的表達水平，這樣的啟動子并不總是可靠的。此 外，表達水平在不同細胞中存在變化，并且在一些情況下檢測不到轉(zhuǎn)基因的表達水平。這兩 種源自CMV和腺病毒的核心啟動子甚至不如合成的SCP1啟動子可靠。
[0040]如本文所述，核心啟動子（Juven - Gershon et al.，Nat. Methods, 2006 ; Juven-Gershon and Kadonaga Dev. Biol. 339:225-229, 2010)的使用，雖然不如 IRES 啟動 子高效，卻允許更長基因的表達，這具有治療益處。此外，使用合理設(shè)計技術(shù)，可將不同的啟 動子組件用于優(yōu)化RRV的表達和穩(wěn)定性。這些優(yōu)化的核心啟動子提供了病毒多核苷酸的更 有效表達和穩(wěn)定性。例如，"設(shè)計者"啟動子可包括已被進一步改良以包括適于穩(wěn)定和表達 的一種或多種附加元件的核心啟動子。
[0041] 如本文中所述，這些核心啟動子單獨使用或包括用于表達的其他元件使用，可在 包括具有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的各種載體中應(yīng)用。本公開提供了包含位于env編碼 序列的3'端和3' LTR的5'端的治療盒的RRV。"治療盒"是指在RRV內(nèi)包含至少一種小型 啟動子盒或核心啟動子盒和一種附加盒（例如IRES，polIII或小型啟動子盒）的結(jié)構(gòu)域， 其中治療性多核苷酸序列表達時編碼治療性蛋白質(zhì)（例如胞嘧啶脫氨酶，胸苷激酶等）或 治療性核酸（例如siRNA，shRNA，microRNA等）。因此，"治療性盒"可包含單一的小型啟動 子盒，其包含可操作地連接至治療性分子的編碼序列的小型啟動子，或者可包含至少一個 小型啟動子盒和第二盒。所述第二盒可以是第二小型啟動子盒，核心啟動子盒，IRES盒或 polIII啟動子盒。
[0042] 如本文所使用，"核心啟動子"指的是最小啟動子，其包含約50-100bp并且缺乏增 強子元件。這樣的核心啟動子包括但不限于，SCPl、AdML和CMV核心啟動子。更具體地，當(dāng) 核心啟動子盒存在時，第二盒（例如第二小型啟動子盒，polIII啟動子盒或IRES盒）也將 存在。在一些實施方案中，包括具有核心啟動子的盒的載體，特別排除使用SCPl、AdML和 CMV核心啟動子，而利用如本文和以下進一步描述的設(shè)計者核心啟動子。
[0043] 核心啟動子包括某些病毒啟動子。如本文中所使用的病毒啟動子是具有核心序 列且通常具有一些其他附屬元件的啟動子。例如，SV40早期啟動子包含三種類型的元件： TATA盒，起始位點和GC重復(fù)（Barrera-Saldana et al.，EMB0 J, 4:3839-3849, 1985 ;Yaniv ，Virology, 384:369 - 374, 2009)。該TATA盒位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游約20堿基對。GC重復(fù) 區(qū)是含有6個GC框的21堿基對重復(fù)，并且是決定轉(zhuǎn)錄方向的位點。這個核心啟動子序列約 100bp。增加額外的72堿基對重復(fù)，從而使其成為"小型啟動子"，作為轉(zhuǎn)錄增強子以約10 的因子增加該啟動子的功能性是有用的。當(dāng)SP1蛋白與21bp重復(fù)相互作用時，它結(jié)合在第 一或最后的三個GC框。前三個結(jié)合啟動早期表達，而最后三個結(jié)合啟動較晚的表達。72bp 重復(fù)的功能是增強穩(wěn)定的RNA量，并提高合成的速率。這是通過與API (激活劑蛋白1)結(jié) 合（二聚）以產(chǎn)生3'聚腺苷酸化和5'加帽的初級轉(zhuǎn)錄物而完成的。其它病毒啟動子，如 勞氏肉瘤病毒（RSV)，HBV X基因啟動子和皰瘆胸苷激酶核心啟動子也可被用作所期望選擇 功能的基礎(chǔ)。
