48] 因此，第二載體的無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒中存在的同源目標(biāo)位點(diǎn)區(qū)經(jīng)特異性設(shè)計(jì)以與 內(nèi)源性目標(biāo)位點(diǎn)序列匹配，第一載體的TAL蛋白質(zhì)二聚體也經(jīng)設(shè)計(jì)以識(shí)別、結(jié)合到或剪切 所述內(nèi)源性目標(biāo)位點(diǎn)序列。第二載體可包含一個(gè)在待插入的多核苷酸序列上游或下游的同 源目標(biāo)位點(diǎn)區(qū)，或兩個(gè)側(cè)接待插入的多核苷酸序列的同源目標(biāo)位點(diǎn)區(qū)。因此，無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo) 記盒和TAL表達(dá)盒都含有內(nèi)源性染色體組目標(biāo)基因座獨(dú)有的序列，使得無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒 和其共接合的所要表達(dá)盒插入到TAL剪切的精確目標(biāo)基因座位點(diǎn)中。
[0049]本發(fā)明不限于將無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒和表達(dá)盒插入到染色體組基因座中或內(nèi)源性 啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件附近。確切來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涵蓋本發(fā)明方法基于識(shí)別來(lái)自先前轉(zhuǎn)化事件的 多核苷酸序列的TAL序列和同源區(qū)的設(shè)計(jì)以模組方式堆疊盒的用途。也就是說(shuō)，在一個(gè)實(shí) 施例中，植物可以已經(jīng)用表達(dá)盒A穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，所述表達(dá)盒A使用或不使用TAL在植物基因組 中的具體或隨機(jī)位點(diǎn)處表達(dá)基因X。本發(fā)明的TAL介導(dǎo)的整合方法允許設(shè)計(jì)識(shí)別可能在表 達(dá)盒A中的基因X下游的序列的TAL序列，使得TAL二聚體有效裂解基因X位點(diǎn)處的植物 基因組。如果無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒一或任何表達(dá)盒一包含與基因X位點(diǎn)同源的區(qū)，那么可 以在緊靠著基因X的下游處引入所述盒。如所提到，本發(fā)明不必在所有情況下都必須利用 無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記系統(tǒng)，因?yàn)榭赡苡械那闆r中整合到預(yù)轉(zhuǎn)化基因X植物下游的所關(guān)注基因自 身或自行產(chǎn)生可檢測(cè)的并且所要的性狀。此外，額外表達(dá)盒本身可含有啟動(dòng)子或可為無(wú)啟 動(dòng)子的，使得所關(guān)注基因從表達(dá)盒A的啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)元件表達(dá)。
[0050]因此，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涵蓋使用無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記設(shè)計(jì)將所要表達(dá)盒重新 插入到目標(biāo)基因座中來(lái)識(shí)別成功和適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化體。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涵蓋隨后插入 一或多個(gè)額外表達(dá)盒，其在先前整合事件的下游或上游可包括或可不包括無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記 盒。因此，在后一方法中，本發(fā)明允許使用本文所述的TAL介導(dǎo)的定點(diǎn)插入技術(shù)，通過(guò)將不 同表達(dá)盒有效地連接在一起（即使這是通過(guò)不同轉(zhuǎn)化進(jìn)行的），在植物基因組內(nèi)的精確和 規(guī)定位置處堆疊基因的能力。
[0051] 在一個(gè)實(shí)施例中，希望僅短暫表達(dá)TAL蛋白質(zhì)，使得僅有的DNA穩(wěn)定整合到屬于所 要表達(dá)盒和無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒（如果使用）的植物基因組中。
