Tal介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移dna插入的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)案要求2013年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/790434號(hào)和2012 年11月20日提交的的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/728466號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)案的全文通過(guò) 引用并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域并且提供靶向轉(zhuǎn)移DNA插入以制造具有所要性質(zhì) 的植物和植物產(chǎn)品的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 可以通過(guò)將DNA區(qū)段插入到植物的基因組中對(duì)植物進(jìn)行修飾。添加的DNA包含重 新排列以產(chǎn)生編碼蛋白質(zhì)或觸發(fā)特定原生RNA分解的RNA的遺傳元件?，F(xiàn)有技術(shù)教示多種 產(chǎn)生非靶向（不可預(yù)測(cè)并且隨機(jī)）插入的次優(yōu)方法。
[0004] 所屬領(lǐng)域需要高效并且可重現(xiàn)的制造具有所要性質(zhì)的基因工程改造植物和植物 產(chǎn)品。與采用轉(zhuǎn)基因性質(zhì)有關(guān)的挑戰(zhàn)令人不安，尤其是因?yàn)橥ㄟ^(guò)習(xí)知育種不能有效地解決 重要質(zhì)量問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)方面是一種將所要多核苷酸穩(wěn)定整合到植物基因組中的方法，其包 含：
[0006] (A)用包含編碼TAL蛋白質(zhì)的核苷酸序列的第一載體轉(zhuǎn)化植物材料，所述核苷酸 序列經(jīng)設(shè)計(jì)以識(shí)別目標(biāo)序列；
[0007] (B)用第二載體轉(zhuǎn)化所述植物材料，所述第二載體包含（i)標(biāo)記基因，其未可操作 地連接于啟動(dòng)子（"無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒"）且其包含與所述目標(biāo)序列同源的序列；以及（ii) 所要多核苷酸；以及
[0008] (C)鑒別所要多核苷酸經(jīng)穩(wěn)定整合的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物材料。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)轉(zhuǎn)化植物材料暴露于反映經(jīng)轉(zhuǎn)化植物中存在或不存在標(biāo)記基 因的條件。在另一實(shí)施例中，標(biāo)記基因?yàn)槟统輨┗蚯医?jīng)轉(zhuǎn)化植物材料暴露于除草劑。在 一個(gè)實(shí)施例中，耐除草劑基因?yàn)锳LS基因。在另一實(shí)施例中，無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒穩(wěn)定整合到 植物基因組中。
[0010] 在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種將外源性DNA靶向插入到植物中的方法，其包 含以下步驟：（i)用以下轉(zhuǎn)化經(jīng)分離的植物細(xì)胞：(A)包含啟動(dòng)子較少的盒的第一雙運(yùn)載 體，所述載體包含（a)連接到（b)Ubi7內(nèi)含子5'-未轉(zhuǎn)譯區(qū)的部分序列的右邊界序列；(c) 融合到突變乙酰乳酸合成酶（ALS)基因的Ubi7單體編碼序列；（d)所要核苷酸序列；以及 (e)終止序列，其中所要核苷酸序列未可操作地連接于啟動(dòng)子；以及（B)第二雙運(yùn)載體，其 包含（a)右邊界；(b)正向表達(dá)盒和反向表達(dá)盒，其各自包含經(jīng)修飾TAL效應(yīng)子可操作地連 接于強(qiáng)組成性啟動(dòng)子和終止序列；以及（c)編碼參與細(xì)胞分裂素制造的酶（例如異戊烯基 轉(zhuǎn)移酶（ipt))的序列，其中經(jīng)修飾TAL效應(yīng)子經(jīng)設(shè)計(jì)以結(jié)合馬鈴薯的泛素-7(Ubi7)基因 的內(nèi)含子內(nèi)的所要核苷酸序列；以及（ii)在促進(jìn)表達(dá)所要核苷酸序列的植物生長(zhǎng)的條件 下培養(yǎng)經(jīng)分離的植物細(xì)胞；其中載體骨架DNA未永久地插入到植物基因組中。