[0044] 核心啟動子通常包括相對于+1轉(zhuǎn)錄起始位點-40至+40 (Juven-Gershon and Kadonaga, Dev. Biol. 339:225 - 229, 2010)，其限定了 RNA聚合酶II機制啟動轉(zhuǎn)錄的位置。 通常，RNA聚合酶II與許多在啟動子中結(jié)合至DNA基序的轉(zhuǎn)錄因子相互作用。這些因子 通常被稱為"通用"或"基礎(chǔ)"轉(zhuǎn)錄因子，包括但不限于TFIIA(RNA聚合酶IIA轉(zhuǎn)錄因子）， TFIIB，TFIID，TFIIE，TFIID和TFIIH。這些因子以"通用"方式與所有核心啟動子作用；因 此，它們通常被稱為"基礎(chǔ)"轉(zhuǎn)錄因子。
[0045] Juven-Gershon等（2006同上）描述了核心啟動子的元件。例如，PRC/CMV核心啟 動子由TATA盒組成，長度為81bp ;CMV核心啟動子由TATA盒和起始子位點組成；而SCP合 成核心啟動子（SCP1和SCP2)由TATA盒，Inr (起始子），MTE位點（基序十元件）和DPE 位點（下游啟動子元件）組成，長度為約81bp。SCP合成啟動子與簡單的pRC/CMV核心啟 動子相比有更好的表達。
[0046] 如本文使用的"小型啟動子"或"小啟動子"指的是促進可操作連接的基因或編碼 核酸序列的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控結(jié)構(gòu)域。小型啟動子，正如其名稱所暗示的，包括對于可操作地連接 的編碼序列的有效轉(zhuǎn)錄和/或翻譯所必需的最小量元件。小型啟動子可包含"核心啟動子" 與額外的調(diào)控元件或"改良的核心啟動子"的組合。通常，小型啟動子或改良的核心啟動子 長度約為100-600bp，而核心啟動子通常小于約100bp (例如，約70-80bp)。在其他實施方案 中，當(dāng)核心啟動子存在時，該盒通常包含在核心啟動子序列上游或下游的增強子元件或另 一元件，其有利于上述可操作連接的編碼序列的表達高于單獨的核心啟動子的表達水平。
[0047] 因此，本公開提供了源自細胞元件的小型啟動子（例如改良的核心啟動子），確定 為允許在靶細胞中以顯著水平廣泛表達的"核心啟動子"元件（<100〈200〈400或<600bp)， 并且通常對于穩(wěn)定并入載體是有用的，特別是復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，允許轉(zhuǎn)基因的有效 表達。還提供了包括核心啟動子加上最小的增強子序列和/或Kozak序列的小型啟動子， 與仍少于200、400或600bp的缺乏這些序列的核心啟動子相比允許更好的基因表達。此 類小型啟動子包括改良的核心啟動子和天然存在的組織特異性啟動子，如彈性蛋白啟動子 (對胰腺腺泡細胞特異的，204bp;Hammer et al.，Mol Cell Biol. ,7:2956-2967, 1987)和 來自小鼠和人的細胞周期依賴性ASK基因的啟動子（63_380bp;Yamada et al.，J.Biol. Chem.，277:27668 - 27681，2002)。廣泛表達的小啟動子還包括病毒啟動子如SV40早期和 晚期啟動子（約340bp)，RSV LTR啟動子（約270bp)和HBV X基因啟動子（約180bp)(如， R Anish et al.，PLoS 0116,4:5103,2009)，其沒有典型的"1六11^六盒"，并具有13匕口的核心 序列5'-CCCCGTTGCCCGG-3'（SEQ ID N0:42)。在其它實施方案中，包含至少一個小型啟動 子盒的治療盒具有的表達水平超過，約等于，或約1倍至2. 5倍低于RRV中存在IRES盒時 的表達水平
