ID N0:10、ll、12和13 表示。PSM2168中的全部轉(zhuǎn)移DNA序列由SEQ ID NO: 14表示。
[0228] 實例8:用于TAL效應子的載體
[0229] 各TAL效應子（正向或反向）由組成性（35s或FMV)啟動子和隨后終止子（Nos 或〇cs)驅(qū)動形成兩種各別植物表達盒。兩種盒克隆到雙運載體中形成PSIM2170,如圖2所 示。這一雙運載體僅具有一個邊界且含有ipt基因表達盒使得其可能針對穩(wěn)定整合效應基 因而選擇。
[0230] 實例9 :Ubi7內(nèi)含子5'區(qū)上游的右邊界支持DNA轉(zhuǎn)移
[0231] 因為邊界作為主要裂解位點的功效部分取決于側(cè)接DNA序列，所以測試Ubi7內(nèi)含 子5'區(qū)上游的右邊界支持DNA轉(zhuǎn)移的能力。為此目的，將包含在Ubi7單體上游的右邊界 /內(nèi)含子序列和經(jīng)修飾ALS基因的DNA片段克隆到雙運載體pSM123-F中形成pSM2164。 載體PSM123-F含有可選標記基因nptll的表達盒，但缺乏將這一盒轉(zhuǎn)移到植物細胞中所 需的邊界（參看圖3)。盡管如此，用攜帶pSIM2164的農(nóng)桿菌病毒株感染外植體使每個外植 體產(chǎn)生與陽性對照（用攜帶位于T-DNA邊界內(nèi)的nptll基因的病毒株感染）相同數(shù)目的耐 卡那霉素嫩枝。
[0232] 為了測試突變ALS基因賦予馬鈴薯以甲氧咪草煙耐藥性的效率，形成攜帶 Ubi7 ::ALS盒的載體（pSM2162,參看圖4)。用這一載體轉(zhuǎn)化獲得耐除草劑植物，通過PCR 確認所述植物含有Ubi7: :ALS盒。
[0233] 實例10 :針對本塞姆氏煙草中的短暫轉(zhuǎn)化的載體設(shè)計
[0234] 為了體內(nèi)測試特異性設(shè)計的TALE的效率，設(shè)計具有目標序列（Ubi7內(nèi)含子的部 分）的載體。這一載體PSIM2167與攜帶效應子的載體一起共轉(zhuǎn)化到本塞姆氏煙草中。如 圖6中所示，目標序列含有正向和反向識別位點，所述位點位于緊靠著GUS報告基因的起始 密碼子的下游處。在兩個識別序列之間并且與GUS編碼序列同框的終止密碼子使GUS編碼 序列不活化。如果TALE結(jié)合其經(jīng)設(shè)計的識別位點并且在中間序列中裂解，那么將預期隨后 的修復偶爾消除終止密碼子而不更改讀取范圍，因此恢復GUS功能。這類事件可以通過在 浸潤之后約4天，通過對本塞姆氏煙草葉進行組織化學染色來目測。
[0235]目標序列區(qū)也可以PCR擴增并且定序來鑒別TALE介導的突變。然而，目標序列 的直接PCR和克隆將產(chǎn)生未經(jīng)修飾的目標序列，因為轉(zhuǎn)化的效率可能較低。因此，經(jīng)分離 的DNA首先用Alul酶消化，所述酶裂解位于兩個TALE識別位點之間的AGCT限制位點。 擴增后，PCR產(chǎn)品再用Alul消化以進一步富集突變的目標序列用于下游克隆和定序分析。 FMV-目標-GUS-Nos盒的全部序列由SEQ ID N:15表示。用于擴增目標序列的PCR引物由 5￡〇10勵：16和5￡〇10勵：17表示。
[0236] 實例11:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和本塞姆氏煙草浸潤
[0237] 將經(jīng)設(shè)計的載體轉(zhuǎn)化成農(nóng)桿菌病毒株AGL1并且測試載體穩(wěn)定性。浸潤后四到六 天，收集來自浸潤組織的葉圓片用于⑶S染色分析和DNA分離。經(jīng)分離的DNA用Alul酶消 化并且用作用于目標區(qū)擴增以及進一步克隆和定序的模板。如圖7中所示，共同浸潤組織 (右圖）中觀測到⑶S染色，但單獨目標載體浸潤的組織（左圖）中未觀測到⑶S染色。圖 8中所示的其它序列分析也確認目標序列被TALE修飾。
[0238] 實例12 :穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的基因分型