[0011] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，經(jīng)修飾TAL效應(yīng)子包含（a)包含F(xiàn)okl核酸內(nèi)切酶催 化域的截短C端活化域；(b)密碼子優(yōu)化的目標(biāo)序列結(jié)合域，其包含16. 5個(gè)對(duì)應(yīng)于Ubi7 5'-未轉(zhuǎn)譯內(nèi)含子序列的重復(fù)可變雙殘基；以及（c)包含SV40核定位序列的N端區(qū)。
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)額外優(yōu)選方面，所要核苷酸序列為靶向一或多種基因的沉默盒， 所述基因選自由天冬酰胺合成酶1 (Asnl)、多酚氧化酶（Ppo)和液泡轉(zhuǎn)化酶（Inv)基因組成 的群組。在本發(fā)明的一個(gè)甚至更優(yōu)選方面，第一雙運(yùn)載體另外包含晚疫病抗性基因Vntl，所 述基因可操作地連接于其原生啟動(dòng)子和終止序列。
[0013] 在一不同實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其基因組中包含可操作地連接 于所要外源性核苷酸序列的內(nèi)源性Ubi7啟動(dòng)子，所述外源性核苷酸序列可操作地連接于 外源性終止序列。在本發(fā)明的一個(gè)方面，一或多種選自由天冬酰胺合成酶1 (Asnl)、多酚氧 化酶（Ppo)和液泡轉(zhuǎn)化酶（Inv)基因組成的群組的基因的表達(dá)下調(diào)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選 方面，植物另外表達(dá)晚疫病抗性基因Vntl。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)轉(zhuǎn)化植物為具有塊莖的植物。在一優(yōu)選實(shí)施例中，具有塊莖的 植物為馬鈴薯植物。優(yōu)選地，經(jīng)轉(zhuǎn)化植物具有由以下中的一或多者表征的表型：晚疫病抗 性、黑斑碰傷耐受性、低溫誘發(fā)的甜化降低和其塊莖中的天冬酰胺含量降低。
[0015] 在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的熱加工產(chǎn)品。優(yōu)選地，熱 加工產(chǎn)品為法式炸薯?xiàng)l、薯片、脆片、馬鈴薯、脫水馬鈴薯或烤馬鈴薯。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選 方面，熱加工產(chǎn)品的丙烯酰胺含量低于相同物種的非轉(zhuǎn)化植物的熱加工產(chǎn)品。
[0016] 在一不同實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)設(shè)計(jì)以結(jié)合到所要序列的經(jīng)修飾TAL效應(yīng) 子，所述所要序列包含（a)包含催化域的截短C端活化域；(b)密碼子優(yōu)化的目標(biāo)序列結(jié)合 域；以及（c)包含核定位序列的N端區(qū)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，經(jīng)修飾TAL效應(yīng)子經(jīng)設(shè) 計(jì)以結(jié)合馬鈴薯的泛素_7(Ubi7)基因的內(nèi)含子內(nèi)的所要序列。因此，經(jīng)修飾TAL效應(yīng)子包 含（a)包含F(xiàn)okl核酸內(nèi)切酶的C端活化域中的催化域；(b)目標(biāo)序列結(jié)合域，其包含16. 5 個(gè)對(duì)應(yīng)于Ubi7 5'-未轉(zhuǎn)譯內(nèi)含子序列的重復(fù)變數(shù)雙殘基；以及（c) N端區(qū)中的SV40核定位 序列。