[0048] 核心啟動子或小型啟動子的轉(zhuǎn)錄通過各種元件的相互作用發(fā)生。在集中型轉(zhuǎn)錄 中，例如，在數(shù)個核苷酸的狹窄區(qū)域內(nèi)存在單一的主要轉(zhuǎn)錄起始位點或者幾個起始位點。集 中型轉(zhuǎn)錄是簡單生物體中轉(zhuǎn)錄的主要模式。在分散型轉(zhuǎn)錄中，在約50至100核苷酸的大區(qū) 域內(nèi)存在幾個弱的轉(zhuǎn)錄起始位點。分散型轉(zhuǎn)錄是脊椎動物中最常見的方式。例如，在約三 分之二的人基因中觀察到分散轉(zhuǎn)錄。在脊椎動物中，集中型轉(zhuǎn)錄往往與調(diào)控啟動子相關(guān)，而 分散型轉(zhuǎn)錄通常在CpG島的組成型啟動子中觀察到。
[0049] 表1列舉和描述了一些可插入至集中型或分散型啟動子元件的核心啟動子序列 中的核心啟動子元件。如前所述，在本公開的組合物中所使用的小型啟動子可包括被進一 步改良的核心啟動子。這樣的改良可包括并入如表1所列的一個或多個附加元件。
[0050] 表1 :可作為集中型核心啟動子（幾乎總具有"TATA盒和單一的轉(zhuǎn)錄起始位點 (TSS))，或無TATA盒的分散型啟動子，通常具有DPE元件（參見R. Dickstein，Trasncript ion, 2(5) :201_206, 2011 ;Juven_Gershon et al.，Nat. Methods, 2006，如上）的結(jié)合位點。 核苷酸符號遵循國際公約（萬維網(wǎng)：chem. qmul. ac. uk/iubmb/misc/naseq. html)。
[0052] 表2列出可用于構(gòu)建和克隆增強子元件至核心啟動子區(qū)的寡核苷酸。如上所述， 本公開的改良/優(yōu)化的核心啟動子可包括加入表1中元件的核心序列，并且還可進一步包 括不于表2中的克隆的增強子。在這樣做時，核心啟動子的大小增加，并且可以被描述為 "小型啟動子"。然而，最終的小型啟動不應(yīng)超過600bp，且通常為約1 OObp，200bp，300bp， 400bp，500bp和其間的任何整數(shù)。
[0053] 表2.用于構(gòu)建增強子區(qū)段的寡核苷酸
[0054]
[0055] AP-1，激活蛋白-1 ;NF-kB，核因子kB;CRE，cAMP應(yīng)答元件。
[0056] 此外，大多數(shù)真核mRNA包含被稱為Kozak序列的短的識別序列（RCCM￡G (SEQ ID NO :51))，其中ATG是翻譯起始位點。Kozak序列的存在可極大促進mRNA在翻譯機制中結(jié)合 至核糖體。為了提高基因表達水平，將Kozak序列并入核心啟動子的下游是有利的。雖然核 心啟動子已證明在轉(zhuǎn)錄中有用，高效蛋白翻譯對基因表達同樣同樣重要。因此，在一實施方 案中，小型啟動子包括調(diào)控元件（例如Kozak序列），其可提高轉(zhuǎn)錄本mRNA的翻譯。其它能 有效促進翻譯的"Kozak-樣"序列是本領(lǐng)域已知的。例如，源自煙草花葉病毒mRNA的5'-UTR 和源自龍蝦原肌球蛋白基因的序列，能夠在真核細胞中發(fā)揮功能以增強蛋白翻譯（Gallei et al.，1989, Gallei et al.，1992 以及 Gallei et al.，2002 ;Sano et al.，2002)。這些 序列的長度在7至68核苷酸之間變化（參見，如表3)。
[0057] 表3:編碼基因5'端UTR中存在的已知翻譯增強子
[0058]