[0052]因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涵蓋（1)鑒別植物的基因組中的所要目標(biāo)基因座序列； ⑵設(shè)計(jì)具體識(shí)別所述目標(biāo)基因座序列的相應(yīng)TAL序列；以及任選地（3)在浸潤(rùn)分析法中 分析所設(shè)計(jì)的TAL序列例如來(lái)測(cè)試相應(yīng)TAL二聚體在形成時(shí)是否經(jīng)適當(dāng)剪切。起作用的 TAL接著可亞克隆到短暫表達(dá)轉(zhuǎn)化載體中，例如圖2中所示。本文中詳細(xì)描述這些步驟。參 看例如實(shí)例10和11。
[0053]接著可將第二載體設(shè)計(jì)成包含一或多個(gè)所要表達(dá)盒以及無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒，并且 TAL載體和第二載體都隨后轉(zhuǎn)化成一種或兩種農(nóng)桿菌病毒株。
[0054]接著可使用這些農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化例如外植體、愈傷組織、細(xì)胞、葉或莖等植物材料。在 一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)轉(zhuǎn)化植物材料可生長(zhǎng)到培養(yǎng)基上的愈傷組織中，所述培養(yǎng)基不含任何選 擇組分。也就是說(shuō)，為了容易說(shuō)明，如果第二載體包含未可操作地連接于啟動(dòng)子的耐除草劑 標(biāo)記基因，那么經(jīng)轉(zhuǎn)化植物材料最初將在不含除草劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間。在所述時(shí) 間段后，植物材料可置于含有除草劑的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。那些存活的材料接著可置 于也含有相同除草劑的發(fā)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上直到產(chǎn)生嫩枝且存活一段時(shí)間。除草劑培養(yǎng)基上 生長(zhǎng)的嫩枝的基因組中因此可能含有穩(wěn)定整合的耐除草劑基因以及實(shí)際所要的表達(dá)盒。那 些耐除草劑嫩枝或自那些嫩枝生長(zhǎng)的葉接著可進(jìn)行PCR和其它分子分析來(lái)判斷其是否在 正確和預(yù)期的染色體組目標(biāo)位置中含有標(biāo)記以及所要表達(dá)盒。這一方法在本文中詳細(xì)描 述，參看例如實(shí)例4。當(dāng)ALS基因用作如本文所述的無(wú)啟動(dòng)子的排列中的標(biāo)記基因時(shí)，80% 所分析的經(jīng)轉(zhuǎn)化嫩枝/葉含有穩(wěn)定整合到所要染色體組基因座中的所要插入。
[0055] 在一個(gè)實(shí)施例中，除了無(wú)啟動(dòng)子的ALS除草劑標(biāo)記基因之外，第二載體還包含晚 疫病的基因表達(dá)盒和沉默PP〇、ASN1和轉(zhuǎn)化酶的基因沉默盒，如pSIM2168(圖1)中所示。 在這種情況下，ALS基因未可操作地連接于啟動(dòng)子但是可操作地連接于終止子，并且在上游 包括與內(nèi)源性植物Ubi7基因內(nèi)含子的區(qū)或Ubi7外顯子#1的部分與同源的序列。圖2描 繪所述E4R印和E3重復(fù)TAL序列的相應(yīng)載體（pSM2170)，所述序列也經(jīng)設(shè)計(jì)以識(shí)別Ubi7 基因內(nèi)含子內(nèi)的天然存在的序列。PSIM2168和pSIM2170都轉(zhuǎn)化成馬鈴薯莖外植體并且進(jìn) 行上文所述的方法和如本文提供的實(shí)例中的方法細(xì)節(jié)中所述的方法。結(jié)果顯示本發(fā)明方法 成功使用TAL介導(dǎo)的整合將pSIM2168的盒穩(wěn)定整合到內(nèi)源性Ubi7基因內(nèi)含子中所要的精 確目標(biāo)位置中。
[0056] 本發(fā)明方法不限于使用轉(zhuǎn)移-DNA或農(nóng)桿菌引入這類載體。有可能使用例如不具 有任何農(nóng)桿菌或T-DNA組分的粒子轟擊。在一個(gè)實(shí)施例中，舉例來(lái)說(shuō)，有可能用編碼所要 表達(dá)盒和無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記盒的DNA涂布粒子轟擊粒子，并且還用TAL蛋白質(zhì)或TAL蛋白質(zhì) 二聚體涂布相同粒子。以此方式，因此粒子可包含編碼DNA和TAL蛋白質(zhì)兩者，或一些粒 子可涂布有編碼DNA或TAL蛋白質(zhì)中的任一者。在任何情況下，植物材料可用這類經(jīng)涂 布的粒子轟擊，當(dāng)粒子進(jìn)入植物細(xì)胞時(shí)，TAL蛋白質(zhì)如預(yù)期用于在所要位點(diǎn)處剪切基因組 序列并且整合共同傳遞的DNA。如何使用粒子轟擊將蛋白質(zhì)和DNA共同傳遞到植物中的 實(shí)例參看例如馬丁-奧爾蒂戈薩（Martin-Ortigosa)等人，先進(jìn)功能材料（Adv. Funct. Mater.) 22, 3576-3582 (2012)，其通過(guò)引用并入本文中。