[0239] 引物對HD208F1和R1經(jīng)設(shè)計以對耐除草劑轉(zhuǎn)化體進行基因分型。正向引物位于 Ubi7基因的啟動子區(qū)，并且反向引物位于ALS編碼區(qū)。引物對為靶向插入特異性引物，因為 僅當轉(zhuǎn)移DNA插入到設(shè)計的位置中時，引物對才會擴增片段。pSIM2170和pSIM2168的共轉(zhuǎn) 化產(chǎn)生的耐獨立除草劑品種的PCR分析確實擴增片段。這些片段被克隆和定序。如圖9中 所示，在一個品種（TALE1)中，片段含有轉(zhuǎn)移DNA盒的部分，其包括通過馬鈴薯基因組序列 側(cè)接的部分Ubi7內(nèi)含子、Ubi7單體和ALS編碼區(qū)的部分。序列blast顯示側(cè)接的馬鈴薯 基因組為位于染色體7上的Ubi7類基因的啟動子區(qū)，染色體7也含有非常類似的經(jīng)設(shè)計的 TALE的識別位點。在另外兩個品種TALE2和TALE3中，轉(zhuǎn)移DNA盒插入到與TALE1中相同 的染色體組基因座中，但轉(zhuǎn)移DNA盒的內(nèi)含子部分大部分缺失。TALE2和TALE3品種非常相 似，但TALE2中的Ubi7單體中有9bp缺失。
[0240] 實例13 :用于靶向插入的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化品種的表征
[0241] 上文所述的數(shù)據(jù)和結(jié)果指示預期DNA區(qū)段的靶向插入是成功的。將來自pSIM2170 和PSIM2168的共轉(zhuǎn)化的耐除草劑藍吉魯賽特（RR)品種繁殖和轉(zhuǎn)移到土壤中用于隨后測試 /分析。具體來說，通過測定酶多酚氧化酶的活性，并且對沉默盒和Vntl盒的拷貝數(shù)進行南 方分析，測試經(jīng)轉(zhuǎn)化品種對晚疫病攻擊的抗性。對于疾病分析，在土壤中持續(xù)三周的小植株 用致病疫霉晚疫病病毒株US8BF6接種產(chǎn)生疾病癥狀。對于南方墨點分析，通過Hindlll限 制酶消化從葉組織分離的3 yg DNA，在0.7%瓊脂糖凝膠上跑膠，轉(zhuǎn)移到帶正電的尼龍膜上 并且針對沉默盒中的轉(zhuǎn)化酶片段或Vntl表達盒中的Vntl啟動子與Dig標記的探針雜交。 下表1中鑒別和概括了四個品種。這些品種是晚疫病抗性品種（參看圖11)并且具有兩個 盒的單一拷貝（參看圖12)。品種RR-36和RR-39中的每個額外段與RR對照品種比較，表 明存在單個轉(zhuǎn)基因拷貝。（品種RR-26和RR-32的數(shù)據(jù)未顯示）。
[0242] 表1:靶向插入的品種表征。
[0245] 實例14 :用于靶向插入的經(jīng)轉(zhuǎn)化品種的田間試驗評估
[0246] 在復制田間試驗中種植用PSM2170和pSM2168共轉(zhuǎn)化的藍吉魯賽特（RR)和斯 諾登（SN)小植株。評估各植物品種的性質(zhì)功效和產(chǎn)量。斯諾登品種2、15、55和83(參看 圖13)以及藍吉品種26、32、38和39(參看圖15)的馬鈴薯塊莖中的天冬酰胺沉默非常均 勾。此外，相同SN品種（參看圖14)和RR品種（參看圖16)也具有非常均勻的多酚氧化酶 (PP0)沉默。這些結(jié)果指示目標位點允許均勻并且高度表達沉默盒。上述SN和RR品種的 產(chǎn)量（參看圖17)與野生型（WT)和空白載體對照物（2162、2370)相比時無顯著不同。此 結(jié)果表明靶向插入位點對產(chǎn)量潛力不具有負面影響。
[0247] 實例15 :CAS9介導的靶向轉(zhuǎn)移DNA插入
[0248] 除轉(zhuǎn)錄活化子類效應子核酸酶（TALEN)之外，存在可將DSB引入到目標DNA序 列中的基于其它核酸內(nèi)切酶的基因組編輯酶，例如大范圍核酸酶（埃必那等人，2003)、 鋅指核酸酶（ZFN)(波蒂厄斯和巴爾的摩（Baltimore)，2003)、（博格丹弗和福亞塔 斯，2011)和CRISPR相關(guān)（Cas)核酸內(nèi)切酶（季聶克等人，2012 ;墨索里尼，C.和凱瑟曼 (Cathomen) 2013)。產(chǎn)生DSB后，植物DNA修復機制將通過非同源末端連接（NHEJ)路徑修 復斷裂，其不精確并且產(chǎn)生突變以實現(xiàn)基因剔除；或通過同源重組（HR)路徑實現(xiàn)基因靶向 (基因置換或插入）（賽明頓（Symington)和戈蒂埃（Gautier) 2011)。因此，我們的基于 TALEN的DNA整合中使用的類似策略可轉(zhuǎn)移到基于其它核酸酶的基因組編輯工具中。舉例 來說，我們在此處顯示工程改造的CAS9核酸內(nèi)切酶可改良我們的Ubi7內(nèi)含子DNA目標。