[0059] 具體地，已表明在ATG起始密碼子上游緊接的5' UTR影響翻譯起始的水平。因此， 在一實施方案中，小型啟動子包括可提高轉(zhuǎn)錄本mRNA翻譯的調(diào)控元件（如Kozak序列。此 外，對待表達和待翻譯序列（即該小型啟動子可操作連接的序列）的分析可為更好表達的 有用改良提供見解。例如，熱穩(wěn)定的人源化酵母胞嘧啶脫氨酶（yCD2)編碼序列（參見，如 SEQ ID NO :3)在編碼區(qū)的前15個氨基酸內(nèi)具有3個框中ATG。y⑶2mRNA中5' UTR與缺失 Kozak序列側(cè)翼的起始密碼子的間距對于高效蛋白翻譯起始是次優(yōu)的。因此，Kozak序列和 /或其他翻譯增強子元件的并入可極大提高翻譯起始水平，從而生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因蛋白。
[0060] 如上所述，小型啟動子可包括優(yōu)化或改良的核心啟動子，其包括促進可操作連接 的編碼序列表達的一個或多個附加元件。選擇這些元件的功能混合物的一種方法是簡單 合成不同元件或這些元件的變體，將它們連接在一起，并功能性選擇能夠在所期望情況下 表達的小型啟動子。Juven-Gershon等描述了可用于測定可操作連接基因的表達水平的測 定法（例如，使用熒光素酶報告構(gòu)建體等）。使用這些技術(shù)，與結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子AP-1，核因子 kB(NF-kB)，CArG結(jié)合因子A(CBF-A)和核因子Y(NF-Y)(見表2)相組合，可獲得與細胞 核心啟動子（如來自血紅素加氧酶核心）相組合的功能性增強子（Ogawa et al.，Biotec hniques，42:628-633, 2007)，以產(chǎn)生總大小約為165bp的整體活性啟動子。然而，可使用 其他核心啟動子如SCP1核心，如本文所述優(yōu)化的核心序列，TK基因內(nèi)核心（Al-shawi et al.，Mol. Cell. Biol. ,11:4207, 1991 ;Salamon et al.，Mol. Cell. Biol. ,15:53221995);或 人ASK基因核心（Yamada et al.)?？蓪⒉煌钠渌蛴米麝栃赃x擇標(biāo)記。這些包括： 二氫葉酸還原酶 〇HFR;Simonsen et al.，Nuc Acid Res. ,16:2235-2246, 1988)，具有甲氨 蝶呤連同核苷酸轉(zhuǎn)運抑制劑，如雙喃達莫（dipyridamole) (Warlick et al.，Biochemical Pharmacology, 59:141 - 151，2000)或磷酸化硝基節(jié)疏基嗓呤核苷（nitrobenzyl mercaptopurine riboside phosphate) (Allayet al. , Stem Cells, 16(supp1 1):223-233, 1998));胞嘧啶脫氨酶，使用N-膦乙酰基-L-天冬氨酸（PALA)來阻斷從頭 合成尿嘧啶及同化下游堿基和胞嘧啶，以通過嘧啶補救途徑來供應(yīng)這些（Wahl et al.，J. Biol. Chem.，254:8679 ;Unger et al.，Can. Gene Ther.，14:30-38);以及本領(lǐng)域技術(shù)人員 所熟知的其他各種選擇標(biāo)記。通常，選擇性標(biāo)記的高水平表達是更好表達的指示。
[0061] 此外，改良或優(yōu)化的啟動子可通過"直接進化"，易錯PCR等獲得。例如，通過使用 如上述的諸如DHFR的可選擇系統(tǒng)和CD選擇方案，多輪表達和篩選可提供用于在小型啟動 子（如核心啟動子或改良的核心啟動子）中引入錯誤和選擇陽性表達譜。在另一實施方案 中，通過在RRV中包括代謝選擇性基因并由多輪復(fù)制和篩選傳代RRV，可選擇使用小型啟動 子不足以表達的轉(zhuǎn)基因用于在RRV背景中增加表達。病毒逆轉(zhuǎn)錄酶相對高的錯誤率允許突 變和有益突變的并入，然后選擇并成為主導(dǎo)序列。這樣改良的小型啟動子可被擴增、克隆并 用作更有效的小型啟動子。有利的是，對于使用RRV作為抗癌劑，篩選可在所期望細胞類型 的腫瘤細胞系中進行，如結(jié)腸癌，腦癌，肺癌，乳腺癌或前列腺癌。