專利名稱:一種由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法及其所用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法及其所用培養(yǎng)基，具體而言是指利用黑曲霉(Aspergillus niger)XZ_3S菌株曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的新工藝。
背景技術(shù)：
木聚糖是一種雜合多聚分子，主鏈由多個(gè)吡喃木糖基通過(guò)木 糖苷鍵相連。根據(jù)糖苷鍵的類型，木聚糖可分為兩種，β-1，4-木聚糖和β-1，3-木聚糖。前者存在于陸生植物細(xì)胞壁中，它的主鏈?zhǔn)怯搔?I，4-糖苷鍵相連的β-D-卩比喃木糖殘基聚合而成；而后者存在于海洋藻類的細(xì)胞壁中，其主鏈由β-D-吡喃木糖殘基通過(guò)β-1，3-糖苷鍵聚合而成。自然界中的木聚糖多為異聚多糖，側(cè)鏈上連著多種不同大小的短取代基，主要有O-乙?；?-0-甲基-D-葡糖醛酸殘基、L-阿拉伯糖殘基(可進(jìn)一步與香豆酸、阿魏酸等酚酸相連)等。這些側(cè)鏈與植物細(xì)胞中其它幾種結(jié)構(gòu)性多糖(如木質(zhì)素、纖維素、果膠、葡聚糖等)以共價(jià)或非共價(jià)鍵連接，組成植物細(xì)胞重要的結(jié)構(gòu)-細(xì)胞壁。
木聚糖酶(Xylanases)是一類在木聚糖降解過(guò)程中起協(xié)同作用的多組分酶系，屬于半纖維素酶類，通常指β-I，4-D-木聚糖內(nèi)切酶(β -l,4-D-endoxylanase,EC3. 2.1.8),能從木聚糖主鏈的內(nèi)部水解木糖苷鍵，將其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖。木聚糖酶在食品、動(dòng)物飼料、造紙等眾多行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景，研究木聚糖酶具有很好的商業(yè)價(jià)值和科學(xué)意義。
木聚糖酶在自然界分布很廣，在海洋及陸地細(xì)菌、海洋藻類、真菌、酵母、瘤胃和反芻動(dòng)物細(xì)菌、蝸牛、甲殼動(dòng)物、陸地植物組織和各種無(wú)脊椎動(dòng)物中都存在木聚糖酶。研究較多的是微生物產(chǎn)生的木聚糖酶，已報(bào)道能合成木聚糖酶的微生物有細(xì)菌、放線菌、真菌和酵母菌等。目前研究最為深入、應(yīng)用最為廣泛的是真菌中的曲霉、青霉和木霉，它們所產(chǎn)木聚糖酶多為酸性或中性酶。近年來(lái)，人們從一些極端環(huán)境中篩選到一些耐熱菌或耐堿菌，其所產(chǎn)的耐熱性或耐堿性木聚糖酶已引起人們的關(guān)注。同時(shí)，某些人工構(gòu)建的木聚糖酶基因工程菌株，由于其產(chǎn)木聚糖酶活性高、酶系純、酶學(xué)性質(zhì)符合人們?cè)O(shè)定的應(yīng)用要求，也已得到了廣泛應(yīng)用。
侯伯男等利用黑曲霉(Aspergillus niger)N86菌株,液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶,酶活力達(dá)139IU/mL ;程顯好等利用短小芽孢桿菌，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活性為4915IU/g干曲；符丹丹等利用宇佐美曲霉EOOl菌株，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活性為7442IU/g。鄔敏辰等在發(fā)明專利《一種利用宇佐美曲霉產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)木聚糖酶的方法》，公開號(hào)CN101067129中報(bào)道了利用宇佐美曲霉產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)木聚糖酶的方法，木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵酶活性為7783 9616IU/g干曲。
目前，無(wú)論是液體發(fā)酵法還是固態(tài)發(fā)酵法，微生物產(chǎn)木聚糖酶活性均較低，導(dǎo)致了木聚糖酶的生產(chǎn)和應(yīng)用成本高，從而限制了該酶的廣泛應(yīng)用；且未見(jiàn)利用黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。本發(fā)明利用黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的酶活性高于目前國(guó)內(nèi)水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開了一種由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于公開了由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶所使用的培養(yǎng)基。