[0249] Cas9基因組編輯技術(shù)使用含有20bp目標特異性序列的小嵌合RNA和小RNA骨架 以引導Cas9核酸酶裂解目標。構(gòu)筑體pSM4187經(jīng)設(shè)計以含有兩個表達盒（圖18)。第一 個為CAS9核酸酶表達盒。植物密碼子優(yōu)化Cas9由組成性FMV啟動子驅(qū)動并且在蛋白質(zhì)的 N端添加來自SV40病毒的核定位序列。工程改造Cas9的DNA和氨基酸序列分別列為SEQ ID No: 18和SEQ ID No: 19。第二個盒在組成性35S啟動子控制下在植物細胞中轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生 引導RNA。引導RNA的序列列為SEQ ID N0:20。經(jīng)設(shè)計的載體pSM4187轉(zhuǎn)化成農(nóng)桿菌病 毒株AGL1并且檢驗載體穩(wěn)定性。接著，使用含有pSM4187的農(nóng)桿菌與含有質(zhì)粒pSIM2167 的農(nóng)桿菌共同浸潤本塞姆氏煙草，含有質(zhì)粒PSIM2167的農(nóng)桿菌為含有前述實例中所述的 Ubi7內(nèi)含子目標的構(gòu)筑體。浸潤后二到四天，收集來自浸潤組織的葉圓片用于GUS染色分 析和DNA分離。經(jīng)分離的DNA用Alul酶消化并且用作用于目標區(qū)擴增以及進一步克隆和 定序的模板。如圖19中所示，共同浸潤組織（右圖）中觀測到GUS染色，但單獨目標載體 浸潤的組織（左圖）中未觀測到GUS染色。圖20中所示的其它序列分析確認目標序列被 Cas9修飾。所述修飾與經(jīng)設(shè)計的TALEN誘導的修飾非常類似。
[0250] 序列表
[0251]
[0252]
[0253]
[0254]
[0255]
[0256]
[0257]
[0258]
[0259]
[0260]
【主權(quán)項】
1. 一種將所要多核苷酸穩(wěn)定整合到植物基因組中的方法，其包含 (A) 用包含編碼TAL蛋白質(zhì)的核苷酸序列的第一載體轉(zhuǎn)化植物材料，所述核苷酸序列 經(jīng)設(shè)計以識別目標序列； (B) 用第二載體轉(zhuǎn)化所述植物材料，所述第二載體包含（i)標記基因，其未可操作地連 接于啟動子（"無啟動子的標記盒"）且其包含與所述目標序列同源的序列；以及（ii)所要 多核苷酸；以及 (C) 鑒別所述所要多核苷酸經(jīng)穩(wěn)定整合的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物材料。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物材料暴露于反映所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植 物中存在或不存在所述標記基因的條件。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述標記基因為耐除草劑基因且所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物 材料暴露于除草劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述耐除草劑基因為ALS基因。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述無啟動子的標記盒穩(wěn)定整合到所述植物基因 組中。6. -種將外源性DNA靶向插入到植物中的方法，其包含以下步驟：（i)用以下轉(zhuǎn)化經(jīng)分 離的植物細胞 (A) 包含啟動子較少的盒的第一雙運載體，所述載體包含（a)連接到（b)Ubi7內(nèi)含子 5'-未轉(zhuǎn)譯區(qū)的部分序列的右邊界序列；（c)融合到突變乙酰乳酸合成酶ALS基因的Ubi7 單體編碼序列；（d)所要核苷酸序列；以及（e)終止序列，其中所述所要核苷酸序列未可操 作地連接于啟動子；以及 (B) 第二雙運載體，其包含（a)右邊界；(b)正向表達盒和反向表達盒，其各自包含可操 作地連接于強組成性啟動子和終止序列的經(jīng)修飾TAL效應子；以及（c)編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移 酶ipt的序列，其中所述經(jīng)修飾TAL效應子經(jīng)設(shè)計以結(jié)合馬鈴薯的泛素-7 Ubi7基因的內(nèi) 含子內(nèi)的所述所要核苷酸序列； 以及（ii)在促進表達所述所要核苷酸序列的植物生長的條件下培養(yǎng)經(jīng)分離的植物細 胞；其中載體骨架DNA未永久地插入到所述植物基因組中。