例如，在選擇劑的存在下， 由推定最小啟動子驅(qū)動編碼可選擇標(biāo)記的RRV的連續(xù)傳代，導(dǎo)致選擇最佳表達的最小啟動 子。如果存在具有特定組合的組織特異性組織，可使用在推薦靶類型的腫瘤細胞系中傳代 RRV。在一實施方案中，小型啟動子作為單一的實體合成，并且RRV逆轉(zhuǎn)錄酶的錯誤積累速 率依賴于引入多樣性，可在其進行選擇。在單獨的實施方案中，合成在序列中具有隨機編程 的不均一性的初始啟動子，使得當(dāng)引入RRV作為可選擇標(biāo)記的啟動子時，存在選擇可能序 列的更大景觀。在另一實施方案中，可以在啟動子序列中的隨機變異體提供初始病毒載體， 并且可使用相同類型的選擇來鑒定最優(yōu)的小型啟動子序列。在另一實施方案中，可將Kozak 序列RCCATGG(SEQ ID N0:51)引入小型啟動子下游，以促進mRNA初始結(jié)合至核糖體的小亞 基，從而提尚翻譯。
[0062] 具有足夠表達的優(yōu)化的小型啟動子可在大小受限的核酸（如病毒載體）中用于任 何情況。在一實施方案中，將優(yōu)化的小型啟動子用于復(fù)制型RRV中來表達一個或多個具有 抗癌效果的基因。在一實施方案中，將小型啟動子用于表達兩個基因，作為融合體，融合基 因由諸如像弗林內(nèi)源蛋白酶革巴點的蛋白酶切割位點分開或通過如2A家族（de Felipe et al.，Trends Biotech, 24:68-75, 2006)的自處理序列分開，或者通過包含兩個小型啟動子， 每個基因用一個小型啟動子。在另一實施方案中，小型啟動子可用于表達第一基因或編碼 序列，接著第二盒，其包含polIII啟動子，可用于表達siRNA，shRNA或microRNA。因為小 型啟動子盒較小，它可以有效地結(jié)合以并入其他治療編碼序列。
[0063] 可將本文所述的可操作地連接至待表達的基因或編碼序列的小型啟動子用于驅(qū) 動載體中的轉(zhuǎn)錄。在一實施方案中，本公開提供的載體從5'至3'包括：來自人巨細胞病毒 的立即早期啟動子至MLV R-U5區(qū)的CMV-R-U5融合體；PBS，逆轉(zhuǎn)錄酶的引物結(jié)合位點；5' 剪接位點；步包裝信號；用于MLV組特異性抗原的gag編碼序列；用于MLV聚合酶多聚蛋白 的pol編碼序列；3'剪接位點；用于MLV 4070A株系包膜蛋白的4070A env編碼序列；治療 盒，其包括（a)至少一個可操作連接至治療基因的小型啟動子盒，或者（b)核心啟動子和至 少一個選自以下的另一盒：polIII啟動子盒，第二核心啟動子盒，小型啟動子盒和IRES盒； 多嘌呤區(qū)；以及U3-R-U5MLV長末端重復(fù)。在進一步的實施方案中，載體中這些不同"部分" 的每一個（如gag、pol、env等）可包括本領(lǐng)域所熟知的源自不同y逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（如 MLV，GALV等）的序列。在一些實施方案中，載體源自或改造自MLV病毒序列。圖8A和圖 8B描繪了如本文其他地方更加詳細描述的本公開的各種載體。例如，在載體5'端的啟動 子可包括CMV啟動子，其具有如SEQ ID NO : 19, 20或22所示核苷酸1至核苷酸約582的序 列，并且可包括對一個或多個核酸酸堿基的修飾，這能夠指導(dǎo)和起始轉(zhuǎn)錄。在又一進一步的 實施方案中，載體啟動子包含如SEQ ID NO: 19, 20或22所示核苷酸1至核苷酸約582的 序列。在進一步的實施方案中，啟動子包含CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域多核苷酸。在一實施方案中， CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域包含連接至MLV R-U5區(qū)的來自人巨細胞病毒立即早期啟動子。