、椰菜、木薯、甘薯、胡椒、一品紅、豆、苜蓿、大豆和鱷梨。
[0082]內(nèi)源性：從待轉(zhuǎn)化的植物或植物物種的基因組分離或從與待轉(zhuǎn)化的植物物種性相 容或可雜交的植物或物種分離的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子為所述 植物物種"原生"的，即原產(chǎn)的。
[0083]表達(dá)盒：多核苷酸從5'到3'可包含（a)第一啟動子，（b)包含⑴至少一個基因 或基因片段的拷貝或（ii)至少一個基因的啟動子片段的拷貝的序列，以及（c)終止子或在 與第一啟動子相反的方向中定位的第二啟動子。
[0084]外來：關(guān)于核酸的"外來"意味著所述核酸來源于非植物生物，或來源于物種與待 轉(zhuǎn)化的植物不同的植物，或不來源于不可與待轉(zhuǎn)化的植物雜交的植物，不屬于目標(biāo)植物的 物種。根據(jù)本發(fā)明，外來DNA或RNA表示真菌、細(xì)菌、病毒、哺乳動物、魚或鳥類的遺傳組成 中天然存在，但不在待轉(zhuǎn)化的植物中天然存在的核酸。因此，外來核酸為編碼例如并非由經(jīng) 轉(zhuǎn)化植物天然產(chǎn)生的多肽的核酸。外來核酸并非必需編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0085] 基因：基因?yàn)楹泻铣砂ň幋a和非編碼序列的產(chǎn)物、多肽鏈或RNA分子所需的 全部信息的DNA分子區(qū)段?；蜻€可以表示各自可獨(dú)立地表達(dá)并且可編碼略微不同但展現(xiàn) 相同功能活性的蛋白質(zhì)的多個序列。舉例來說，天冬酰胺合成酶1和2基因可共同稱為基 因。
[0086]遺傳元件："遺傳元件"為任何離散（discreet)核苷酸序列，例如（但不限于）啟 動子、基因、終止子、內(nèi)含子、強(qiáng)化子、間隔子、5' -未轉(zhuǎn)譯區(qū)、3' -未轉(zhuǎn)譯區(qū)或重組酶識別位 點(diǎn)。
[0087] 基因修飾：通過應(yīng)用分子和細(xì)胞生物學(xué)中的方法將DNA穩(wěn)定引入到特定生物的基 因組中。
[0088] 裸子植物：如本文所用，指的是帶有種子但無子房的種子植物。裸子植物的實(shí)例包 括針葉樹、蘇鐵科植物、銀杏樹和麻黃屬植物。
[0089]引入：如本文所用，指的是通過包括感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將核酸序列插 入到細(xì)胞中。
[0090]單子葉植物（Monocotyledonous plant)(單子葉植物（monocot)):胚胎具有一個 子葉（cotyledon或seed leaf)，平行葉脈并且花部分為三的倍數(shù)的開花植物。單子葉植物 的實(shí)例包括（但不限于）玉米、大米、燕麥、小麥、大麥和高粱。
[0091]原生：從待轉(zhuǎn)化的植物或植物物種的基因組分離或從與待轉(zhuǎn)化的植物物種性相容 或可雜交的植物或物種分離的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子為所述植 物物種"原生"的，即原產(chǎn)的。
[0092]原生DNA :從待轉(zhuǎn)化的植物或植物物種的基因組分離或從與待轉(zhuǎn)化的植物物種性 相容或可雜交的植物或物種分離的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子為所 述植物物種"原生"的，即原產(chǎn)的。換句話說，原生遺傳元件表示植物培育者可獲得的用于 通過傳統(tǒng)植物育種改良植物的全部遺傳材料。根據(jù)本發(fā)明，原生核酸的任何變異體也視為 "原生"。舉例來說，原生DNA可包含點(diǎn)突變，因?yàn)檫@類點(diǎn)突變是天然存在的。也可能通過采 用限制位點(diǎn)來連接兩種不同的原生DNA，因?yàn)檫@類位點(diǎn)在植物基因組中廣泛存在。
[0093] 原生核酸構(gòu)筑體：包含至少一個原生DNA的多核苷酸。
[0094] 可操作地連接：以使兩個或兩個以上分子在組合時在植物細(xì)胞中適當(dāng)?shù)氐钠鹱饔?的方式來對所述分子進(jìn)行組合。舉例來說，當(dāng)啟動子控制構(gòu)造基因的轉(zhuǎn)錄時，啟動子可操作 地連接于構(gòu)造基因。
[0095] 過度表達(dá)：以比對照植物中的表達(dá)程度高的程度表達(dá)基因。