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述經(jīng)修飾TAL效應子包含（a)包含F(xiàn)okl核酸 內(nèi)切酶催化域的截短C端活化域；(b)密碼子優(yōu)化的目標序列結(jié)合域，其包含16. 5個對應 于所述Ubi7 5'-未轉(zhuǎn)譯內(nèi)含子序列的重復可變雙殘基；以及（c)包含SV40核定位序列的 N端區(qū)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述所要核苷酸序列為靶向一或多種基因的沉默 盒，所述基因選自由天冬酰胺合成酶I AsnU多酚氧化酶Ppo和液泡轉(zhuǎn)化酶Inv基因組成的 群組。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第一雙運載體另外包含晚疫病抗性基因 Vntl，所述基因可操作地連接于其原生啟動子和終止序列。10. -種經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其基因組中包含可操作地連接于所要外源性核苷酸序列的內(nèi)源 性Ubi7啟動子，所述外源性核苷酸序列可操作地連接于外源性終止序列。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其中一或多種選自由天冬酰胺合成酶1 AsnU多酚氧化酶Ppo和液泡轉(zhuǎn)化酶Inv基因組成的群組的基因的表達下調(diào)。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物另外表達晚疫病抗性基因 Vntl013. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物為具有塊莖的植物。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其中所述具有塊莖的植物為馬鈴薯植物。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物具有由以下中的一或多者表征 的表型：晚疫病抗性、黑斑碰傷耐受性、降低的低溫誘發(fā)甜化和其塊莖中降低的天冬酰胺含 量。16. -種根據(jù)權(quán)利要求15所述的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的熱加工產(chǎn)品。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的熱加工產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品為法式炸薯條、薯片、脆片、馬 鈴薯、脫水馬鈴薯或烤馬鈴薯。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的熱加工產(chǎn)品，其中所述熱加工產(chǎn)品的丙烯酰胺含量低于相 同物種的非轉(zhuǎn)化植物的熱加工產(chǎn)品。19. 一種經(jīng)設(shè)計以結(jié)合到所要序列的經(jīng)修飾TAL效應子，其包含（a)包含催化域的截短 C端活化域；(b)密碼子優(yōu)化的目標序列結(jié)合域；以及（c)包含核定位序列的N端區(qū)。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的經(jīng)修飾TAL效應子，其中所述經(jīng)修飾TAL效應子經(jīng)設(shè)計以 結(jié)合馬鈴薯的泛素-7 Ubi7基因的內(nèi)含子內(nèi)的所述所要序列。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的經(jīng)修飾TAL效應子，其中（a)所述C端活化域中的所述催 化域包含F(xiàn)okl核酸內(nèi)切酶；(b)所述目標序列結(jié)合域包含16. 5個對應于所述Ubi7 5'-未 轉(zhuǎn)譯內(nèi)含子序列的重復可變雙殘基；以及（c)所述N端區(qū)中的所述核定位序列為SV40核定 位序列。