專(zhuān)利名稱(chēng)：一種黑曲霉及其全細(xì)胞催化生產(chǎn)低聚果糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于低聚糖的技術(shù)領(lǐng)域，涉及低聚果糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，具體涉及一種黑曲霉及其全細(xì)胞催化生產(chǎn)低聚果糖的方法。
背景技術(shù)：
低聚果糖，又稱(chēng)鹿果低聚糖(Fructooligosaccharides,縮寫(xiě)為F0S),是由I 3個(gè)果糖基通過(guò)β_1，2糖苷健與蔗糖結(jié)合而生成蔗果三糖(Ι-Kestose)、蔗果四糖(Nystose)和鹿果五糖(lF_FructofuranosyInystose)的混合物。FOS具有促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌，例如雙歧桿菌的增殖，排毒清潔腸道，提高人體免疫力，改善脂質(zhì)代謝，能預(yù)防蛀牙，不被消化道吸收利用等優(yōu)異性能，現(xiàn)被廣泛用于保健食品配料中。目前生產(chǎn)低聚果糖有兩種方法(1)液體深層發(fā)酵法；(2)固定化酶法。這兩種方法都是以鹿糖為原料，由β -呋喃果糖苷轉(zhuǎn)移酶(β -Fructofuranosidase)進(jìn)行果糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)而合成，蔗糖既是果糖的供應(yīng)者也是接收者{劉冬梅，于淑娟，李國(guó)基，等.一種新型的功能性低聚糖-蔗果低聚糖及其生產(chǎn)方法，食品工業(yè)，1998，3 =14-16} 0得到廣泛應(yīng)用的是液體深層發(fā)酵法，是指利用能分泌β -呋喃果糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后從培養(yǎng)液分離收集菌絲體，將菌絲體投入到含蔗糖、蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽的復(fù)雜轉(zhuǎn)化溶液中，在一定的條件下轉(zhuǎn)化為含有低聚果糖(FOS)的糖漿。液體深層發(fā)酵法需要前期投入大量的發(fā)酵設(shè)備及其附屬設(shè)備，所生產(chǎn)出來(lái)的產(chǎn)品成分復(fù)雜，不僅要除去大量的菌絲體，蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)，而且還容易發(fā)生美拉德褐變，給后期的分離純化帶來(lái)諸多的困難，并且易使產(chǎn)品色度加深，影響感官質(zhì)量。而固定化酶的方法，因?yàn)楣潭ê蟮拿溉菀子坞x，且底物和產(chǎn)物要不斷穿過(guò)載體屏障，產(chǎn)率會(huì)受到很大的影響。專(zhuān)利號(hào)為01128345. 9的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利主要利用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)低聚果糖，先培養(yǎng)出大量的菌絲體，將菌絲體破壁后將酶分離純化，再將酶與有機(jī)高聚物進(jìn)行交聯(lián)固定化后，用分批或柱式反應(yīng)法進(jìn)行固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)低聚果糖。該方法的不足之處是步驟 繁多，酶在固定化過(guò)程中非常容易失活，轉(zhuǎn)化率低，由于蔗糖和轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物要穿過(guò)固定化的顆粒，傳質(zhì)均勻性受到限制。另外，酶的分離純化過(guò)程復(fù)雜且在此過(guò)程中酶活性有部分損失，在立體結(jié)構(gòu)環(huán)境中不穩(wěn)定，易失活等缺點(diǎn)，且酶的價(jià)格昂貴，造成酶法轉(zhuǎn)化成本較高，這些方面均嚴(yán)重制約了其的工業(yè)化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有低聚果糖轉(zhuǎn)化的酶制劑及其工藝上的不足，目的在于提供一種黑曲霉及其全細(xì)胞催化生產(chǎn)低聚果糖的方法。該種全細(xì)胞酶制劑制備方法簡(jiǎn)單，不涉及到酶的分離純化。這種全細(xì)胞酶制劑具有轉(zhuǎn)化效率高，性能穩(wěn)定的特點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案一種黑曲霉是指黑曲霉(Aspergillus niger)F0S_0620，已于2012年9月28日，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6640。地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。所述的黑曲霉具有如下性質(zhì)(I)形態(tài)特征該菌株為需氧菌，菌絲為乳白色，孢子為黑色。(2)生理特征最適生長(zhǎng)溫度為25_30°C，最適合生長(zhǎng)pH為5. 5-6. 