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其中，所述方法是以黑曲霉XZ-3S 為原料，在曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，獲得發(fā)酵曲料后對(duì)發(fā)酵曲料用緩沖液進(jìn)行提取，獲得木聚糖酶液；所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為φ20 cmx4 cm曲盤裝IOOg基料，(NH4)2SO4O. 5 I. 5g，蛋白胨 O. 5 lg, KH2PO4O. 3 O. 4g, CaCl2O. 2 O. 3g, ZnCl2O. I O. 2g, MgSO4O. I O. 2g, Fe2 (SO4) 30· 02 O. 08g,吐溫 400. 4 O. 8g,自來(lái)水 120 140mL,自然PH，其中基料的組成為麩皮50 80g，玉米芯10 40g，豆餅粉10 20g。
上述技術(shù)方案所述的由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其中，所述固體發(fā)酵的條件為曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基121°C滅菌40min，冷卻后接種IOmL黑曲霉XZ-3S麩曲孢子懸液，該懸液中孢子濃度為5X IO7個(gè)/mL，29°C靜置培養(yǎng)65 72h，期間分別于24 28h和43 47h補(bǔ)水20mL時(shí)各翻曲一次。
上述技術(shù)方案所述的由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其中，所述緩沖液為O. 05mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。
上述技術(shù)方案所述的由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其中，對(duì)發(fā)酵曲料用緩沖液進(jìn)行提取的過(guò)程為稱取發(fā)酵曲料lg，加入29mL pH4. 0,0. 05mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，40°C條件下浸提30min，濾紙過(guò)濾，所得濾液即為木聚糖酶液。
一種由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，包括下述步驟
(I)、斜面種子培養(yǎng)去皮馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂20g/L，ρΗ6· O ;121°C滅菌20min，放置試管斜面；冷卻后接種黑曲霉XZ-3S菌株，30°C培養(yǎng)96h ；
(2)、麩曲種子制備250mL三角瓶裝IOg基料、(NH4)2S0480mg、自來(lái)水10mL、pH6. 0，充分混勻，121°C滅菌40min，冷卻后接種步驟(I)所得的黑曲霉XZ-3S試管斜面種子，30°C靜置培養(yǎng)96h,期間分別于24h和44h各翻曲一次,所述基料為麩皮；
(3)、麩曲孢子懸液制備100mL三角瓶裝20mL去離子水，放入10-15粒玻璃珠，121°C滅菌20min，放置室溫后，接入I接種鏟麩曲種子，先用玻璃珠振蕩分散，然后再用脫脂棉過(guò)濾，調(diào)整孢子濃度為5 X IO7個(gè)/mL ；
(4)、曲盤發(fā)酵曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基121°C滅菌40min，冷卻后接種IOmL黑曲霉XZ-3S麩曲孢子懸液，該懸液中孢子濃度為5乂107個(gè)/1^，291靜置培養(yǎng)65 72h，期間分別于24 28h和43 47h補(bǔ)水20mL時(shí)各翻曲一次；所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為φ20 cmx4cm曲盤裝 IOOg 基料、(NH4)2SO4O. 5 I. 5g、蛋白胨 O. 5 lg、KH2PO4O. 3 O. 4g、CaCl2O. 2 O. 3g、ZnCl20. I O. 2g、MgS040. I O. 2g、Fe2 (SO4) 30· 02 O. 08g、吐溫 400. 4 O. 8g、自來(lái)水120 140mL，自然pH，其中基料的組成為麩皮50 80g，玉米芯10 40g，豆餅粉10 20g；[0019](5)、粗酶液提取曲盤發(fā)酵結(jié)束后稱取發(fā)酵曲料lg，加入29mL pH4. 0,0. 05mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，40°C條件下浸提30min，濾紙過(guò)濾，所得濾液即為木聚糖酶液。