[0057] 如本文所用，"所要多核苷酸"基本上為使用者希望整合到植物基因組中的表達(dá)盒 或基因沉默盒內(nèi)的任何多核苷酸或DNA序列的系列。因此，本文中"所要多核苷酸"可與 "盒"、"表達(dá)盒"或"沉默盒"互換使用。任何表達(dá)盒中的所要多核苷酸可以可操作地連接于 任何種類或強(qiáng)度的啟動(dòng)子且其表達(dá)因此不必取決于內(nèi)源性植物染色體組啟動(dòng)子的表達(dá)。
[0058] 盡管希望根據(jù)本發(fā)明的TAL介導(dǎo)的整合技術(shù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物基因組，但本發(fā)明方法 的另一實(shí)施例涵蓋將所要多核苷酸整合到任何形式或樣品的核酸中，而不
[0059] TAL
[0060] 轉(zhuǎn)錄活化子一類（TAL)效應(yīng)子為含有模組DNA結(jié)合域的植物病原性細(xì)菌蛋白質(zhì)， 所述結(jié)合域有助于將DNA定點(diǎn)整合到例如植物基因組中的具體所要目標(biāo)位點(diǎn)中。這些結(jié)構(gòu) 域包含串聯(lián)多形氨基酸重復(fù)序列，所述重復(fù)序列分別限定適用于導(dǎo)向靶向定點(diǎn)整合方法的 DNA中的連續(xù)核苷酸。
[0061] 中心重復(fù)結(jié)構(gòu)域可包含1. 5到33. 5個(gè)重復(fù)序列，所述重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常為34 個(gè)殘基。重復(fù)序列的實(shí)例為：
[0062] LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHG
[0063] 第12和第13位置處的殘基可為稱為"重復(fù)可變雙殘基"或RVD的高變殘基。TAL 效應(yīng)子的目標(biāo)位點(diǎn)中的序列重復(fù)和序列DNA堿基中的這兩個(gè)殘基的身份之間存在某種關(guān) 系。RVD序列與目標(biāo)DNA堿基之間的密碼子可表示為：
[0064] NI = A
[0065] HD = C
[0066] NG = T
[0067]剛=1?(6或六），且
[0068] NS = N(A、C、G或T)。
[0069] RVDNK可靶向G，但專門(mén)使用NK代替NN來(lái)靶向G的TAL效應(yīng)子核酸酶（TALEN) 的活性可能較低。
[0070] TAL效應(yīng)子的目標(biāo)位點(diǎn)可包括側(cè)接第一重復(fù)序列所靶向的5' -堿基的T，可能是由 于中心重復(fù)結(jié)構(gòu)域的N端區(qū)中這個(gè)T核苷酸與保守色氨酸之間的接觸。
[0071] 還參看全文通過(guò)引用并入本文中的以下出版物：博赫J(rèn)(Boch J)，博納斯 U(Bonas U)(2010年9月"黃單胞菌屬AvrBs3家族-III型效應(yīng)子：發(fā)現(xiàn)和功能 (XanthomonasAvrBs3Family-Type III Effectors:Discovery and Function)''.植物病 理學(xué)年評(píng)（Annual Review of Phytopathology) 48:419-36 ;伏亞塔斯 DF (Voytas DF)， 俊 JK(Joung JK) (2009 年 12 月）? "植物科學(xué)? DNA 結(jié)合變得容易（Plant science. DNA binding made easy)" ?科學(xué)（Science) 326 (5959): 1491-2?雙刊（Bibcode) 2009;莫斯科 MJ(Moscou MJ),博格丹弗AJ(Bogdanove AJ) (2009年12月）."通過(guò)TAL效應(yīng)子的簡(jiǎn)單密 碼管理 DNA 識(shí)別（A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors)"?科 學(xué) 326(5959):1501;博赫1舒爾茨11(5〇11〇126 11)，朔爾納克5(5〇11〇11^〇1^5)等人.（2009 年12月）."破壞TAL-III型效應(yīng)子的DNA結(jié)合特異性的密碼子（Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors) " ?科學(xué) 326 (5959) : 1509- 12;莫比特茲，R. (Morbitzer，R.);羅默，P. (Romer，P.);博赫，J.;拉艾，T. (Lahaye，T.) (2010)使用重新工程改造的轉(zhuǎn)錄活化子類效應(yīng)子（TALE)-型轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)所選基因組基 因座（Regulation of selected genome loci using de novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) -type transcription factors)''.