0，可將蔗糖轉(zhuǎn)化為低聚果糖的酶活，轉(zhuǎn)化率高達(dá)99%，能催化生成FOS的含量為55%以上。一種黑曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)低聚果糖的方法，包括以下步驟(I)利用權(quán)利要求1所述的黑曲霉F0S-0620制備黑曲霉全細(xì)胞；(2)利用上述黑曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)低聚果糖。優(yōu)選地，所述黑曲霉全細(xì)胞的制備，包括如下步驟(I)將黑曲霉孢子接種到種子液體培養(yǎng)基中，接種量為I X IO5個(gè)/L 101°個(gè)/L，于25V -35°C,轉(zhuǎn)速為100r/min 300r/min的條件下培養(yǎng)16h 24h后的菌體溶液為種子液；(2)以體積比為5 10 :100的比例，將步驟(I)所得的種子液接種至含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，于25°C 35°C，轉(zhuǎn)速為100r/min 300r/min的條件下培養(yǎng)16h 24h后的菌體溶液制成黑曲霉全細(xì)胞溶液；(3)收集步驟(2)所得的黑曲霉全細(xì)胞溶液，用無(wú)菌的200目 400目的濾布過(guò)濾、洗滌、再過(guò)濾、干燥，得到具有轉(zhuǎn)化活性的黑曲霉全細(xì)胞。優(yōu)選地，所述的種子液體培養(yǎng)基為20 50g/L蔗糖，3g/L 7g/L麥芽粉或IOg/L 30g/L玉米粉，5g/L 10g/L蛋白胨和50g/L 100g/L酵母提取物中的一種或兩種，lg/L 3g/L NaCl和lg/L 2g/L NaNO3中的一種或兩種。優(yōu)選地，所述的產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑為蔗糖、淀粉、無(wú)機(jī)鹽和酵母提取物中的兩種以上的混合物，所述無(wú)機(jī)鹽為K2HP04、MgSO4. 7H20和NaNO3中的一種或兩種以上的混合物。優(yōu)選地，所述的含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基為10g/L 70g/L蔗糖，15g/L 55g/L 玉米粉,20g/L 50g/L 酵母提取物，0g/L 12g/L K2HPO4,0g/L 1. 5g/LMgSO4. 7H20，3g/L 10g/L NaNO30優(yōu)選地，步驟(3)所述洗滌采用的是NaCl生理鹽水溶液，所述干燥為真空冷凍干燥或真空干燥。優(yōu)選地，所述黑曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)低聚果糖的步驟如下(I)以重量體積比為廣10 :100 (m/V)的比例，將所得的黑曲霉全細(xì)胞置于FOS轉(zhuǎn)化體系中，于PH5. 0-7. 0，溫度45°C 55°C，轉(zhuǎn)速為100r/min 300r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化24h 48h ；(2)轉(zhuǎn)化完成后，過(guò)濾轉(zhuǎn)化液，回收黑曲霉全細(xì)胞菌體，濾過(guò)液經(jīng)過(guò)真空濃縮機(jī)濃縮，即制得低聚果糖。優(yōu)選地，所述FOS轉(zhuǎn)化體系的pH是用Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04系列緩沖液調(diào)節(jié)。優(yōu)選地，所述FOS轉(zhuǎn)化體系是重量百分比為40%_60%的蔗糖溶液。

本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)(I)本發(fā)明制作方法簡(jiǎn)單，不涉及到酶繁雜分離純化的過(guò)程，簡(jiǎn)化了設(shè)備的投資。(2)黑曲霉所需要的營(yíng)養(yǎng)低，易培養(yǎng)，易操作，制作工藝簡(jiǎn)單，細(xì)胞體相當(dāng)于酶的天然保護(hù)層，可有效避免酶的失活，免去了酶固定化的步驟。
(3)簡(jiǎn)化了低聚果糖的生產(chǎn)工藝，直接將黑曲霉全細(xì)胞投入到轉(zhuǎn)化液中，減少了液體深層發(fā)酵培養(yǎng)中發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備的投入。(4)將黑曲霉全細(xì)胞投入到FOS的轉(zhuǎn)化體系中，所得的FOS糖液不需要經(jīng)過(guò)脫色，不需要經(jīng)過(guò)離子交換柱脫鹽，只需要經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾，濃縮后即可得到固形物中的總低聚糖的含量> 50%的FOS糖漿，符合GB/T23528-2009低聚果糖中的非強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，整個(gè)工藝簡(jiǎn)單，操作方便，生產(chǎn)成本明顯降低。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1利用黑曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)得到的FOS糖漿的HPLC圖。