上述技術(shù)方案所述的一種由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其中，所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為φ20 cmX4 cm曲盤裝IOOg基料、(NH4)2S04lg、蛋白胨O. 5g、KH2PO4O. 3g、CaCl2O. 2g、ZnCl2O. lg、MgSO4O. I、Fe2(SO4)3O. 02g、吐溫 400. 4g、自來(lái)水 140mL,自然pH，其中基料的組成為麩皮50g，玉米芯40g，豆餅粉10g。
上述任一技術(shù)方案所述的一種由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法所使用的曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，所述所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為φ20 cmx4 cm曲盤裝IOOg基料、(NH4)2SO4O. 5 I. 5g、蛋白胨 O. 5 lg、KH2PO4O. 3 O. 4g、CaCl2O. 2 O. 3g、ZnCl2O. I O. 2g、MgS040. I O. 2g、Fe2 (SO4)3O. 02 O. 08g、吐溫 400. 4 O. 8g、自來(lái)水 120 140mL,自然PH，其中基料的組成為麩皮50 80g，玉米芯10 40g，豆餅粉10 20g。
上述技術(shù)方案所述的曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成 為 Φ 20cmX 4cm 曲盤裝 IOOg 基料、(NH4)2SO4Ig' 蛋白胨 O. 5g、KH2PO4O. 3g、CaCl2O. 2g、ZnCl2O. lg、MgS040. UFe2(SO4) 30. 02g、吐溫 400. 4g、自來(lái)水 140mL,自然 pH，其中基料的組成為麩皮50g，玉米芯40g，豆餅粉10g。
上述技術(shù)方案所述的曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為 Φ 20cmX 4cm 曲盤裝 IOOg 基料、(NH4)2SO4Ig' 蛋白胨 O. 5g、KH2PO4O. 3g、CaCl2O. 2g、ZnCl2O. lg、MgSO4O. lg、Fe2(SO4)3O. 02g、吐溫 400. 4g、自來(lái)水 140mL,自然 pH，其中基料的組成為麩皮80g，玉米芯10g，豆餅粉IOg
上述技術(shù)方案所述的曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為 Φ 20cmX 4cm 曲盤裝 IOOg 基料、(NH4)2SO4Ig' 蛋白胨 O. 5g、KH2PO4O. 3g、CaCl2O. 2g、ZnCl2O. lg、MgSO4O. lg、Fe2(SO4)3O. 02g、吐溫 400. 4g、自來(lái)水 120mL,自然 pH，其中基料的組成為麩皮80g，玉米芯10g，豆餅粉10g。
本發(fā)明的目的是提供一種以麩皮、玉米芯、豆餅粉等農(nóng)副產(chǎn)品為發(fā)酵基料，利用黑曲霉XZ-3S曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法。本發(fā)明所述曲盤發(fā)酵的技術(shù)方案和內(nèi)容如下
I、菌株黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S菌株，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院篩選和保藏,該菌株已于2012年在《食品工業(yè)科技》雜志的Vol. 33No. 16Pg. 187公開，本發(fā)明人和申請(qǐng)人承諾該菌株從申請(qǐng)日起20年內(nèi)向公眾發(fā)放，公眾可以通過(guò)聯(lián)系新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院發(fā)酵與酶工程研究室獲得凍干保藏的菌種。
黑曲霉XZ-3S菌株的菌學(xué)特征如下黑曲霉XZ-3S菌株屬半知菌亞門真菌；菌落初白色，后變黑；分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長(zhǎng)短不一；頂囊球形，雙層小梗；分生孢子褐色球形；生長(zhǎng)適溫37°C，最低相對(duì)濕度為88% ;黑曲霉具有在培養(yǎng)過(guò)程中孢子聚集或萌發(fā)成菌絲，菌絲相互纏繞成球的特征。
