接供體 位點(diǎn)的下游超過約50-bp處。
[0182] (2)形成雙運(yùn)載體用于在植物細(xì)胞中短暫表達(dá)TAL效應(yīng)子。這一載體含有（a)單 個(gè)右邊界但無左邊界；(b)可操作地連接于強(qiáng)組成性啟動(dòng)子的兩個(gè)TAL效應(yīng)基因；以及（c) 參與細(xì)胞分裂素制造的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（ipt)基因的表達(dá)盒?？蛇x擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，因?yàn)槠鋵?導(dǎo)致整合全部載體并且因此產(chǎn)生過度表達(dá)細(xì)胞分裂素的矮化嫩枝，并且不能產(chǎn)生根。
[0183] (3)形成第二雙運(yùn)載體用于用包含來自馬鈴薯的遺傳元件的轉(zhuǎn)移DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化， 所述DNA由以下邊界劃定界限：（a)右邊界；(b)Ubi7啟動(dòng)子的內(nèi)含子的部分，從靶向TAL 結(jié)合位點(diǎn)之間的序列開始；（c)Ubi7單體編碼序列；（d)對(duì)至少一種選自包括以下的群組的 ALS抑制劑不敏感的經(jīng)修飾乙酰乳酸合成酶（ALS)基因：磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、氧 基苯甲酸嘧啶基酯和磺?；被驶蜻?；（e)泛素-3基因的終止子；（f)靶向天冬 酰胺合成酶l(Asnl)、多酚氧化酶（Ppo)和液泡轉(zhuǎn)化酶（Inv)基因的沉默盒；（g)晚疫病抗 性基因Vntl，其可操作地連接于其原生啟動(dòng)子和終止序列；以及（h)左邊界。除在大腸桿 菌和根癌農(nóng)桿菌中維持和選擇所需的序列之外，載體骨架含有ipt基因的表達(dá)盒。
[0184] (4)將兩種雙運(yùn)載體分別引入到根癌農(nóng)桿菌AGL-1病毒株中。
[0185] (5)馬鈴薯莖外植體用來自步驟⑷的兩種病毒株共同感染，并且接著共同栽培 兩天。
[0186] (6)將外植體轉(zhuǎn)移到含有殺死農(nóng)桿菌的選擇試劑的培養(yǎng)基中。
[0187] (7)轉(zhuǎn)化兩周后，再將外植體轉(zhuǎn)移到還含有ALS抑制劑的培養(yǎng)基中。
[0188] (8)在隨后三個(gè)月內(nèi)將由外植體產(chǎn)生的耐除草劑嫩枝轉(zhuǎn)移到根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并 且通過PCR分析Ubi7啟動(dòng)子與經(jīng)修飾ALS基因之間接點(diǎn)的存在。至少80%再生植物含有 這類接點(diǎn)。
[0189] (9)使PCR陽(yáng)性植物再生、繁殖和評(píng)估晚疫病抗性，塊莖中的天冬酰胺含量降低、 黑斑碰傷耐受性和低溫誘發(fā)的甜化降低。
[0190] 下文的實(shí)例描述所述方法的各方面。
[0191] 實(shí)例2:甲氧咪草煙殺滅曲線分析法
[0192] 為了測(cè)定殺滅未轉(zhuǎn)化馬鈴薯細(xì)胞所需的甲氧咪草煙的濃度，用雙運(yùn)載體PSM1331 轉(zhuǎn)化藍(lán)吉魯賽特節(jié)間莖外植體。這一載體含有（a)插入邊界之間的可選標(biāo)記基因nptll 的表達(dá)盒和（b)骨架中的ipt基因的表達(dá)盒。用于介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的病毒株為農(nóng)桿菌病毒株 LBA4404,其生長(zhǎng)到0D600為0. 2。在10分鐘接種期之后，將外植體轉(zhuǎn)移到共同培養(yǎng)基中并 且在過濾光下在24°C下置于I自西瓦爾生長(zhǎng)室（Percival growth chamber)中48小時(shí)。將 節(jié)間外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素特美汀但缺乏甲氧咪草煙的無激素的培養(yǎng)基（HFM)中。在 24°C和16小時(shí)光周期下將皮氏培養(yǎng)皿（Petri plate)置于珀西瓦爾生長(zhǎng)室中。
[0193] 兩周后，節(jié)間外植體轉(zhuǎn)移到含有特美汀和五種處理濃度（0、0.5、1.0、1.5和 2.Omg/1)的植物選擇除草劑甲氧咪草煙的HFM中。各處理由三次重復(fù)組成，每次重復(fù)每個(gè) 皮氏培養(yǎng)皿含有約20個(gè)節(jié)間外植體。在24°C和16小時(shí)光周期下將皮氏培養(yǎng)皿置于珀西 瓦爾生長(zhǎng)室中。節(jié)間外植體每2周傳代培養(yǎng)到含有各別處理濃度的甲氧咪草煙的新鮮HFM 中，促使嫩枝的任何再生并且減少任何農(nóng)桿菌過度生長(zhǎng)。