[0096] P-DNA:本發(fā)明的植物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移-DNA( "P-DNA"）邊界序列與任何已知細(xì)菌產(chǎn) 生的T-DNA邊界序列的核苷酸序列不同，但其針對基本上相同的目的起作用。也就是說， P-DNA可用于將一個多核苷酸轉(zhuǎn)移和整合到另一個多核苷酸中。P-DNA可以插入到腫瘤誘 發(fā)質(zhì)粒（例如來自農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒）中來代替常規(guī)T-DNA，并且保持于細(xì)菌菌株中，就像 常規(guī)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒一樣?？梢詫-DNA進(jìn)行操控使其含有所要多核苷酸，其通過細(xì)菌介導(dǎo)的植 物轉(zhuǎn)化整合到植物基因組中。P-DNA包含至少一個邊界序列。參看羅門斯（Rommens)等 人.2005植物生理學(xué)（Plant Physiology) 139:1338-1349,其通過引用并入本文中。在本 發(fā)明的某些實(shí)施例中，T-DNA置換為P-DNA。
[0097]表型：表型是可以根據(jù)本發(fā)明通過將一或多個"所要多核苷酸"和/或可篩選/可 選標(biāo)記整合到經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的至少一個植物細(xì)胞的基因組中來改變的植物的區(qū)別特征或特 性。"所要多核苷酸"和/或標(biāo)記可以通過修飾經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物整體的許多基因、分 子、生物化學(xué)、生理學(xué)、形態(tài)或農(nóng)藝特性或?qū)傩灾械娜我徽叨x予經(jīng)轉(zhuǎn)化植物表型的改變。
[0098] 植物組織："植物"為植物界的多種光合作用真核多細(xì)胞生物中的任一者，通常產(chǎn) 生胚芽，含有葉綠體并且具有纖維素細(xì)胞壁。植物的一部分即"植物組織"，可以根據(jù)本發(fā) 明的方法處理產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。許多適合植物組織可以根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化并且包括（但不限 于）體細(xì)胞胚芽、花粉、葉、莖、愈傷組織、匍匐莖、微管和嫩枝。因此，本發(fā)明設(shè)想被子植物 和裸子植物的轉(zhuǎn)化，所述植物例如小麥、玉米、大米、大麥、燕麥、甜菜、馬鈴薯、番茄、苜蓿、 木薯、甘薯和大豆。根據(jù)本發(fā)明，"植物組織"還涵蓋植物細(xì)胞。植物細(xì)胞包括懸浮培養(yǎng)物、 愈傷組織、胚芽、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、嫩枝、配子體、孢子體、花粉、種子和花粉粒。 植物組織可處于成熟期的多個階段，并且可以在液體或固體培養(yǎng)物中，或在罐、溫室或曠野 中的土壤或適合培養(yǎng)基中生長。植物組織還指的是這類植物、種子、后代、有性或無性方式 產(chǎn)生的繁殖體以及任何這些的后裔（例如插條或種子）中的任何克隆。尤其受關(guān)注的是馬 鈴薯、玉米和小麥。
[0099] 植物轉(zhuǎn)化和細(xì)胞培養(yǎng)：大體上指的是植物細(xì)胞用以遺傳修飾并且轉(zhuǎn)移到適當(dāng)植物 培養(yǎng)基中以供維持、進(jìn)一步生長和/或進(jìn)一步發(fā)育的方法。這類方法也為熟練技術(shù)人員所 熟知的。
[0100] 處理：從⑴例如小麥、玉米、咖啡植物或可可樹的種子，⑵例如馬鈴薯的塊莖或 (3)例如甘薯和山藥的根制造食品的方法，包含加熱到至少120°C。處理食品的實(shí)例包括面 包、早餐谷物、派、蛋糕、吐司面包（toast)、餅干、甜餅、批薩、椒鹽卷餅、玉米粉圓餅、法式炸 薯?xiàng)l、烤薯?xiàng)l、馬鈴薯片、炸薯餅、烤制咖啡以及可可。
[0101] 后代：本發(fā)明的"后代"例如轉(zhuǎn)基因植物的后代，為源于、產(chǎn)生于或來源于植物或轉(zhuǎn) 基因植物的后代。因此，"后代"植物即"F1"代植物，為通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植 物的子代或后代。轉(zhuǎn)基因植物的后代的至少一個、一些或全部細(xì)胞基因組中可含有通過本 文所述的方法整合到親本轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞中的所要多核苷酸。因此，所要多核苷酸通過 后代植物"傳播"或"繼承"。后代植物中如此繼承的所要多核苷酸可存在于T-DNA或P-DNA 構(gòu)筑體內(nèi)，其也通過后代植物自其親本繼承。如本文所用，術(shù)語"后代"也可以認(rèn)為是植物 群組的子代或后代。