[0017] 在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種雙運(yùn)載體，其包含（a)右邊界；(b)正向表達(dá)盒 和反向表達(dá)盒，其各自包含根據(jù)權(quán)利要求16所述的經(jīng)修飾TAL效應(yīng)子可操作地連接于強(qiáng) 組成性啟動(dòng)子和終止序列；以及（c)編碼參與細(xì)胞分裂素制造的酶（例如異戊烯基轉(zhuǎn)移酶 (ipt))的序列。
[0018] 在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種包含啟動(dòng)子較少的盒的DNA構(gòu)筑體，其包含（a) 連接到（b)部分Ubi7 5'-未轉(zhuǎn)譯內(nèi)含子序列的右邊界序列；（c)融合到突變乙酰乳酸合成 酶（ALS)基因的Ubi7單體編碼序列；（d)所要核苷酸序列；（e)終止序列；以及（f)左邊界， 其中所要核苷酸序列未可操作地連接于啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，DNA構(gòu)筑體中的 所要核苷酸序列為靶向一或多種基因的沉默盒，所述基因選自由天冬酰胺合成酶1 (Asnl)、 多酚氧化酶（Ppo)和液泡轉(zhuǎn)化酶（Inv)基因組成的群組。在一個(gè)甚至更優(yōu)選方面，DNA構(gòu) 筑體另外包含晚疫病抗性基因Vntl，所述基因可操作地連接于其原生啟動(dòng)子和終止序列。
[0019] 在一個(gè)不同實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種將外源性DNA靶向插入到植物中的試劑 盒，其包含：(A)包含啟動(dòng)子較少的盒的第一雙運(yùn)載體，所述載體包含（a)連接到（b)Ubi7 內(nèi)含子5'-未轉(zhuǎn)譯區(qū)的部分序列的右邊界序列；（c)融合到突變乙酰乳酸合成酶（ALS)基 因的Ubi7單體編碼序列；（d)所要核苷酸序列；以及（e)終止序列，其中所要核苷酸序列 未可操作地連接于啟動(dòng)子；以及（B)第二雙運(yùn)載體，其包含（a)右邊界；(b)正向表達(dá)盒和 反向表達(dá)盒，其各自包含經(jīng)修飾TAL效應(yīng)子可操作地連接于強(qiáng)組成性啟動(dòng)子和終止序列； 以及（c)編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（ipt)的序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，經(jīng)修飾TAL效應(yīng) 子經(jīng)設(shè)計(jì)以結(jié)合馬鈴薯的泛素-7 (Ubi7)基因的內(nèi)含子內(nèi)的所要核苷酸序列，并且包含（a) 包含F(xiàn)okl核酸內(nèi)切酶催化域的截短C端活化域；(b)密碼子優(yōu)化的目標(biāo)序列結(jié)合域，其包 含16. 5個(gè)對(duì)應(yīng)于Ubi7 5'-未轉(zhuǎn)譯內(nèi)含子序列的重復(fù)可變雙殘基；以及（c)包含SV40核定 位序列的N端區(qū)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面，所要核苷酸序列為靶向一或多種基因的沉 默盒，所述基因選自由天冬酰胺合成酶l(Asnl)、多酚氧化酶（Ppo)和液泡轉(zhuǎn)化酶（Inv)基 因組成的群組。在本發(fā)明的一個(gè)甚至更優(yōu)選方面，第一雙運(yùn)載體另外包含晚疫病抗性基因 Vntl，所述基因可操作地連接于其原生啟動(dòng)子和終止序列。
[0020] 前述整體描述和以下詳細(xì)描述為例示性和說(shuō)明性的并且打算提供所要求的本發(fā) 明的其它解釋。本領(lǐng)域的技術(shù)人員從本發(fā)明的以下詳細(xì)描述容易顯而易知其它目標(biāo)、優(yōu)勢(shì) 和新穎特征。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 本申請(qǐng)案含有至少一個(gè)圖式制成彩圖。