[0194] 結(jié)果指示少數(shù)節(jié)間外植體在所有甲氧咪草煙處理濃度中都展現(xiàn)一些Ipt分生愈 傷組織生長(zhǎng)和主要嫩枝形成。然而，任何甲氧咪草煙處理濃度中都產(chǎn)生了未完全發(fā)育的正 常嫩枝?；谶@些結(jié)果，確定2. Omg/1甲氧咪草煙為最佳體外選擇濃度。最佳濃度定義為 使細(xì)胞生長(zhǎng)到一定程度但不允許完全發(fā)育的嫩枝再生的選擇性試劑的濃度。
[0195] 共同培養(yǎng)基包括0. 444g/l具有岡堡維生素（Gamborg vitamins)的村重和史庫(kù) 格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Murashige&Skoog modified basal medium) (M404;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室 (PhytoTechnology Laboratories))、30g/1 鹿糖（S24060;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司（Research Products International Corp.))以及 6. 0g/l 瓊脂（S20400;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司），并且 具有pH 5. 7。
[0196] 無激素的培養(yǎng)基（HFM)包括4. 44g/l具有岡堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ) 培養(yǎng)基（M404 ;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、300mg/l特美 汀以及 2. 0g/l 吉爾贊（Gelzan) (G024 ;凱松（Caisson))，并且具有 pH 5. 7〇
[0197] 實(shí)例3:來自莖外植體的馬鈴薯植物的轉(zhuǎn)化和再生
[0198] 單一品系法
[0199] (1)使用在原培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的3-4周大的體外藍(lán)吉魯賽特馬鈴薯植物，所述培養(yǎng) 基包含2. 22g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M404;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn) 室）、15g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）和2. 0g/l吉爾贊（G024 ;凱松），pH 5. 7。
[0200] (2)去除葉和節(jié)切片并且分離節(jié)間莖部分。將節(jié)間莖部分切成3-5mm外植體切片 并且置于15mL MS液體培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有4. 44g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù) 格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M404 ;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）和30g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公 司），pH 5. 7。
[0201] (3)來源于單一菌落的農(nóng)桿菌（LBA4404)在28°C下，在震蕩培育箱中，在盧里亞培 養(yǎng)液（Luria Broth)中生長(zhǎng)隔夜，所述菌落含有雙運(yùn)載體TAL效應(yīng)子盒和雙運(yùn)載體所關(guān)注 基因盒。第二天，將細(xì)菌溶液球?；⑶以贛S液體培養(yǎng)基中再懸浮到0. 20D600。
[0202] (4)莖外植體在室溫下在細(xì)菌溶液中培育10分鐘，并且在無菌濾紙上印跡干燥以 去除過量細(xì)菌。
[0203] (5)在濾光下，將培植的莖外植體置于珀西瓦爾生長(zhǎng)室中的無選擇共同培養(yǎng)基 上48小時(shí)。共同培養(yǎng)基含有0. 444g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng) 基（M404 ;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）以及6. Og/1瓊脂 (S20400 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司），pH 5. 7。