[0102] 啟動子：啟動子打算意味著結(jié)合RNA聚合酶和/或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的核酸，優(yōu)選 地DNA。啟動子為使與其關(guān)聯(lián)的基因能夠轉(zhuǎn)錄的核酸序列。調(diào)節(jié)區(qū)指的是影響和/或促進(jìn) 轉(zhuǎn)錄起始的核酸序列。啟動子通常視為包括調(diào)節(jié)區(qū)，例如強(qiáng)化子或誘導(dǎo)子元件。
[0103]真核啟動子通常位于其最直接關(guān)聯(lián)的基因的上游。啟動子可具有位于距離其轉(zhuǎn)錄 起始位點(diǎn)幾千個堿基處的調(diào)節(jié)元件，盡管通過轉(zhuǎn)錄復(fù)合的某些三級構(gòu)造形式可引起DNA折 疊，此使那些調(diào)節(jié)元件與實(shí)際轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)更接近。許多真核啟動子含有"TATA方框"序列，其 通常由核苷酸序列TATAAA表示。這一元件結(jié)合TATA結(jié)合蛋白，所述蛋白幫助形成RNA聚 合酶轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。TATA方框通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的50個堿基內(nèi)。
[0104] 真核啟動子的特征還在于存在某些結(jié)合參與形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié) 序列。實(shí)例為由序列CACGTG表示的E方框，其結(jié)合堿性-螺旋-環(huán)-螺旋家族中的轉(zhuǎn)錄因 子。還存在GC核苷酸含量高的區(qū)。
[0105] 多核苷酸可以在兩個不同方向中連接到啟動子。在一個方向中，例如"有義"，至少 所得RNA轉(zhuǎn)錄物的5' -部分將與至少一個目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的至少部分共享序列一致性。在表示 為"反義"的另一個方向中，所預(yù)測轉(zhuǎn)錄物的至少5'-部分將與至少一個目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的反向 互補(bǔ)序列的至少部分相同或同源。
[0106] 植物啟動子為能夠起始植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動子，不論其起源是否為植物細(xì) 胞。例示性植物啟動子包括（但不限于）獲自包含在植物細(xì)胞中表達(dá)的基因的植物、植物病 毒和細(xì)菌（例如農(nóng)桿菌屬或根瘤菌屬）的那些啟動子。在發(fā)育控制下的啟動子的實(shí)例包括 優(yōu)先起始在某些組織（例如木質(zhì)部、葉、根或種子）中的轉(zhuǎn)錄的啟動子。這類啟動子稱為組 織優(yōu)選啟動子。僅起始某些組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動子稱為組織特異性啟動子。細(xì)胞類型特異 性啟動子主要驅(qū)使一或多種器官中某些細(xì)胞類型（例如根或葉中的維管細(xì)胞）中的表達(dá)。 誘導(dǎo)型或抑制型啟動子為在環(huán)境對照下的啟動子?？梢酝ㄟ^誘導(dǎo)型啟動子實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的環(huán)境 條件的實(shí)例包括厭氧條件或存在光。組織特異性、組織優(yōu)選、細(xì)胞類型特異性以及誘導(dǎo)型啟 動子構(gòu)成非組成性啟動子的類別。組成性啟動子為在大多數(shù)環(huán)境條件下并且在大多數(shù)植物 部分中具有活性的啟動子。
[0107]多核苷酸為包含基因編碼序列或其片段（包含至少15個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選地至少 30個連續(xù)核苷酸和更佳至少50個連續(xù)核苷酸）、啟動子、內(nèi)含子、強(qiáng)化子區(qū)、聚腺苷酸化位 點(diǎn)、轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)、5'或3'未轉(zhuǎn)譯區(qū)、報告基因、可選標(biāo)記等的核苷酸序列。多核苷酸可包 含單股或雙股DNA或RNA。多核苷酸可包含經(jīng)修飾堿基或經(jīng)修飾骨架。多核苷酸可為染色 體組、RNA轉(zhuǎn)錄物（例如mRNA)或經(jīng)加工核苷酸序列（例如cDNA)。多核苷酸可包含有義或 反義方向的序列。