圖2為本發(fā)明黑曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)FOS糖漿的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于此。實(shí)施例1第一步將黑曲霉F0S-0620的孢子接種到種子液體培養(yǎng)基中，接種量為I X IO5個(gè)/L,于33°C,轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上培養(yǎng)16h后的菌體溶液制成種子液；所述種子液體培養(yǎng)基為20g/L蔗糖，30g/L玉米粉，100g/L酵母提取物，2g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第二步以體積比為5 :100的比例，將第一步所得的種子液接種至含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，于33°C，轉(zhuǎn)速為150r/min的條件下培養(yǎng)24h后的菌體溶液制成黑曲霉全細(xì)胞菌體溶液；含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基為70g/L蔗糖，20g/L酵母提取物，15g/L玉米粉，3g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第三步收集第二步所得的黑曲霉全細(xì)胞菌體溶液，用無(wú)菌的200目的濾布過(guò)濾，用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過(guò)濾，真空冷凍干燥，得到具有轉(zhuǎn)化活性的黑曲霉全細(xì)胞。第四步以重量體積比為1:100 (m/V)的比例，將第三步所得的黑曲霉全細(xì)胞置于FOS轉(zhuǎn)化體系為重量百分比50%蔗糖溶液中，將該轉(zhuǎn)化體系pH調(diào)為5. O、于溫度為45°C和轉(zhuǎn)速為150r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化24h。第五步轉(zhuǎn)化完成后，用板框過(guò)濾器過(guò)濾轉(zhuǎn)化液，回收全細(xì)胞菌體，濾過(guò)液經(jīng)過(guò)真空濃縮機(jī)濃縮成符合要求的FOS糖漿。根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T23528-2009低聚果糖中的方法，利用高壓色譜法檢測(cè)FOS糖漿中低聚果糖的含量，如圖1所示，其中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的出峰時(shí)間分別為13. 944min、19. 044min 和 26. 063min，百分比分別為 27. 31%,24. 43% 和 3. 78%,所得糖漿中低聚果糖(FOS)的總含量(占干物質(zhì))為55. 52%，果糖、葡萄糖和蔗糖的出峰時(shí)間分別為7. 084min、7. 746mi n 和 9. 538min，百分含量分別為 4. 11%, 26. 76% 和 13. 61%。實(shí)施例2第一步將黑曲霉F0S-0620的孢子接種到種子液體培養(yǎng)基中，接種量為I X 101°個(gè)/L，于28°C，轉(zhuǎn)速為lOOr/min的條件下培養(yǎng)24h后的菌液為種子液；所述種子液體培養(yǎng)基為50g/L蔗糖，7g/L麥芽粉，10g/L蛋白胨，3g/L的NaCl ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用;第二步以體積比為10 :100的比例，將第一步所得的種子液接種至含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，于28°C，轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下培養(yǎng)16h后的菌體溶液制成黑曲霉全細(xì)胞菌體溶液；所述含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基為70g/L蔗糖，35g/L酵母提取物，15g/L玉米粉，12g/L K2HPO4,1. 5g/LMgS04. 7H20,10g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第三步收集第二步所得的黑曲霉全細(xì)胞菌體溶液，用無(wú)菌的400目的濾布過(guò)濾，用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過(guò)濾，真空干燥，得到具有轉(zhuǎn)化活性的黑曲霉全細(xì)胞。第四步以重量體積比為1:100 (m/V)的比例，將第三步所得的黑曲霉全細(xì)胞置于FOS轉(zhuǎn)化體系為重量百分比60%蔗糖溶液中，將該轉(zhuǎn)化體系pH調(diào)為6. O、于溫度55°C和轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化24h。第五步轉(zhuǎn)化完成后，用板框過(guò)濾器過(guò)濾轉(zhuǎn)化液，回收全細(xì)胞菌體，濾過(guò)液經(jīng)過(guò)真空濃縮機(jī)濃縮成符合要求的FOS糖漿。