[0022] 圖1說(shuō)明質(zhì)粒pSM2168的轉(zhuǎn)移DNA組構(gòu)。下圖中所示的序列以25bp未突出的右 邊界開(kāi)始。淺灰色突出的序列為Ubi7內(nèi)含子的部分，深灰色突出的序列為Ubi7單體并且 其余未突出的序列為馬鈴薯ALS基因編碼的部分。pSM2168的Ubi7In區(qū)段包含與TAL選 擇性剪切的內(nèi)源性內(nèi)含子序列同源的同源臂。
[0023] 圖2說(shuō)明載體pSM2170中的正向（E3)和反向（E4)TAL效應(yīng)子盒。
[0024] 圖3顯示實(shí)例9中所述的右邊界測(cè)試盒。
[0025] 圖4說(shuō)明攜帶Ubi7: :ALS盒的質(zhì)粒pSM2162的DNA組構(gòu)。
[0026] 圖5顯示正向（5A)和反向（5B)效應(yīng)蛋白的組構(gòu)。
[0027] 圖6說(shuō)明攜帶目標(biāo)序列的質(zhì)粒pSM216的組構(gòu)，所述目標(biāo)序列含有位于緊靠著⑶S 報(bào)告基因的起始密碼子下游處的正向和反向識(shí)別位點(diǎn)。
[0028] 圖7顯示農(nóng)桿菌（Agrobacterium)浸潤(rùn)后的本塞姆氏煙草（Nicothiana benthamiana)葉的⑶S染色。左圖：用單獨(dú)的目標(biāo)載體pSIM2167浸潤(rùn)。右圖；用目標(biāo)載體 PSIM2167和TAL效應(yīng)載體pSIM2170浸潤(rùn)。
[0029] 圖8顯示用TAL效應(yīng)載體pSM2170共同浸潤(rùn)后的質(zhì)粒pSM2167的PCR擴(kuò)增目標(biāo) 區(qū)的序列。效應(yīng)子識(shí)別部位用灰色突出。目標(biāo)序列的修飾為小缺失（主要形式）和取代 (深灰色突出）。
[0030] 圖9顯示來(lái)自靶向插入特異性PCR的的片段的序列。第一未突出序列和第一淺灰 色突出序列為馬鈴薯基因組序列。未突出序列：Uni7類啟動(dòng)子的部分；淺灰色突出序列： Uni7類內(nèi)含子。其余序列來(lái)自pSIM2168載體。深灰色序列：Ubi7內(nèi)含子的部分；未突出序 列：Ubi7單體；淺灰色突出序列：ALS編碼序列的部分。
[0031] 圖10顯示在含有特美?。╰imentin)和0? Omg/1甲氧咪草煙（imazamox)(左圖） 或2. Omg/1甲氧咪草煙（右圖）的不含激素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的節(jié)點(diǎn)間外植體。當(dāng)節(jié)點(diǎn)間外 植體在含有甲氧咪草煙的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，可見(jiàn)未完全展開(kāi)的正常嫩枝。
[0032] 圖11顯示藍(lán)吉魯賽特對(duì)照（Ranger Russet control) (RR-C)品種和耐除草劑藍(lán) 吉魯賽特品種用PSIM2170和pSIM2168質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化以供靶向插入，在感染后七天用致病疫 霉（P. infestans)晚疫病病毒株US8BF6攻擊產(chǎn)生疾病癥狀。
[0033] 圖12描繪用pSM2170和pSM2168質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化以供靶向插入的所選定耐除草劑 藍(lán)吉魯賽特品種的南方墨點(diǎn)凝膠。左圖：轉(zhuǎn)化酶探針；右圖：Vntl啟動(dòng)子探針。經(jīng)轉(zhuǎn)化品種 中相較于藍(lán)吉魯賽特對(duì)照（RR)品種的每一額外帶指示品種RR-36(36)和RR-39(39)的單 拷貝轉(zhuǎn)基因。經(jīng)轉(zhuǎn)化品種RR-26和RR-32未圖示。
[0034] 圖13顯示馬鈴薯塊莖中的天冬酰胺的均勻沉默。斯諾登品種（Snowden line)2、 15、55 和 83 用 pSIM2168 和 pSIM2170 轉(zhuǎn)化。
[0035] 圖14顯示馬鈴薯塊莖中的多酚氧化酶的均勻沉默。斯諾登品種2、15、55和83用 PSIM2168 和 pSIM2170 轉(zhuǎn)化。