[0108] 經(jīng)分離多核苷酸為并非其原生態(tài)的多核苷酸序列，例如多核苷酸包含自然界中不 存在的核苷酸序列或多核苷酸與通常在其附近的核苷酸序列分隔開或緊鄰?fù)ǔ２辉谄涓?近的核苷酸序列。
[0109] 種子："種子"可視為含有胚芽以及植物的繁殖部分（如塊莖或孢子）的成熟植物 胚珠。種子可在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化之前，在暗處培育以例如促進(jìn)發(fā)芽。種子在培育之前還 可以例如通過用漂白劑短暫處理來滅菌。所得幼苗接著可暴露于所要農(nóng)桿菌病毒株。
[0110] 可選/可篩選標(biāo)記：如果在植物或植物組織中表達(dá)，那么可能與不表達(dá)所述基因 的其它植物或植物組織區(qū)分開的基因。篩選程序可能需要分析可篩選標(biāo)記基因編碼的蛋白 質(zhì)的表達(dá)?？蛇x標(biāo)記的實(shí)例包括耐除草劑基因，例如乙酰乳酸合成酶（ALS)、編碼卡那霉素 和遺傳霉素耐藥性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（Nptll)基因、編碼對濕霉素的耐藥性的濕霉素磷 酸轉(zhuǎn)移酶（Hptll)基因，或此項(xiàng)技術(shù)中已知的其它類似基因。
[0111] 感官特性：專業(yè)訓(xùn)練個體組可針對感官特性評價食物產(chǎn)品，例如外觀、風(fēng)味、氣味 和紋理。因此，本發(fā)明涵蓋從植物獲得的植物產(chǎn)品的感官特性的改良，所述植物已根據(jù)本發(fā) 明修飾以操控其塊莖產(chǎn)出產(chǎn)量。
[0112] 序列一致性：如本文所用，兩個核酸或多肽序列的情況中的"序列一致性"或"一 致性"包括涉及比對指定區(qū)的最大對應(yīng)關(guān)系時兩個序列中相同的殘基。如本文所用的同源 區(qū)或序列因此描述與目標(biāo)染色體組基因座共享一定程度的序列一致性的序列。當(dāng)使用序列 一致性百分比提及蛋白質(zhì)時，應(yīng)認(rèn)識到，不同的殘基位置的保守氨基酸取代通常不同，其中 氨基酸殘基經(jīng)具有類似化學(xué)特性（例如電荷或疏水性）的其它氨基酸殘基取代，并且因此 不改變分子的功能特性。如果序列的保守取代不同，那么可上調(diào)序列一致性百分比以校正 取代的保守性。這類保守取代不同的序列稱為具有"序列相似性"或"相似性"。做出這一 調(diào)整的方式為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。通常，此涉及對部分而非完全錯配的保守取代 進(jìn)行評分，由此提高序列一致性百分比。因此，舉例來說，如果相同氨基酸的評分為1并且 非保守取代的評分為零，那么保守取代的評分在零到1之間。例如根據(jù)邁爾（Meyers)和米 勒（Miller),計算機(jī)應(yīng)用生物科學(xué)（Computer Applic. Biol. Sci.) ,4:1117 (1988)的演算 法，例如如程序PC/GENE(program PC/GENE)(因特里遺傳學(xué)（Intelligenetics),山景城 (Mountain View),加利福尼亞（California), USA)中所執(zhí)行來計算保守取代的評分。
[0113] 如本文所用，序列一致性百分比意味著通過比較兩個最佳比對的序列的比較窗確 定的值，其中比較窗中的多核苷酸序列部分相較于用于最佳比對兩個序列的參考序列（其 不包含添加或缺失）可包含添加或缺失（即間隙）。通過測定兩個序列中存在的核酸堿基 或氨基酸殘基相同的位置數(shù)獲得匹配位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除以比較窗中的總位置數(shù)且將 結(jié)果乘以100獲得序列一致性百分比來計算百分比。