根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法檢測(cè)，所得糖漿中低聚果糖(FOS)的總含量(占干物質(zhì))為55. 30%。實(shí)施例3第一步將黑曲霉F0S-0620的孢子接種到種子液體培養(yǎng)基中，接種量為I X IO6個(gè)/L，于25°C，轉(zhuǎn)速為120r/min的條件下培養(yǎng)20h后的菌體溶液制成種子液；所述種子液體培養(yǎng)基為30g/L蔗糖，5g/L麥芽粉，7g/L蛋白胨，50g/L的酵母提取物，1.5g/L NaCl，1.5g/LNaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第二步以體積比為8 :100的比例，將第一步所得的種子液接種至含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，于25°C， 轉(zhuǎn)速 為300r/min的條件下培養(yǎng)20h后的菌體溶液制成黑曲霉全細(xì)胞菌體溶液；所述含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基為10g/L蔗糖，50g/L酵母提取物，20g/L玉米粉，6g/L K2HPO4,0. 5g/L MgSO4. 7H20,6. 5g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌,冷卻后備用；第三步收集第二步所得的黑曲霉全細(xì)胞菌體溶液，用無(wú)菌的300目的濾布過(guò)濾，用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過(guò)濾，真空冷凍干燥，得到具有轉(zhuǎn)化活性的黑曲霉全細(xì)胞。第四步以重量體積比為5 :100 (m/V)的比例，將第三步所得的黑曲霉全細(xì)胞置于FOS轉(zhuǎn)化體系為重量百分比40%蔗糖溶液中，將該轉(zhuǎn)化體系pH調(diào)為7. O、于溫度50°C和轉(zhuǎn)速為300r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化36h。第五步轉(zhuǎn)化完成后，用板框過(guò)濾器過(guò)濾轉(zhuǎn)化液，回收全細(xì)胞菌體，濾過(guò)液經(jīng)過(guò)真空濃縮機(jī)濃縮成符合要求的FOS糖漿。根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法檢測(cè)，所得糖漿中低聚果糖(FOS)的總含量(占干物質(zhì))為55. 12%。實(shí)施例4第一步將黑曲霉F0S-0620的孢子接種到液種子液體培養(yǎng)基中，接種量為IXlO7個(gè)/L，于35°C，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下培養(yǎng)18h后的菌體溶液制成種子液；所述種子液體培養(yǎng)基為40g/L蔗糖，10g/L玉米粉，3g/L麥芽粉，5g/L蛋白胨，70g/L酵母提取物，2g/LNaCl，1. Og/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第二步以體積比為7 :100的比例，將第一步所得的種子液接種至含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，于30°C，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下培養(yǎng)18h后的菌體溶液制成黑曲霉全細(xì)胞菌體溶液；所述含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基為50g/L蔗糖，40g/L酵母提取物，55g/L玉米粉，3. 5g/L K2HPO4,0. 8g/L MgSO4. 7H20, 5. 5g/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第三步收集第二步所得的黑曲霉全細(xì)胞菌體溶液，用無(wú)菌的250目的濾布過(guò)濾，用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過(guò)濾，真空冷凍干燥，得到具有轉(zhuǎn)化活性的黑曲霉全細(xì)胞。第四步以重量體積比為8 :100 (m/V)的比例，將第三步所得的黑曲霉全細(xì)胞置于FOS轉(zhuǎn)化體系為重量百分比55%蔗糖溶液中，將FOS該轉(zhuǎn)化體系pH調(diào)為7. O、于溫度48°C和轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化30h。第五步轉(zhuǎn)化完成后，用板框過(guò)濾器過(guò)濾轉(zhuǎn)化液，回收全細(xì)胞菌體，濾過(guò)液經(jīng)過(guò)真空濃縮機(jī)濃縮成符合要求的FOS糖漿。根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法檢測(cè)，所得糖漿中低聚果糖(FOS)的總含量(占干物質(zhì))為55. 47%。