[0204] (6)莖外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素（特美?。┎⑶覠o植物選擇的愈傷組織誘導(dǎo)激素 培養(yǎng)基（CIHM)或無激素的培養(yǎng)基（HFM)。在24°C下將皮氏培養(yǎng)皿置于使用16小時(shí)光周期 的珀西瓦爾生長(zhǎng)室中。CIHM含有4. 44g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng) 基（M404 ;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、2. 5mg/l玉米素核 糖苷、0? lmg/1 NAA、300mg/l特美汀和6. Og/1瓊脂（S20400;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司），pH 5. 7。 HFM含有4. 44g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M404;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn) 室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、300mg/l特美汀和2. Og/1吉爾贊（G024 ;凱 松），pH 5. 7。
[0205] (7)兩周后，莖外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素（特美汀）和植物選擇的愈傷組織誘導(dǎo)激 素培養(yǎng)基（CIHM)或無激素的培養(yǎng)基（HFM)。在24°C下將皮氏培養(yǎng)皿置于使用16小時(shí)光周 期的珀西瓦爾生長(zhǎng)室中。CIHM含有4. 44g/l具有岡堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ) 培養(yǎng)基（M404 ;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、2. 5mg/l玉米 素核糖苷、〇? lmg/1 NAA、300mg/l特美汀、2. Omg/1甲氧咪草煙和6. Og/1瓊脂（S20400;研 宄產(chǎn)品國(guó)際公司），pH 5. 7。HFM含有4. 44g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ) 培養(yǎng)基（M404 ;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、300mg/l特美 汀、2. Omg/1甲氧咪草煙以及2. Og/1吉爾贊（G024;凱松），pH 5. 7。
[0206] (8)轉(zhuǎn)化后四周，莖外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素（特美?。┖椭参镞x擇的發(fā)芽誘導(dǎo)激 素培養(yǎng)基（SIHM)或無激素的培養(yǎng)基（HFM)。在24°C下將皮氏培養(yǎng)皿置于使用16小時(shí)光周 期的珀西瓦爾生長(zhǎng)室中。莖外植體每2-4周傳代培養(yǎng)到新鮮SIHM或HFM中以促進(jìn)嫩枝完 全再生。SIHM含有4. 44g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M404;植 物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l鹿糖（S24060;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、2. 5mg/l玉米素核糖苷、0? 3mg/ 1 GA3、300mg/l特美汀、2. Omg/1甲氧咪草煙和6.Og/1瓊脂（S20400;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）， pH 5. 7。HFM含有4. 44g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M404;植物 技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l蔗糖（S24060;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、300mg/l特美汀、2. Omg/1甲氧咪 草煙以及2. Og/1吉爾贊（G024;凱松），pH 5. 7。
[0207] (9)對(duì)完全發(fā)育的嫩枝進(jìn)行繁殖用于將來測(cè)試和分析。
[0208] 實(shí)例4:來自莖外植體的馬鈴薯植物的轉(zhuǎn)化和再生
[0209]雙品系法
[0210] (1)使用在原培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的3-4周大的體外藍(lán)吉魯賽特馬鈴薯植物，所述培養(yǎng) 基含有2. 22g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M404;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn) 室）、15g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）和2. Og/1吉爾贊（G024 ;凱松），pH 5. 7。