[0114] "序列一致性"具有本領(lǐng)域公認(rèn)的含義并且可使用公開的技術(shù)計算。參看 計算分子生物學(xué)（COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY)，萊斯克（Lesk)編.（牛津 大學(xué)出版社（Oxford University Press)，1988)，生物運(yùn)算：信息學(xué)和基因組項(xiàng)目 (BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS),史密斯（Smith)編?（學(xué)術(shù)出版 社（Academic Press), 1993)，序列數(shù)據(jù)的計算機(jī)分析（COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA)，第I部分（PART I)，格里芬（Griffin)和格里芬（Griffin)編，（胡馬納出版社 (Humana Press), 1994)，分子生物學(xué)中的序列分析（SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY)，馮衡杰（Von Heinje)編，學(xué)術(shù)出版社（1987)，序列分析引物（SEQUENCE ANALYSIS PRMER)，哥博斯科夫（Gribskov)和德弗羅（Devereux)編，（麥克米倫斯 托克頓出版社（Macmillan Stockton Press), 1991)以及卡里洛（Carillo)和李普頓 (Lipton)，工業(yè)與應(yīng)用數(shù)學(xué)協(xié)會 J?應(yīng)用數(shù)學(xué)（SIAM J. Applied Math.) 48:1073 (1988) 通常用于判斷兩個序列之間的一致性或相似性的方法包括（但不限于）大型計算機(jī)指 南（⑶IDE TO HUGE COMPUTERS)，畢曉普（Bishop)編，（學(xué)術(shù)出版社，1994)和上文 的卡里洛和李普頓中所披露的方法。測定一致性和相似性的方法編碼于計算機(jī)程序 中。測定兩個序列之間的一致性和相似性的優(yōu)選計算機(jī)程序法包括（但不限于）GCG程 序包（GCG program package)(德弗羅（Devereux)等人，核酸研宄（Nucleic Acids Research) 12:387 (1984))、81^51?、81^51隊(duì)？4514(阿特斯楚仏七8吐111)等人，分子生物學(xué) 雜志（J.Mol.Biol.)215 :403(1990))以及FASTDB (布魯特拉格（Brutlag)等人，計算機(jī)應(yīng) 用社會學(xué)（Comp. App. Biosci.) 6:237 (1990))。
[0115] 沉默：從啟動子到終止子的基因或基因片段的單向和未擾動轉(zhuǎn)錄可觸發(fā)目標(biāo) 基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的初始表達(dá)盒包含用于轉(zhuǎn)錄起始和終止 的調(diào)節(jié)序列之間定位于反義（麥考密克（McCormick)等人，美國專利（United States patent) 6617496 ;休梅克（Shewmaker)等人，美國專利5107065)或有義（范德克羅爾（van der Krol)等人，植物細(xì)胞（Plant Cell)2:291-299，1990)方向中的單個基因片段。在芥 菜屬（Arabidopsis)中，通過RNA依賴性RNA聚合酶識別所得轉(zhuǎn)錄物導(dǎo)致產(chǎn)生雙股（ds) RNA。通過Dicer類（Del)蛋白質(zhì)（例如Dcl4)裂解這一 dsRNA產(chǎn)生21核苷酸（nt)的小 干擾RNA(siRNA)。這些siRNA與包括Argonaute(Ago)家族成員的蛋白質(zhì)復(fù)合產(chǎn)生RNA誘 導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC)。RISC接著靶向同源RNA以進(jìn)行核酸內(nèi)切酶裂解。
[0116] 更有效沉默構(gòu)筑體含有有義和反義組分，產(chǎn)生回折成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA分 子（沃特豪斯（Waterhouse)等人，美國國家科學(xué)院院刊（Proc Natl Acad Sci U S A)95:13959-13964, 1998)。假設(shè)通過表達(dá)反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的高dsRNA含量提高多種 Del的活性。芥菜屬中的組合Del基因剔除的分析支持這一想法，并且還鑒別出Dcl4為一 種參與RNA裂解的蛋白質(zhì)。
[0117] 基于常規(guī)有義、反義和雙股（ds)RNA的基因沉默構(gòu)筑體的一個組分為轉(zhuǎn)錄終止 子。W0 2006/036739的全文通過引用并入本文中，其顯示