實(shí)施例5第一步將黑曲霉F0S-0620的孢子接種到種子液體培養(yǎng)基中，接種量為I X IO8個(gè)/L，于30°C，轉(zhuǎn)速為300r/min的條件下培養(yǎng)24h后的菌體溶液制成種子液；所述種子液體培養(yǎng)基為45g/L蔗糖，20g/L玉米粉，7. 5g/L蛋白胨，60g/L酵母提取物，1. 2g/LNaCl, lg/LNaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第二步以體積比為9 :100的比例，將第一步所得的種子液接種至含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，于35°C，轉(zhuǎn)速為250r/min的條件下培養(yǎng)24h后的菌體溶液制成黑曲霉全細(xì)胞菌體溶液；所述的含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基為45g/L蔗糖，45g/L酵母提取物，35g/L玉米粉，9. Og/L K2HPO4,1. 0g/LMgS04. 7H20，5. Og/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用;第三步收集第二步所得的黑曲霉全細(xì)胞菌體溶液，用無(wú)菌的350目的濾布過(guò)濾，用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過(guò)濾，真空冷凍干燥，得到具有轉(zhuǎn)化活性的黑曲霉全細(xì)胞。第四步以重量體積比為7 :100 (m/V)的比例，將第三步所得黑曲霉全細(xì)胞置于為重量百分比53%蔗糖溶液中，將該轉(zhuǎn)化體系pH調(diào)為5. 5、于溫度47 °C和轉(zhuǎn)速為250r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化40h。第五步轉(zhuǎn)化完成后，用板框過(guò)濾器過(guò)濾轉(zhuǎn)化液，回收全細(xì)胞菌體，濾過(guò)液經(jīng)過(guò)真空濃縮機(jī)濃縮成符合要求的FOS糖漿。根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法檢測(cè)，所得糖漿中低聚果糖(FOS)的總含量(占干物質(zhì))為55. 60%。實(shí)施例6第一步將黑曲霉F0S-0620的孢子接種到種子液體培養(yǎng)基中，接種量為I X IO9個(gè)/L，于29°C，轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下培養(yǎng)22h后的菌體溶液制成種子液；所述種子液體培養(yǎng)基配方為358/1蔗糖，158/1玉米粉，58/1麥芽粉，88/1蛋白胨，1.(^/1 NaCl，1.2g/LNaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第二步以體積比為6 :100的比例，將第一步所得的種子液接種至含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，于29°C，轉(zhuǎn)速為160/min 的條件下培養(yǎng)24h后的菌體溶液制成黑曲霉全細(xì)胞菌體溶液；所述的含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基為60g/L蔗糖，45g/L酵母提取物，30g/L玉米粉，9. Og/L NaNO3 ;攪拌溶解均勻后用滅菌，冷卻后備用；第三步收集第二步所得的黑曲霉全細(xì)胞菌體溶液，用無(wú)菌的200目的濾布過(guò)濾，用9g/L的NaCl溶液洗滌、再過(guò)濾，真空干燥，得到具有轉(zhuǎn)化活性的黑曲霉全細(xì)胞。第四步以重量體積比為9 :100 (m/V)的比例，將第三步所得的黑曲霉全細(xì)胞置于FOS轉(zhuǎn)化體系為重量百分比50%蔗糖溶液中，將該轉(zhuǎn)化體系pH調(diào)為5. 3、于溫度52°C和轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化45h。

第五步轉(zhuǎn)化完成后，用板框過(guò)濾器過(guò)濾轉(zhuǎn)化液，回收全細(xì)胞菌體，濾過(guò)液經(jīng)過(guò)真空濃縮機(jī)濃縮成符合要求的FOS糖漿。根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法檢測(cè)，所得糖漿中低聚果糖(FOS)的總含量(占干物質(zhì))為56. 11%。
權(quán)利要求
1.一種黑曲霉，其特征在于，所述黑曲霉(Aspergillus niger)F0S_0620，已于2012年9月28日，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 6640。