22. -種雙運載體，其包含（a)右邊界；(b)正向表達盒和反向表達盒，其各自包含可操 作地連接于強組成性啟動子和終止序列的根據(jù)權(quán)利要求16所述的經(jīng)修飾TAL效應子；以及 (c)編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移酶ipt的序列。23. -種包含啟動子較少的盒的DNA構(gòu)筑體，其包含（a)連接到（b)部分Ubi7 5'-未 轉(zhuǎn)譯內(nèi)含子序列的右邊界序列；（c)融合到突變乙酰乳酸合成酶ALS基因的Ubi7單體編碼 序列；（d)所要核苷酸序列；（e)終止序列；以及（f)左邊界，其中所述所要核苷酸序列未可 操作地連接于啟動子。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述所要核苷酸序列為靶向一或多種基 因的沉默盒，所述基因選自由天冬酰胺合成酶I Asnl、多酚氧化酶Ppo和液泡轉(zhuǎn)化酶Inv基 因組成的群組。25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述DNA構(gòu)筑體另外包含晚疫病抗性基 因Vntl，所述基因可操作地連接于其原生啟動子和終止序列。26. -種用于將外源性DNA靶向插入到植物中的試劑盒，其包含： (A) 包含啟動子較少的盒的第一雙運載體，所述載體包含（a)連接到（b)Ubi7內(nèi)含子 5'-未轉(zhuǎn)譯區(qū)的部分序列的右邊界序列；（c)融合到突變乙酰乳酸合成酶ALS基因的Ubi7 單體編碼序列；（d)所要核苷酸序列；以及（e)終止序列，其中所述所要核苷酸序列未可操 作地連接于啟動子；以及 (B) 第二雙運載體，其包含（a)右邊界；(b)正向表達盒和反向表達盒，其各自包含可操 作地連接于強組成性啟動子和終止序列的經(jīng)修飾TAL效應子；以及（c)編碼異戊烯基轉(zhuǎn)移 酶ipt的序列，其中所述經(jīng)修飾TAL效應子經(jīng)設(shè)計以結(jié)合馬鈴薯的泛素-7 Ubi7基因的內(nèi) 含子內(nèi)的所述所要核苷酸序列。27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中所述經(jīng)修飾TAL效應子包含（a)包含F(xiàn)okl核 酸內(nèi)切酶催化域的截短C端活化域；(b)密碼子優(yōu)化的目標序列結(jié)合域，其包含16. 5個對 應于所述Ubi7 5'-未轉(zhuǎn)譯內(nèi)含子序列的重復可變雙殘基；以及（c)包含SV40核定位序列 的N端區(qū)。28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述所要核苷酸序列為靶向一或多種基因的 沉默盒，所述基因選自由天冬酰胺合成酶I Asnl、多酚氧化酶Ppo和液泡轉(zhuǎn)化酶Inv基因組 成的群組。29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的試劑盒，其中所述第一雙運載體另外包含晚疫病抗性基因 Vntl，所述基因可操作地連接于其原生啟動子和終止序列。
【專利摘要】本發(fā)明涉及將所要多核苷酸穩(wěn)定整合到植物基因組中的方法，其包含用包含編碼TAL蛋白質(zhì)的核苷酸序列的第一載體轉(zhuǎn)化植物材料，所述核苷酸序列經(jīng)設(shè)計以識別目標序列；用第二載體轉(zhuǎn)化所述植物材料，所述第二載體包含(i)標記基因，其未可操作地連接于啟動子(“無啟動子的標記盒”)且其包含與所述目標序列同源的序列；以及(ii)所要多核苷酸；以及鑒別所述所要多核苷酸經(jīng)穩(wěn)定整合的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物材料。
【IPC分類】C12N15/82
【公開號】CN104884626
【申請?zhí)枴緾N201380066411
【發(fā)明人】C·M·羅門思, 段輝, T·J·威克斯
【申請人】杰.爾.辛普洛公司
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2013年11月19日
【公告號】CA2891956A1, EP2922959A1, US20140154397, WO2014081729A1