2、斜面種子培養(yǎng)去皮馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂20g/L，pH6. O ;121°C滅菌20min，放置試管斜面；冷卻后接種黑曲霉XZ-3S菌株，30°C培養(yǎng)96h。此斜面培養(yǎng)基可用于菌種的活化、保藏和斜面種子等，每3個(gè)月轉(zhuǎn)接I次。
3、麩曲種子制備:250mL三角瓶裝IOg基料(麩皮10g)，(NH4)2S0480mg,自來(lái)水IOmL, pH6. 0，充分混勻，121°C滅菌40min，冷卻后接種黑曲霉XZ-3S試管斜面種子，30°C靜置培養(yǎng)96h,期間分別于24h和44h各翻曲一次。[0030]4、麩曲孢子懸液制備100mL三角瓶裝20mL去離子水，放入10-15粒玻璃珠，121°C滅菌20min，放置室溫后，接入I接種鏟麩曲種子，先用玻璃珠振蕩分散，然后再用脫脂棉過(guò)濾，調(diào)整孢子濃度為5 X IO7個(gè)/mL。
5、曲盤發(fā)酵曲盤(大小Φ 20cmX4cm)裝IOOg基料(麩皮50 80g,玉米芯10 40g，豆餅粉 10 20g)，(NH4)2SO4O. 5 I. 5g，蛋白胨 O. 5 lg, KH2PO4O. 3 O. 4g，CaCl2O. 2 O. 3g, ZnCl2O. I O. 2g, MgSO4O. I O. 2g, Fe2 (SO4) 30· 02 O. 08g,吐溫 400. 4 O. 8g,自來(lái)水120 140mL,自然pH。121°C滅菌40min，冷卻后接種IOmL黑曲霉XZ-3S麩曲孢子懸液(孢子濃度為5 X IO7個(gè)/mL)，29°C靜置培養(yǎng)65 72h，期間分別于24 28h和43 47h正常補(bǔ)水20mL時(shí)各翻曲一次。
6、粗酶(木聚糖酶)液提取固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后稱取發(fā)酵曲料lg，加入29mL ρΗ4· O、O. 05mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，40°C條件下浸提30min，濾紙過(guò)濾，所得濾液即為木
聚糖酶液?！0033]7、分析方法
(I)、木聚糖酶活性測(cè)定于25mL具塞試管A和B中，分別加入用ρΗ4· O、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制的質(zhì)量濃度為O. 5%的木聚糖溶液2. 4mL, 45°C預(yù)熱5 lOmin，在A管中加入O. ImL適當(dāng)稀釋的酶液，45°C準(zhǔn)確反應(yīng)15min ;立即各加入2. 5mL3,(2)、還原糖測(cè)定采用DNS法，以木糖為標(biāo)準(zhǔn)。
(3)、曲料水分測(cè)定(濕曲干重測(cè)定)稱取一定量的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物(曲料)，105 °C烘干至恒重。
本發(fā)明的分析方法(I)為酶活測(cè)定，測(cè)定的吸光度值需從木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖(以木糖計(jì))含量并折算成酶活性單位；(2)還原糖測(cè)定即為木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法。另(I)測(cè)定的酶活為粗酶液中的酶活，單位為IU/mL;由于本發(fā)明是固態(tài)發(fā)酵最終酶活為IU/g干曲，從IU/mL換算到IU/g干曲需要測(cè)定曲料水分(3)。
本發(fā)明具有以下有益效果
(I)、本發(fā)明的利用廉價(jià)的麩皮、玉米芯等農(nóng)副產(chǎn)品作為發(fā)酵主原料，且采用的生產(chǎn)菌種黑曲霉(Aspergillus niger)是公認(rèn)的安全(GRAS)的微生物,其具有安全、可靠和
不產(chǎn)生毒素等特點(diǎn)。
(2)、本發(fā)明利用黑曲霉XZ-3S菌株曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶是一種充分利用自然界可再生資源、綠色環(huán)保且可持續(xù)的生產(chǎn)方式，同時(shí)具有設(shè)備簡(jiǎn)單、投資少、見(jiàn)效快、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)勢(shì)。
(3)、本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模上，利用黑曲霉XZ-3S菌株曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，其木聚糖酶發(fā)酵酶活性可達(dá)23065 26380IU/g干曲。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例I
I.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S 菌株。