2.一種黑曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)低聚果糖的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)利用權(quán)利要求1所述的黑曲霉F0S-0620制備黑曲霉全細(xì)胞； (2)利用上述黑曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)低聚果糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉全細(xì)胞的制備，包括如下步驟 (1)將黑曲霉孢子接種到種子液體培養(yǎng)基中，接種量為IX IO5個(gè)/L 101°個(gè)/L，于25V -35°C、轉(zhuǎn)速為100r/min 300r/min的條件下培養(yǎng)16h 24h后的菌體溶液為種子液； (2)以體積比為5 10:100的比例，將步驟(I)所得的種子液接種至含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基中，于25°C 35°C、轉(zhuǎn)速為100r/min 300r/min的條件下培養(yǎng)16h 24h后的菌體溶液制成黑曲霉全細(xì)胞溶液； (3)收集步驟(2)所得的黑曲霉全細(xì)胞溶液，用無(wú)菌的200目 400目的濾布過(guò)濾、洗滌、再過(guò)濾、干燥，得到具有轉(zhuǎn)化活性的黑曲霉全細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的種子液體培養(yǎng)基為20 50g/L蔗糖，3g/L 7g/L麥芽粉或10g/L 30g/L玉米粉，5g/L 10g/L蛋白胨和50g/L IOOg/L酵母提取物中的一種或兩種，lg/L 3g/L NaCl和lg/L 2g/LNaN03中的一種或兩種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑為蔗糖、淀粉、無(wú)機(jī)鹽和酵母提取物中的兩種以上的混合物，所述無(wú)機(jī)鹽為K2HP04、MgSO4. 7H20和NaNO3中的一種或兩種以上的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的含產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的液體培養(yǎng)基為10g/L 70g/L鹿糖，15g/L 55g/L玉米粉，20g/L 50g/L酵母提取物，0g/L 12g/LK2HPO4,0g/L 1. 5g/L MgSO4. 7H20，3g/L 10g/L NaNO30
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5或6所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述洗滌采用的是NaCl生理鹽水溶液，所述干燥為真空冷凍干燥或真空干燥。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4或5或6所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)低聚果糖的步驟如下 (I)以重量體積比為廣10 :100m/V的比例，將所得的黑曲霉全細(xì)胞置于FOS轉(zhuǎn)化體系中，于pH5. 0-7. 0，溫度45°C 55°C，轉(zhuǎn)速為100r/min 300r/min的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化24h 48h ； (2 )轉(zhuǎn)化完成后，過(guò)濾轉(zhuǎn)化液，回收全細(xì)胞菌體，濾過(guò)液經(jīng)過(guò)真空濃縮機(jī)濃縮，即制得低聚果糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述FOS轉(zhuǎn)化體系的pH是用K2HPO4AH2PO4系列緩沖液調(diào)節(jié)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述FOS轉(zhuǎn)化體系是重量百分比為40%-60%的蔗糖溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種黑曲霉及其全細(xì)胞催化生產(chǎn)低聚果糖的方法，所述黑曲霉(Aspergillus niger)FOS-0620，為需氧菌，孢子為黑色，菌絲為乳白色，已于2012年9月28日，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC No.6640。一種黑曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)低聚果糖的方法，包括以下步驟(1)利用權(quán)利要求1所述的黑曲霉FOS-0620制備黑曲霉全細(xì)胞；(2)利用上述黑曲霉全細(xì)胞催化生產(chǎn)低聚果糖。本發(fā)明得到的產(chǎn)品經(jīng)高壓液相色譜法檢測(cè)，低聚果糖的含量(占總固形物)≥50%，本發(fā)明的工藝簡(jiǎn)單，操作方便，酶活性高，轉(zhuǎn)化效率高，具有重要的工業(yè)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/685GK103045489SQ20121053167
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者劉冬梅, 周康, 范夢(mèng)珂, 葉嘉倫 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)