[0036] 圖15顯示馬鈴薯塊莖中的天冬酰胺的均勻沉默。藍(lán)吉品種（Ranger line) 26、32、 38 和 39 用 pSIM2168 和 pSIM2170 轉(zhuǎn)化。
[0037] 圖16顯示馬鈴薯塊莖中的多酚氧化酶的均勻沉默。藍(lán)吉品種26、32、38和39用 PSIM2168 和 pSIM2170 轉(zhuǎn)化。
[0038] 圖17顯示經(jīng)轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株的產(chǎn)量。
[0039]圖 18 顯示 pSM4187 中的 FMV-CAS9-0CS 和 35s-gRNA-Nos 盒。顯示 gRNA 的序列 并且突出20bp目標(biāo)特異性序列。
[0040] 圖19顯示農(nóng)桿菌浸潤(rùn)后的本塞姆氏煙草葉的⑶S染色。pSM2167:目標(biāo)-GUS載 體；PSM4187 :Cas9 和 gRNA 載體。
[0041] 圖20顯示用pSM4187共同浸潤(rùn)后質(zhì)粒pSM2167的PCR擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)的序列。gRNA 中的目標(biāo)特異性序列經(jīng)墨綠色突出。目標(biāo)序列的修飾為小缺失和取代。
【具體實(shí)施方式】
[0042]本發(fā)明的一個(gè)方面為短暫表達(dá)經(jīng)設(shè)計(jì)以結(jié)合到所要染色體組目標(biāo)基因座且因此 剪切所要染色體組目標(biāo)基因座的轉(zhuǎn)錄活化子類效應(yīng)蛋白，并且由此有助于在那個(gè)特定目標(biāo) 基因座處插入所要多核苷酸。因此，本發(fā)明涵蓋用含有編碼形成識(shí)別和裂解目標(biāo)基因座的 適當(dāng)TAL二聚體的肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)盒的載體和包含一或多個(gè)所要表達(dá)盒的第二載體轉(zhuǎn) 化植物材料。這類所要表達(dá)盒可編碼特定蛋白質(zhì)或基因沉默轉(zhuǎn)錄物。在一個(gè)實(shí)施例中，第二 載體可包含在本文中稱為"無(wú)啟動(dòng)子的"盒的盒，其包含（i)標(biāo)記基因或編碼所要表型的基 因，和如果可操作地連接于啟動(dòng)子，那么有助于適當(dāng)表達(dá)所述標(biāo)記基因的適當(dāng)其它調(diào)節(jié)元 件；以及（ii)與內(nèi)源性目標(biāo)基因座位點(diǎn)目標(biāo)同源的核苷酸區(qū)。所述同源核苷酸區(qū)可包含例 如10-20個(gè)、20-50個(gè)或20-100個(gè)核苷酸，其與內(nèi)源性目標(biāo)基因座的相應(yīng)序列共享100%， 或至少99%，或至少98%，或至少97%，或至少96%，或至少95%，或至少94%，或至少 93 %，或至少92 %，或至少91 %，或至少90 %，或至少89 %，或至少88 %，或至少87 %，或至 少86 %，或至少85 %，或至少84 %，或至少83 %，或至少82 %，或至少81 %，或至少80 %，或 至少79 %，或至少78 %，或至少77 %，或至少76 %，或至少75 %，或至少74 %，或至少73 %， 或至少72%，或至少71%，或至少70%，或至少69%，或至少68%，或至少67%，或至少 66 %，或至少65 %，或至少64 %，或至少63 %，或至少62 %，或至少61 %，或至少60 %，或至 少59 %，或至少58 %，或至少57 %，或至少56 %，或至少55 %，或至少54 %，或至少53 %，或 至少52%，或至少51%，或至少50%核苷酸序列一致性。
[0043]因此，在一個(gè)實(shí)施例中，第二載體包含至少⑴編碼所要多核苷酸的表達(dá)盒（例如 編碼蛋白質(zhì)或不可轉(zhuǎn)譯的RNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)盒，所述RNA轉(zhuǎn)錄物可包含待下調(diào)的目標(biāo)基因 的有義序列、反義序列和/或反向重復(fù)序列），以及（ii)無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒，其包含可操作 地連接于調(diào)節(jié)元件（例如終止子或3-未轉(zhuǎn)譯區(qū)）的標(biāo)記基因以及同源目標(biāo)位點(diǎn)區(qū)。