美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院 刊（Proceedings of the National Academy of Sciences) 107(50):21617-21622 ;米 勒，J. C. (Miller, J. C.);譚，S. (Tan, S.);喬，G. (Qiao, G.);巴羅，K. A. (Barlow, K. A.); 王，J. (Wang, J.);霞，D. F. (Xia，D. F.);孟，X. (Meng，X.);帕申，D. E. (Paschon，D. E.)等 人.（2010). "用于有效基因組編輯的TALE核酸酶結(jié)構(gòu)（A TALE nuclease architecture for efficient genome editing)".自然生物技術(shù)（Nature Biotechnology)29(2): 14; 黃，P. (Huang, P.);肖，A. (Xiao, A.);周，M. (Zhou, M.);朱，Z. (Zhu，Z.);林，5. (Lin，S.);張，B. (Zhang，B.) (2011) ?"使用定制TALEN的斑馬魚(yú)中的遺傳性基因靶向 (Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs) " ?自然生物技 術(shù) 29 (8) : 699 ;以及馬克，A. N. -S. (Mak, A. N. -S.);布蘭得利，P. (fcadley, P.);瑟那達(dá)，R. A. (Cernadas, R. A.);博格丹弗 A. J. (Bogdanove, A. J.);斯托達(dá)德，B. L. (Stoddard, B. L.) (2012). "TAL效應(yīng)子PthXol與其DNA目標(biāo)結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)（The Crystal Structure of TAL Effector PthXolBound to Its DNA Target)" ?科學(xué)? doi (Science. doi):10. 1126/ 科學(xué).1216211。
[0072]標(biāo)記
[0073]可如本文所揭示用于無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記基因盒中的標(biāo)記基因的類別的實(shí)例包括 (但不限于）除草劑耐受性、殺蟲(chóng)劑耐受性昆蟲(chóng)抗性、逆境耐受性、果實(shí)或種子的強(qiáng)化的風(fēng) 味或穩(wěn)定性，或合成適用非植物蛋白（例如有醫(yī)學(xué)價(jià)值的蛋白質(zhì)）的能力，或產(chǎn)生改變濃度 的植物蛋白的能力，以及對(duì)植物的相關(guān)影響，例如催化植物代謝物（包括二次植物代謝物） 產(chǎn)生的改變含量的植物蛋白。
[0074] 本發(fā)明提供將所要核苷酸序列靶向插入到植物中的方法和試劑盒，其通過(guò)將啟動(dòng) 子較少的所要核苷酸序列插入到泛素-7 (Ubi7)基因的內(nèi)含子序列中，使得內(nèi)源性Ubi7啟 動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源性核苷酸序列在植物中的表達(dá)。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明人能夠形成用于短暫表達(dá) 經(jīng)特異性設(shè)計(jì)以結(jié)合Ubi7基因的內(nèi)含子序列內(nèi)的所要核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄活化子類效應(yīng)子 核酸酶的雙運(yùn)載體，使得當(dāng)這些載體與攜帶靶向啟動(dòng)子較少的核苷酸序列的雙運(yùn)載體一起 引入到植物細(xì)胞中時(shí)，所要核苷酸序列以適當(dāng)方向和間距插入到Ubi7基因的內(nèi)含子序列 中，且其表達(dá)由內(nèi)源性Ubi7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。因此獲得的從經(jīng)轉(zhuǎn)化外植體再生的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物僅 攜帶靶向序列。
[0075] 本發(fā)明另外提供通過(guò)本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的植物，以及用于短暫和持久轉(zhuǎn)化的雙運(yùn) 載體。
[0076] 本發(fā)明的技術(shù)策略解決了通過(guò)靶向轉(zhuǎn)化有效產(chǎn)生具有所要性質(zhì)的基因工程改造 的植物和植物產(chǎn)品的需要，使得可以提高植物作物（并且具體來(lái)說(shuō)具有塊莖的植物，例如 馬鈴薯植物）的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和農(nóng)藝特性。所要性質(zhì)包括（但不限于）對(duì)撞擊引起的黑斑碰傷 的高度耐受性、減少丙烯酰胺前驅(qū)物天冬酰胺的形成、減少還原糖的積累以及減少包括丙 烯酰胺的毒性美拉德產(chǎn)物（Maillard product)的積累。因此，本發(fā)明允許通過(guò)減少酶類 的表達(dá)并且通過(guò)提高晚疫病抗性基因Vntl的表達(dá)將這些所要性質(zhì)靶向插入到植物基因組 中，所述酶類例如負(fù)責(zé)黑斑碰傷的多酚氧化酶（PP0)和負(fù)責(zé)天冬酰胺積累的天冬酰胺合成 酶-1 (Asn-1)，天冬酰胺是形成丙烯酰胺的前驅(qū)物。