[0211] (2)去除葉和節(jié)切片并且分離節(jié)間莖部分。將節(jié)間莖部分切成3-5mm外植體切片 并且置于15mL MS液體培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有4. 44g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù) 格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M404 ;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）和30g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公 司），pH 5. 7。
[0212] (3)兩種各自來源于單一菌落的各別農(nóng)桿菌品系（LBA4404)在28°C下，在震蕩培 育箱中，在盧里亞培養(yǎng)液中生長(zhǎng)隔夜，其中一種含有包含TAL效應(yīng)子盒的雙運(yùn)載體并且另 一種含有包含所關(guān)注基因盒的雙運(yùn)載體。第二天，將各各別細(xì)菌溶液球?；⑶以贛S液體 培養(yǎng)基中再懸浮到〇. 20D600。
[0213] (4)莖外植體在室溫下在由相等體積的各個(gè)別細(xì)菌溶液組成的單一組合細(xì)菌溶液 中培育10分鐘（共轉(zhuǎn)化），并且在無菌濾紙上印跡干燥以去除過量細(xì)菌。
[0214] (5)在濾光下，將培植的莖外植體置于珀西瓦爾生長(zhǎng)室中的無選擇共同培養(yǎng)基 上48小時(shí)。共同培養(yǎng)基含有0. 444g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng) 基（M404 ;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）以及6. Og/1瓊脂 (S20400 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司），pH 5. 7。
[0215] (6)莖外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素（特美?。┎⑶覠o植物選擇的愈傷組織誘導(dǎo)激素 培養(yǎng)基（CIHM)或無激素的培養(yǎng)基（HFM)。在24°C下將皮氏培養(yǎng)皿置于使用16小時(shí)光周期 的珀西瓦爾生長(zhǎng)室中。CIHM含有4. 44g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng) 基（M404 ;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、2. 5mg/l玉米素核 糖苷、0? lmg/1 NAA、300mg/l特美汀和6. Og/1瓊脂（S20400;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司），pH 5. 7。 HFM含有4. 44g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M404;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn) 室）、30g/l蔗糖（S24060;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、300mg/l特美汀和2. Og/1吉爾贊（G024;凱 松），pH 5. 7。
[0216] (7)兩周后，莖外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素（特美?。┖椭参镞x擇的愈傷組織誘導(dǎo)激 素培養(yǎng)基（CIHM)或無激素的培養(yǎng)基（HFM)。在24°C下將皮氏培養(yǎng)皿置于使用16小時(shí)光周 期的珀西瓦爾生長(zhǎng)室中。CIHM含有4. 44g/l具有岡堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ) 培養(yǎng)基（M404 ;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、2. 5mg/l玉米 素核糖苷、〇? lmg/1 NAA、300mg/l特美汀、2. Omg/1甲氧咪草煙和6. Og/1瓊脂（S20400;研 宄產(chǎn)品國(guó)際公司），pH 5. 7。HFM含有4. 44g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ) 培養(yǎng)基（M404 ;植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l蔗糖（S24060 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、300mg/l特美 汀、2. Omg/1甲氧咪草煙以及2. Og/1吉爾贊（G024;凱松），pH 5. 7。