2、斜面種子培養(yǎng)去皮馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂20g/L，pH6. O ;121°C滅菌20min，放置試管斜面；冷卻后接種黑曲霉XZ-3S菌株，30°C培養(yǎng)96h ；
3、麩曲種子制備250mL三角瓶裝IOg基料、(NH4) 2S0480mg、自來(lái)水10mL、pH6. 0，充分混勻，121°C滅菌40min，冷卻后接種步驟(I)所得的黑曲霉XZ-3S試管斜面種子，30°C靜置培養(yǎng)96h,期間分別于24h和44h各翻曲一次,所述基料為麩皮；
4、麩曲孢子懸液制備100mL三角瓶裝20mL去離子水，放入10-15粒玻璃珠，121°C滅菌20min，放置室溫后，接入I接種鏟麩曲種子，先用玻璃珠振蕩分散，然后再用脫脂棉過(guò)濾，調(diào)整孢子濃度為5 X IO7個(gè)/mL ；·
5.固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基曲盤(大小<J>20cmX4cm)裝IOOg基料(麩皮50g,玉米芯40g，豆餅粉 10g)，(NH4)2SO4Ig,蛋白胨 O. 5g, KH2PO4O. 3g, CaCl2O. 2g, ZnCl2O. lg，MgSO4O. lg,Fe2(SO4)3O. 02g,吐溫 400. 4g，自來(lái)水 140mL,自然 pH。
6.固態(tài)發(fā)酵條件121°C滅菌40min，冷卻后接種IOmL黑曲霉XZ-3S麩曲孢子懸液(孢子濃度為5父107個(gè)/1^)，291靜置培養(yǎng)6511，期間分別于28h和47h正常補(bǔ)水(20mL)時(shí)各翻曲一次。
重復(fù)3批次(每批次平行做3個(gè)曲盤)的上述曲盤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，XZ-3S成熟固態(tài)發(fā)酵曲料粗酶液平均酶活為12398. 6IU/mL，濕曲平均干重為O. 47g干曲/g濕曲，計(jì)算曲料木聚糖酶平均酶活性達(dá)到26380IU/g干曲。
實(shí)施例2
本實(shí)施例與實(shí)施例基本相同，區(qū)別在于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和固態(tài)發(fā)酵條件上，具體的
5、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基曲盤(大小<J>20cmX4cm)裝IOOg基料(麩皮80g,玉米芯10g，豆餅粉 10g)，(NH4)2SO4Ig,蛋白胨 O. 5g, KH2PO4O. 3g, CaCl2O. 2g, ZnCl2O. lg，MgSO4O. lg,Fe2(SO4)3O. 02g,吐溫 400. 4g，自來(lái)水 140mL,自然 pH。
6、固態(tài)發(fā)酵條件121°C滅菌40min，冷卻后接種IOmL黑曲霉XZ-3S麩曲孢子懸液(孢子濃度為5父107個(gè)/1^)，291靜置培養(yǎng)6511，期間分別于28h和47h正常補(bǔ)水(20mL)時(shí)各翻曲一次。
重復(fù)3批次(每批次平行做3個(gè)曲盤)的上述曲盤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，XZ-3S成熟固態(tài)發(fā)酵曲料粗酶液平均酶活為10829. 25IU/mL，濕曲平均干重為O. 45g干曲/g濕曲，計(jì)算的木聚糖酶平均酶活性達(dá)到24065IU/g干曲。
實(shí)施例3
本實(shí)施例與實(shí)施例基本相同，區(qū)別在于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和固態(tài)發(fā)酵條件上，具體的
5、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基曲盤(大小<J>20cmX4cm)裝IOOg基料(麩皮80g,玉米芯10g，豆餅粉 10g) (NH4)2SO4Ig,蛋白胨 O. 5g，KH2PO4O. 3g，CaCl2O. 2g，ZnCl2O. lg, MgSO4O. lg,Fe2(SO4)3O. 02g，吐溫 400. 4g，自來(lái)水 120mL，自然 pH
6、固態(tài)發(fā)酵條件121°C滅菌40min，冷卻后接種IOmL黑曲霉XZ-3S麩曲孢子懸液(孢子濃度為5父107個(gè)/1^)，291靜置培養(yǎng)6511，期間分別于28h和47h正常補(bǔ)水(20mL)時(shí)各翻曲一次。
重復(fù)3批次(每批次平行做3個(gè)曲盤)的上述曲盤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，XZ-3S成熟固態(tài)發(fā)酵曲料粗酶液平均酶活為8995. 35IU/mL，濕曲平均干重為O. 39g干曲/g濕曲，計(jì)算的木聚糖酶平均酶活性達(dá)到23065IU/g干曲。