[0044] 第二載體的無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒和表達(dá)盒理想地一起行進(jìn)，使得兩者都因?yàn)門(mén)AL介 導(dǎo)的活性（由另一 TAL編碼載體引起）而整合到目標(biāo)基因座中。理想地，無(wú)啟動(dòng)子的盒和 表達(dá)盒整合到目標(biāo)基因座處的所要位點(diǎn)中，所述所要位點(diǎn)適合地例如視具體情況而定靠近 一或多個(gè)功能性內(nèi)源性啟動(dòng)子或內(nèi)源性調(diào)節(jié)元件的下游或上游，使得內(nèi)源性啟動(dòng)子或調(diào)節(jié) 元件表達(dá)第二載體中的無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒的標(biāo)記基因。因此，適當(dāng)設(shè)計(jì)TAL序列以識(shí)別這 類在起始基因表達(dá)的內(nèi)源性基因啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件（例如增強(qiáng)子元件）下游或上游的目標(biāo) 序列對(duì)于幫助確保表達(dá)盒和無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒在具體選擇的基因組定位時(shí)間以及不同轉(zhuǎn) 化事件之間整合是重要的。
[0045] 因此，本發(fā)明允許定點(diǎn)插入所要多核苷酸（例如本文所揭示和如別處所述的盒中 的一個(gè)），這確保具體目標(biāo)基因在不同轉(zhuǎn)化事件之間表達(dá)或下調(diào)程度的一致性。舉例來(lái)說(shuō)， 定點(diǎn)插入所要多核苷酸可用于重新表達(dá)或過(guò)度表達(dá)目標(biāo)基因。在一些實(shí)施例中，目標(biāo)基因 的重新表達(dá)或過(guò)度表達(dá)程度在不同轉(zhuǎn)化事件之間可能變化不超過(guò)200 %，或不超過(guò)100 %， 或不超過(guò)50 %，或不超過(guò)30 %?；蛘?，定點(diǎn)插入所要多核苷酸可用于制造下調(diào)目標(biāo)基因的 RNA轉(zhuǎn)錄物。在一些實(shí)施例中，目標(biāo)基因的下調(diào)程度在不同轉(zhuǎn)化事件之間可能變化不超過(guò) 200 %，或不超過(guò)100 %，或不超過(guò)50 %，或不超過(guò)30 %。
[0046] 標(biāo)記基因是重要的，因?yàn)槿绻m當(dāng)整合無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒，那么標(biāo)記基因?qū)⑼ㄟ^(guò) 內(nèi)源性調(diào)節(jié)元件表達(dá)，并且視標(biāo)記類型而定將（a)有效鑒別成功轉(zhuǎn)化體，以及（b)產(chǎn)生在所 要目標(biāo)位置成功插入共接合的表達(dá)盒的初步跡象。因此，如果標(biāo)記基因?yàn)槟统輨┗?，?么經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可基于相關(guān)除草劑培養(yǎng)，并且存活的細(xì)胞反映在靠近功能性內(nèi)源性啟動(dòng) 子的所要目標(biāo)基因座處用耐除草劑基因轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞。
[0047] 因此，高度需要在不同轉(zhuǎn)化事件之間在相同染色體組基因座處常規(guī)地插入表達(dá)盒 的能力，并且因?yàn)槠錅p少鑒別否則將在不同染色體組環(huán)境中隨機(jī)發(fā)生的整合事件所需的篩 選數(shù)量而有利并且節(jié)約成本。參看例如實(shí)例14。隨機(jī)整合基因座中的那些差異通常可不 利地?cái)_亂局部染色體組環(huán)境，基因敲除必需基因，或?qū)⑺磉_(dá)盒置于未能表達(dá)整合的DNA 的基因座中。
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