[0217](8)轉(zhuǎn)化后四周，莖外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素（特美汀）和植物選擇的發(fā)芽誘導(dǎo)激 素培養(yǎng)基（SIHM)或無激素的培養(yǎng)基（HFM)。在24°C下將皮氏培養(yǎng)皿置于使用16小時(shí)光周 期的珀西瓦爾生長(zhǎng)室中。莖外植體每2-4周傳代培養(yǎng)到新鮮SIHM或HFM中以促進(jìn)嫩枝完 全再生。SIHM含有4. 44g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M404;植 物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l鹿糖（S24060;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、2. 5mg/l玉米素核糖苷、0? 3mg/ 1 GA3、300mg/l特美汀、2. Omg/1甲氧咪草煙和6. Og/1瓊脂（S20400 ;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）， pH 5. 7。HFM含有4. 44g/l具有閃堡維生素的村重和史庫(kù)格經(jīng)修飾基礎(chǔ)培養(yǎng)基（M404;植物 技術(shù)實(shí)驗(yàn)室）、30g/l蔗糖（S24060;研宄產(chǎn)品國(guó)際公司）、300mg/l特美汀、2. Omg/1甲氧咪 草煙和2. Og/1吉爾贊（G024 ;凱松），pH 5. 7。
[0218] (9)對(duì)完全發(fā)育的嫩枝進(jìn)行繁殖用于將來測(cè)試和分析。
[0219] 實(shí)例5:馬鈴薯藍(lán)吉、伯班克（Burbank)和阿特蘭替（Atlantic)栽培品種中的目 標(biāo)位點(diǎn)序列
[0220] 為了判斷不同馬鈴薯栽培品種之間的目標(biāo)區(qū)（Ubi7啟動(dòng)子內(nèi)含子的5'區(qū)）是否 保守，對(duì)引物對(duì)冊(cè)175?1和冊(cè)1751?1(5￡〇10勵(lì) ：1和5￡〇10勵(lì):2)進(jìn)行設(shè)計(jì)并且用于擴(kuò)增 來自馬鈴薯變種藍(lán)吉、伯班克和阿特蘭替的目標(biāo)區(qū)。擴(kuò)增片段克隆到pGEMT-easy載體中并 且定序。序列結(jié)果顯示所測(cè)試的全部變種的目標(biāo)區(qū)相同。ubi7啟動(dòng)子內(nèi)含子序列以SEQ ID NO:3為代表。
[0221] 實(shí)例6 :TAL效應(yīng)子的設(shè)計(jì)
[0222] TAL效應(yīng)子對(duì)經(jīng)設(shè)計(jì)以靶向所選區(qū)。正向和反向TALE識(shí)別位點(diǎn)分別列為SEQ ID NO:4和SEQ ID NO: 5。TALE骨架為Hax3,其為十字花科致病菌野油菜黃單胞假辣根變種 (Brassicaceae pathogen X.campestris pv.Armoraciae)病毒株 5 中鑒別出來的 AvrBs3 家族的成員。對(duì)此骨架作出的修飾包括：(a)截短初始Hax3的C端活化域；(b)在截短的 Hax3蛋白質(zhì)的N端添加來自SV40病毒的核定位序列；（c)對(duì)初始Hax3DNA序列進(jìn)行密碼子 優(yōu)化；（d)初始11. 5個(gè)重復(fù)可變雙殘基（RVD)置換為16. 5個(gè)對(duì)應(yīng)于目標(biāo)位點(diǎn)的RVD;(e) 在經(jīng)修飾Hax3骨架的C端添加Fokl核酸酶的催化域。
[0223] 效應(yīng)蛋白的組構(gòu)顯示于圖5中。最終正向和反向TALE的DNA和蛋白質(zhì)序列列為 SEQ ID N0:6、7、8 和 9。
[0224] 實(shí)例7:用于DNA轉(zhuǎn)移的載體
[0225] 轉(zhuǎn)移DNA由馬鈴薯產(chǎn)生的遺傳元件組成并且由T-DNA類邊界劃定界限。其從左邊 界到右邊界包括三個(gè)盒：（a)晚疫病抗性盒；(b)靶向三種基因的塊莖特異性沉默盒：參與 天冬酰胺形成的ASN1基因；與蔗糖的水解有關(guān)的酸性轉(zhuǎn)化酶（INV)基因；以及編碼碰撞碰 傷時(shí)氧化多酚的酶的多酚氧化酶（PP0)基因；以及（c)啟動(dòng)子較少的突變馬鈴薯乙酰乳酸 合成酶（ALS)基因（具有W563L和S642I取代），假設(shè)其在過度表達(dá)時(shí)賦予對(duì)ALS抑制除草 劑的耐藥性。
[0226] 轉(zhuǎn)移DNA經(jīng)設(shè)計(jì)以插入到位于馬鈴薯的四個(gè)Ubi7基因中的一者的前導(dǎo)序列內(nèi)的 內(nèi)含子區(qū)中，使得相關(guān)Ubi7啟動(dòng)子將驅(qū)動(dòng)ALS基因的表達(dá)并且賦予針對(duì)ALS抑制劑型除草 劑的耐藥性。
[0227] 因?yàn)閁bi7單體在蛋白質(zhì)穩(wěn)定中起重要作用，但前面是內(nèi)含子的部分的編碼序列 同框融合到ALS基因。將轉(zhuǎn)移DNA插入到雙運(yùn)載體中形成質(zhì)粒pSM2168。轉(zhuǎn)移DNA的組構(gòu) 在圖1中說明。野生型和突變ALS基因的DNA和蛋白質(zhì)序列由SEQ