以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依 據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其特征在于所述方法是以黑曲霉XZ-3S為原料，在曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，獲得發(fā)酵曲料后對(duì)發(fā)酵曲料用緩沖液進(jìn)行提取，獲得木聚糖酶液；所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為φ20 cmx4 cm曲盤裝IOOg基料，(NH4)2SO4O. 5 I. 5g，蛋白胨 O. 5 lg, KH2PO4O. 3 O. 4g, CaCl2O. 2 O. 3g, ZnCl2O. I O. 2g, MgSO4O. I O. 2g, Fe2 (SO4) 30· 02 O. 08g,吐溫 400. 4 O. 8g,自來(lái)水 120 140mL,自然PH，其中基料的組成為麩皮50 80g，玉米芯10 40g，豆餅粉10 20g。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其特征在于所述固體發(fā)酵的條件為曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基121°C滅菌40min，冷卻后接種IOmL黑曲霉XZ-3S麩曲孢子懸液，該懸液中孢子濃度為5X IO7個(gè)/mL，29°C靜置培養(yǎng)65 72h，期間分別于24 28h和43 47h補(bǔ)水20mL時(shí)各翻曲一次。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其特征在于所述緩沖液為O. 05mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I 3中任一權(quán)利要求
所述的方法，其特征在于對(duì)發(fā)酵曲料用緩沖液進(jìn)行提取的過(guò)程為稱取發(fā)酵曲料lg，加入29mL pH4. 0,0. 05mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，40°C條件下浸提30min，濾紙過(guò)濾，所得濾液即為木聚糖酶液。
5.一種由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，包括下述步驟 (1)、斜面種子培養(yǎng)去皮馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂20g/L,ρΗ6· O ;121 °C滅菌20min，放置試管斜面；冷卻后接種黑曲霉XZ-3S菌株，30°C培養(yǎng)96h ； (2)、麩曲種子制備250mL三角瓶裝IOg基料、(NH4)2S0480mg、自來(lái)水10mL、pH6. 0，充分混勻，121°C滅菌40min，冷卻后接種步驟(I)所得的黑曲霉XZ-3S試管斜面種子，30°C靜置培養(yǎng)96h,期間分別于24h和44h各翻曲一次,所述基料為麩皮； (3)、麩曲孢子懸液制備100mL三角瓶裝20mL去離子水，放入10-15粒玻璃珠，121°C滅菌20min，放置室溫后，接入I接種鏟麩曲種子，先用玻璃珠振蕩分散，然后再用脫脂棉過(guò)濾，調(diào)整孢子濃度為5 X IO7個(gè)/mL ; (4)、曲盤發(fā)酵曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基121°C滅菌40min，冷卻后接種IOmL黑曲霉XZ-3S麩曲孢子懸液，該懸液中孢子濃度為5X IO7個(gè)/mL，29°C靜置培養(yǎng)65 72h，期間分別于24 28h和43 47h補(bǔ)水20mL時(shí)各翻曲一次；所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為φ20 cmx4 cm曲盤裝 IOOg 基料、(NH4)2SO4O. 5 I. 5g、蛋白胨 O. 5 Ig^KH2PO4O. 3 O. 4g、CaCl20. 2 O. 3g、ZnCl2O. I O. 2g、MgSO4O. I O. 2g、Fe2 (SO4) 30· 02 O. 08g、吐溫 400. 4 O. 8g、自來(lái)水120 140mL，自然pH，其中基料的組成為麩皮50 80g，玉米芯10 40g，豆餅粉10 20g ； (5)、粗酶液提取曲盤發(fā)酵結(jié)束后稱取發(fā)酵曲料lg，加入29mLpH4. 0、0. 05mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，40°C條件下浸提30min，濾紙過(guò)濾，所得濾液即為木聚糖酶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的一種由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其特征在于所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為φ20 cmX4 cm曲盤裝IOOg基料、(NH4)2S04lg、蛋白胨O. 5g、KH2PO4O. 3g、CaCl20. 2g,ZnCl2O. lg、MgS040. UFe2(SO4) 30. 02g、吐溫 400. 4g、自來(lái)水 140mL,自然pH，其中基料的組成為麩皮50g，玉米芯40g，豆餅粉10g。