在又一實 施方案中，CMV-R-U5結(jié)構(gòu)域多核苷酸包含如SEQ ID NO : 19, 20或22所示核苷酸約1至核苷 酸約1202的序列，或者與如SEQ ID NO : 19, 20或22所示核苷酸約1至約1202的序列至少 95%-致性的序列，其中多核苷酸促進與其可操作連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄。在另一實施方 案中，載體的gag和pol基因源自致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒或y逆轉(zhuǎn)錄病毒。gag核酸結(jié)構(gòu)域可包 括，例如SEQ ID NO: 19或22的核苷酸編號約1203至核苷酸約2819的序列，或者與其具有 至少95 %，98 %，99 %或99. 8 % -致性的序列。pol結(jié)構(gòu)域可包含SEQ ID NO: 19或22的核 苷酸編號約2820至核苷酸約6358的序列，或者與其具有至少95 %，98 %，99 %或99. 9 % - 致性的序列。在一實施方案中，env結(jié)構(gòu)域編碼兼嗜性env蛋白。該env結(jié)構(gòu)域可包含SEQ ID NO: 19或22的核苷酸編號約6359至核苷酸約8323的序列，或者與其具有至少95%， 98%，99%或99. 8% -致性的序列。
[0064] 治療盒正好位于env終止密碼子的下游。通常該治療盒于env終止密碼子之后 立即開始，或者在env終止密碼子下游約1，5,10,15, 20, 25, 30, 35,40,45, 50或100堿基 對。治療盒的開始通常具有從env終止密碼子的最小距離，以便優(yōu)化盒中異源基因的大 小。如上所述，治療盒可包括各自可操作地連接至治療性編碼序列的一個或多個小型啟動 子，或者各自可操作地連接至治療性編碼序列的小型啟動子和polIII啟動子，或者各自 可操作地連接到治療性的編碼序列的小型啟動子和IRES。載體的小型啟動子可以是小于 600bp (如約 599bp, 550bp, 500bp, 450bp, 400bp, 350bp, 300bp, 250bp, 200bp, 150bp, 100bp， 約90bp,約80bp,約76bp,約74bp或更?。┑娜魏握{(diào)控結(jié)構(gòu)域，并允許可操作連接的編碼 序列或非編碼序列的轉(zhuǎn)錄。在一實施方案中，該盒包括核心啟動子，其如SEQ ID NO :19或 22的核苷酸編號約8330至核苷酸約8406,或者與其具有至少95%，98%，或99%同一性 的序列。在另一實施方案中，如SEQ ID NO :19或22的約8328至8404所示的核心啟動子 可被任何數(shù)目的其它核心啟動子或小型啟動子取代，包括具有如SEQ ID NO :56, 57, 59,65， 66,67,68,69, 71，72, 73,和74所示序列的啟動子，并且還可包括額外的序列，如增強子（如 SEQ ID NO :58 和 70)。
[0065] 本公開提供了具有可操作地連接至細胞毒素基因的啟動子盒的某些RRVs的序 列。例如，SEQ ID勵：19描述了口403-(：1.7〇)2載體，其中所述載體包含8&84〇1和61^序 列，env序列之后緊跟CMV核心啟動子和具有3個熱穩(wěn)定突變的人源化胞嘧啶脫氨酶，其后 是3'LTR。SEQ ID N0:20描述了相似的結(jié)構(gòu)，但是所述盒包含S1啟動子，其后是人GMCSF 轉(zhuǎn)基因。SEQ ID N0:21示出了現(xiàn)有技術(shù)的RRV載體"PACE-⑶"的序列。SEQ ID N0:22示 出了與SEQ ID NO : 19和20相似的序列，除了該啟動子盒包含可操作地連接至鼠GMCSF的 S1啟動子。SEQ ID N0:39示出了具有Sl-yCD2盒的RRV的序列。SEQ ID N0:40示出具有 C1-GFP盒的RRV的序列。SEQ ID NO :41示出了具有S1-GFP盒的RRV的序列。
[0066] 術(shù)語"表達"是指允許或致使基因或DNA序列中的信息顯示，例如，通過激活參與 相應(yīng)基因或DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的細胞功能來產(chǎn)生蛋白質(zhì)。DNA序列表達于細胞中或通 過細胞表達來形成"表達產(chǎn)物"，如蛋白。表達產(chǎn)物本身，如所得到的蛋白，也可以說是通過 細胞"被表達的"。多核苷酸或多肽被重組表達，例如，當(dāng)它在外源或天然啟動子的控制下在 外來宿主細胞中表達或產(chǎn)生，或者在外源啟動子的控制下在天然宿主細胞中表達或產(chǎn)生。
[0067] 雖然本公開描述了使用含有核心啟動子或小型啟動子的RRVs，其他"載體"可包括 這樣的核心啟動子或小型啟動子構(gòu)建體來表達可操作連接的基因和序列。術(shù)語"載體"，"載 體構(gòu)建體"和"表達載體"是指可通過其將DNA或RNA序列（如外源基因）引入至宿主細胞 中以轉(zhuǎn)化宿主并促進被引入序列表達（如轉(zhuǎn)錄和翻譯）的媒介物。載體通常包括可傳送因 子的DNA，編碼蛋白的外源DNA可通過限制性酶技術(shù)插入其中。載體的常見類型是"質(zhì)粒"， 其通常是雙鏈DNA的自包含分子，可以容易地接受額外的（外源）DNA和容易地導(dǎo)入合適的 宿主細胞中。許多載體，包括質(zhì)粒和真菌載體，已經(jīng)被描述用于在多種真核和原核宿主中復(fù) 制和/或表達。然而，大多數(shù)的載體具有什么可以被克隆至載體的特定尺寸限制（例如，對 質(zhì)粒，12kb;對A噬菌體，20kb;對粘粒，30-35kb)。當(dāng)考慮逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時，這種限制更 加明顯。例如，典型的具有復(fù)制能力的鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組為約8. 3kb，而a逆轉(zhuǎn)錄病毒 RSV的基因組為約9. 3kb，其中包含除了病毒基因的正常補體之外的一次性src序列。對于 具有復(fù)制能力的脾壞死病毒載體，其最大尺寸相似，約為l〇kb(Gelinas and Temin 1986) (Retroviruses. , Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE 編，Cold Spring Harbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press ;1997)。據(jù)推測，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的大小限制取決于 折疊二聚體RNA的大小。此外，"空殼（gutted)"或復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可比其復(fù)制 能力對應(yīng)物并入更大的序列。
[0068] 本公開提供了逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制型載體，其包含編碼例如以下的可被遞送至細胞 或受試者的異源多核苷酸：具有胞嘧啶脫氨酶或其突變體的多肽；具有胸苷激酶活性或 其突變體的多肽；其他前藥活化基因；microRNA，shRNA或siRNA ;細胞因子；抗體結(jié)合結(jié) 構(gòu)域或其組合。除了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，可用于本公開的組合物和方法且可被改造以包含 核