[0077] 本發(fā)明使用實(shí)施本領(lǐng)域者熟知的術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)。除非另外規(guī)定，否則本文所使用的 所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。 一般來(lái)說(shuō)，本文所用的命名法和本文所述的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳以及核酸化學(xué)方法和雜交 中的實(shí)驗(yàn)室程序?yàn)樗鶎兕I(lǐng)域中熟知并且通常采用的那些命名法和程序。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組 核酸方法、多核苷酸合成、微生物培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、分析型化學(xué) 方法、有機(jī)合成化學(xué)方法、化學(xué)合成、化學(xué)分析以及藥物調(diào)配和傳遞。一般來(lái)說(shuō)，酶促反應(yīng)以 及純化和/或分離步驟是根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行的。技術(shù)和程序通常根據(jù)常規(guī)方法（分 子克?。∕olecular Cloning),實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（A Laboratory Manual),第3版，薩布魯克和 拉塞爾冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（Sambrook&Russel Cold Spring Harbor Laboratory Press) 編，冷泉港（Cold Spring Harbor),紐約（NY) ,2001)進(jìn)行。
[0078] 農(nóng)桿菌或細(xì)菌轉(zhuǎn)化：如所述領(lǐng)域中眾所周知，用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的農(nóng)桿菌一般為 根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes) 的去毒以及強(qiáng)毒性衍生物。感染植物、外植體、細(xì)胞或原生質(zhì)體后，單個(gè)農(nóng)桿菌病毒株（含 有包含TAL效應(yīng)子盒的雙運(yùn)載體和包含所關(guān)注基因的雙運(yùn)載體）或兩個(gè)單獨(dú)農(nóng)桿菌病毒 株（一個(gè)含有包含TAL效應(yīng)子盒的雙運(yùn)載體并且另一個(gè)含有包含所關(guān)注基因的雙運(yùn)載體） 將所要DNA區(qū)段從質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞核。載體通常含有位于T-DNA邊界之間的所 要多核苷酸。然而，可使用能夠轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的任何細(xì)菌，例如三葉草根瘤菌（Rhizobium trifolii)、碗豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum)、紫金牛葉桿菌（Phyllobacterium myrsinacearum)、苜蓿根瘤菌（SinoRhizobium meliloti)和百脈根根瘤菌（MesoRhizobium loti)。本發(fā)明不限于使用細(xì)菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。然而，含有適當(dāng)細(xì)胞機(jī)構(gòu)和蛋白質(zhì)的任何生物可 實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
[0079] 被子植物：種子封閉在子房中的維管植物。被子植物是產(chǎn)生帶有果實(shí)的花的種子 植物。被子植物分成雙子葉植物和單子葉植物。
[0080] 抗生素耐藥性：細(xì)胞在抗生素存在下存活的能力。如本文所用，抗生素耐藥性通過(guò) 在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗生素耐藥性基因而產(chǎn)生。細(xì)胞可具有針對(duì)任何抗生素的耐藥性。常用 抗生素的實(shí)例包括卡那霉素（kanamycin)和濕霉素（hygromycin)。
[0081] 雙子葉植物（Dicotyledonous plant)(雙子葉植物（dicot)):胚胎具有兩半種子 或子葉，分支葉脈并且花部分為四或五的倍數(shù)的開(kāi)花植物。雙子葉植物的實(shí)例包括（但不 限于）馬鈴薯、甜菜