7.權(quán)利要求
1-6中任一權(quán)利要求
所述的一種由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法所使用的曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為q>20 cmx4 cm曲盤裝 IOOg 基料、(NH4)2SO4O. 5 I. 5g、蛋白胨 O. 5 lg、KH2PO4O. 3 O. 4g、CaCl2O. 2 O. 3g、ZnCl20. I O. 2g、MgS040. I O. 2g、Fe2 (SO4) 30· 02 O. 08g、吐溫 400. 4 O. 8g、自來(lái)水120 140mL，自然pH，其中基料的組成為麩皮50 80g，玉米芯10 40g，豆餅粉10 20g。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為 Φ 20cmX 4cm 曲盤裝 IOOg 基料、(NH4) 2S04lg、蛋白胨 O. 5g、KH2PO4O. 3g、CaCl2O. 2g、ZnCl2O. lg、MgS040. UFe2(SO4) 30. 02g、吐溫 400. 4g、自來(lái)水 140mL,自然 pH，其中基料的組成為麩皮50g，玉米芯40g，豆餅粉10g。
9.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為 Φ 20cmX 4cm 曲盤裝 IOOg 基料、(NH4) 2S04lg、蛋白胨 O. 5g、KH2PO4O. 3g、CaCl2O. 2g、ZnCl2O. lg、MgSO4O. lg、Fe2(SO4)3O. 02g、吐溫 400. 4g、自來(lái)水 140mL,自然 pH，其中基料的組成為麩皮80g，玉米芯10g，豆餅粉IOg。
10.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為 Φ 20cmX 4cm 曲盤裝 IOOg 基料、(NH4) 2S04lg、蛋白胨 O. 5g、KH2PO4O. 3g、CaCl2O. 2g、ZnCl2O. lg、MgSO4O. lg、Fe2(SO4)3O. 02g、吐溫 400. 4g、自來(lái)水 120mL,自然 pH，其中基料的組成為麩皮80g，玉米芯10g，豆餅粉10g。
專利摘要
本發(fā)明一種由黑曲霉曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法及其所用培養(yǎng)基，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明采用廉價(jià)的麩皮、玉米芯、豆餅粉等農(nóng)副產(chǎn)品為發(fā)酵基料，并添加適量的無(wú)機(jī)氮源、表面活性劑和無(wú)機(jī)鹽等，利用黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S菌株曲盤發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶。本發(fā)明提供了黑曲霉XZ-3S菌株實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)木聚糖酶的曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，其成熟發(fā)酵曲料的酸性木聚糖酶活性可達(dá)23065～26380IU/g干曲，高于目前國(guó)內(nèi)水平。本木聚糖酶生產(chǎn)新工藝具有設(shè)備簡(jiǎn)單、投入少、見(jiàn)效快、生產(chǎn)成本低廉、對(duì)環(huán)境友好以及木聚糖酶的固態(tài)發(fā)酵酶活性較高等優(yōu)勢(shì)，有利于木聚糖酶的開發(fā)和利用，具有較高的經(jīng)濟(jì)和實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N9/42GKCN102876646SQ201210390025
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月16日
發(fā)明者周晨妍, 王擁濤, 王燕, 劉振華, 郭偉云, 豐慧根 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan