專利名稱：一種小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRT1-206及其編碼序列與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206及其編碼序列與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
土壤鹽潰化是一個世界性的資源問題和生態(tài)問題，高濃度的鹽將導(dǎo)致植物體內(nèi)離子紊亂，引起植物產(chǎn)量降低，死亡率升高，在全世界現(xiàn)有耕地中，至少有20%的灌溉土地都受到鹽脅迫的嚴(yán)重危害。為了適應(yīng)鹽脅迫，植物自身形成了一系列的調(diào)控機制:主要包括提高抗氧化酶系統(tǒng)的活性，消除自由基對植物機體的傷害，改變體內(nèi)各種激素含量，離子選擇性吸收，離子區(qū)域化，拒鹽作用、合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和ER (Endoplasmic Reticulum)相關(guān)的蛋白降解等。近期的研究逐漸把植物對鹽脅迫反應(yīng)與ER質(zhì)量檢測系統(tǒng)(EndoplasmicReticulum Quality Control, ERQC)聯(lián)系起來,在ERQC中包含一種特殊的UPS機制,稱為ER 相關(guān)的蛋白降解機制(ER Associated protein Degradation, ERAD), ERAD 特異性地降解ER中錯誤折疊的蛋白。小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，但土壤的鹽潰化往往導(dǎo)致其產(chǎn)量的下降。不同植物之間對鹽脅迫的適應(yīng)性機制存在相似性，因此，我們可以通過鹽脅迫反應(yīng)相關(guān)基因的應(yīng)用來提高植物的耐鹽性。鹽脅迫反應(yīng)的調(diào)控因子分為正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子。正調(diào)控因子的超量表達(dá)，可以提高植物的耐鹽性；而抑制該基因的表達(dá)則會導(dǎo)致耐鹽性的減弱。鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白(Calreticulin, CRT)是真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中一個重要的分子伴侶，不同生物體中的CRT蛋白序列存在較高的保守性，主要由N、P、C這三個保守的結(jié)構(gòu)域及信號肽與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)四肽滯留信號序列(HDEL或KDEL)構(gòu)成。目前，動物鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白已得到深入研究，結(jié)果表明CRT具有Ca2+的調(diào)控、細(xì)胞黏附、T-細(xì)胞的識別、基因的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種功能，尤其作為分子伴侶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中能幫助肽鏈的正確折疊裝配，防止錯誤折疊蛋白的積聚，有效去處錯誤蛋白對機體的脅迫作用。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)要求
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種小麥耐鹽鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述蛋白片段的編碼序列。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述基因片段在培育耐鹽品種中的應(yīng)用。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:一種小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206，它是具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質(zhì)。所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列，它是下列核苷酸之一:
(1)序列表中SEQID NO:1所不的核昔酸序列；
(2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸；
(3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列含有681bp的核苷酸。含有上述TaCRTl-206蛋白片段的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法可以得到不同的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列在培育耐鹽品種中的應(yīng)用。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中超量表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的TaCRTl-206蛋白片段編碼序列TaOTl-681導(dǎo)入植物細(xì)胞，可改變植物耐鹽性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。使用載體時，其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進行篩選，可以對載體進行加工，如加入抗生素標(biāo)記基因(如潮霉素、卡那霉素和慶大霉素等)，加入抗生素標(biāo)記基因之后的載體用于轉(zhuǎn)化，可以在轉(zhuǎn)化后的植物培養(yǎng)基中加入抗生素，抑制非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和植株的生長，有助于快速和有效的獲得轉(zhuǎn)基因材料。為了便于觀察外源基因的表達(dá)，可以在載體中啟動子和外源基因之間或是外源基因與終止子之間加入報告基因(GUS基因、GFP和螢火蟲熒光素報告基因)，構(gòu)建外源基因和報告基因融合表達(dá)的載體，該載體用于遺傳轉(zhuǎn)化，可以觀察報告基因的表達(dá)與否和表達(dá)量高低，推測外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)情況。為了轉(zhuǎn)基因植物釋放的安全性，也可以在構(gòu)建載體時不攜帶任何篩選標(biāo)記基因或非抗生素篩選標(biāo)記基因，直接通過PCR鑒定或表型篩選鑒定。含有本發(fā)明的TaOTl-681片段的表達(dá)載體可通過使用基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、發(fā)粉管通道、電擊、顯微注射、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)?；蛑参锊《镜瘸Ｒ?guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞培育成完整的植株。被轉(zhuǎn)化的植株既可以是雙子葉植物，也可以是單子葉植物，如:水稻、棉花、小麥、大豆、油菜、煙草、擬南芥、大麥、高粱、玉米、黃瓜、番茄、白菜、蘿卜、楊樹、草坪草、苜蓿、藥材和花卉等。小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列可提高植物的耐鹽性。有益效果
通過基因工程的方法將本發(fā)明提供的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206轉(zhuǎn)入植物中，可以提聞植物的耐鹽性。由于該基因是糧食作物小麥本身存在的內(nèi)源基因，因此，該基因的超量表達(dá)不會影響植物的食品安全性，可廣泛應(yīng)用于各種植物的育種應(yīng)用。


圖1轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性得到了提高。

圖2鹽脅迫處理轉(zhuǎn)基因煙草與對照的根長比較。C89，野生型煙草；T-32，T-34，和Τ-36:轉(zhuǎn)基因煙草。圖3鹽脅迫處理轉(zhuǎn)基因煙草與對照的根長。C89，野生型煙草；Τ-32，Τ-34，和Τ-36:轉(zhuǎn)基因煙草。圖4鹽脅迫處理轉(zhuǎn)基因煙草與對照的根重。C89，野生型煙草；Τ-32，Τ-34，和T-36:轉(zhuǎn)基因煙草。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。本發(fā)明的實施例1:小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的獲得。以小麥{Triticum aestivum L)品種望水白(Wangshuibai)(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用基因組室保存)為材料，在開花期將赤霉菌孢子液噴灑穗部，所用孢子液為江蘇省范圍內(nèi)強致病力赤霉菌菌株F4、F15、F17及F34的分生孢子混合液，接種后立即套帶保濕，同時用水接種做為對照。接種6小時、12小時、24小時后分別取麥穗，立即用液氮冷凍。取700mg凍存的麥穗，加入70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL 10%三氯醋酸/丙酮振蕩混勻、-20°C沉淀I小時；4°C 15，OOOg離心15min，沉淀重新懸浮于5mL冷丙酮中，_20°C放置2小時；4°C 15，OOOg離心15min，沉淀懸浮于80%的冷丙酮中，-20°C放置I小時，離心去丙酮，將沉淀干燥成粉。按每mg干粉加入10 μ L裂解液(7M脲，2Μ硫脲，4% CHAPS，1% CA，
0.3%蛋白酶抑制劑，50U/mL DNase I)的比例加入裂解液，4°C攪拌抽提15min后加入14mM的011';41:再攪拌201^11，然后35，00(^離心lOmin，上清即為蛋白抽提液。將蛋白提取液進行等電聚焦后，進 行SDS-PAGE電泳，電泳緩沖液用Tris-Glycine-SDS (pH 8.3)緩沖液，溫度為17°C ;先用2.5W/膠預(yù)電泳30min后，再用5W/膠電泳至溴酚藍(lán)到玻璃板下緣為止。電泳結(jié)束后取下凝膠立即銀染。分析蛋白質(zhì)的豐度與對照相比超過3倍的蛋白點，取一個分子量為47.2千道爾頓，等電點為4.30的蛋白點進行質(zhì)譜分析，該蛋白電的肽質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)與大麥蛋白T05705理論酶切的肽質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)相匹配。用大麥蛋白T05705檢索小麥EST數(shù)據(jù)庫,并進行contigs的拼接,然后用Macvector軟件設(shè)計引物PI, Pl引物如下:F-5’- TCCGATCGGATCGGGGTAAAG-3’； R_5’_ CCAGTGCTCGTAGATGCTTCCAG -3’。用英俊公司的Trizol試劑盒提取望水白穗部的總RNA，用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。采用Promega的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成單鏈cDNA為模板，用引物Pl擴增目標(biāo)片段。PCR反應(yīng)體系為25 μ L，包含5ng模板，F(xiàn)和R引物各5 pmol、2.5μ IOx PCR buffer,37.3 nmol MgCl2,5 nmol dNTP、0.5 U 的 rTaq 聚合酶。擴增程序為:94°C 預(yù)變性 3 min,94°C 20s, 60°C 30s, 72°C 延伸 45s, 30 個循環(huán)后，72°C反應(yīng) 5min。通過PCR擴增，獲得681bp的核苷酸序列，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18_T載體，測序獲得序列如SEQ ID NO:1所示。該序列編碼206個氨基酸，如SEQ ID N0:2所示。本發(fā)明的實施例2:小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的獲得。將小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRT I_206的編碼序列TaOTl_681克隆到表達(dá)載體PET-32a的EcoR I和BamH I酶切位點中，轉(zhuǎn)化厶coli。挑取單菌落于I mL的LB (Amp100 μ g/mL)中搖菌過夜，轉(zhuǎn)至200 mL新鮮的LB培養(yǎng)基中搖至菌液濃度A_ ^ 0.6 ;加入IPTG至終濃度為1.0 mM，37°C培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)3小時。菌液12，000 g離心5 min，沉淀懸浮于提取緩沖液中(3M NaClUmM PMSF、50mM pH8.0磷酸緩沖液)超聲破碎細(xì)胞，12，000 g離心20 min,收集上清。用IOmM咪唑、50mM pH8.0磷酸緩沖液平衡N1-Sepharose凝膠；力口入細(xì)胞裂解液室溫結(jié)合20min、用5倍凝膠體積的平衡緩沖液洗滌3次；然后用含300mM咪唑、50mM pH8.0磷酸緩沖液進行洗脫，收集洗脫液即為純化后的Trx-TaCRTl_206蛋白。純化后的表達(dá)蛋白經(jīng)透析除鹽后按每毫克蛋白樣品加入0.1mg腸激酶，于40mM的琥珀酸緩沖液(pH=5.6)中25°C溫育2小時切去組氨酸標(biāo)簽，透析過夜即得到純化的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白TaCRT的蛋白質(zhì)片段TaCRTl-206。本發(fā)明的實施例3:小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列的應(yīng)用。以望水白穗部的總cDNA為模板，用引物P2進行PCR擴增。P2引物對如下:F_5’_CAGCTCTAGAATGTTCTTCCAGGAGAAGTTC -3’ ； R-5’ - GAAGGGATCCCCAGTGCTCGTAGATGCT -3’。將擴增得到的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶油a I和進行酶切后，與經(jīng)過同樣限制性內(nèi)切酶進行酶切的雙元表達(dá)載體PBI121進行連接，獲得由CaMV35S啟動子啟動的TaOT基因片段TaOTl-681超量表達(dá)載體。用凍融法將獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404，，通過含有50 μ g/ml的卡那霉素和50 μ g/ml利福平的LB培養(yǎng)基進行篩選，獲得陽性克隆。參照1985年Horsch等發(fā)表在Science第227期1229-1231頁上的文章方法，將攜帶有TaCRT基因片段TaOTl-681超量表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液浸泡煙草葉盤進行遺傳轉(zhuǎn)化，收獲得到的煙草種子種植于含有100 μ g/ml的卡那霉素的I / 2MS培養(yǎng)基上進行篩選，獲得目的基因片段超量表達(dá)的抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因煙草。對于轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株，我們首先提取基因組DNA，用與擴增TaOTl-681基因片段相同的引物和PCR程序進行PCR鑒定。對于PCR陽性的轉(zhuǎn)基因植株，提取總RNA，經(jīng)過DNAse I處理后，進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以cDNA第一鏈為模板，用與檢測DNA相同的PCR引物和程序進行轉(zhuǎn)錄水平的鑒定。煙草自交繁殖后，將T3代轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草種子播種在裝有營養(yǎng)土的穴盤中，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)正常生長3星期后，直接用500mM的NaCl溶液澆灌，I次/天，同時用水處理做對照。隨著處理時間的延長，對照與轉(zhuǎn)基因植株的生長都受到顯著的抑制，葉片發(fā)黃，但轉(zhuǎn)基因植株生長勢顯著高于對照(圖1)。處理兩星期后轉(zhuǎn)基因植株的初生根根長顯著長于對照(圖2，3)，根鮮重也顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(圖4)。因此我們認(rèn)為小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列TaOTl-681對提高植物耐鹽能力具有重要作用。本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下:
(1)SEQ ID N0.1 的信息
(i)序列特征:
(A)長度:681bp
(B)類型:核苷酸 (O鏈性:單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性(ii)分子類型:核苷酸
(iii)序列描沭:SEQID N0.1
(2)SEQ ID N0.2 的信息
(i)序列特征:
(A)長度:206a.a
(B)類型:氨基酸 (O鏈性:單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
權(quán)利要求
1.一種小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206，其特征在于:它是具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ IDNO:2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206，其特征在于:所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.—種如權(quán)利要求1所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列，其特征在于:它是下列核苷酸之一: (1)序列表中SEQID NO:I所不的核昔酸序列； (2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸； (3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列，其特征在于:小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.一種如權(quán)利要求3所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列在培育耐鹽品種中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列在培育耐鹽品種中的應(yīng)用，其特征在于:小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列可提高植物的耐鹽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRT1-206，它是具有序列表中SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了上述小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRT1-206的編碼序列TaCRT1-681的應(yīng)用。通過基因工程的方法將本發(fā)明提供的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRT1-206轉(zhuǎn)入植物中，可以提高植物的耐鹽性。由于該基因是糧食作物小麥本身存在的內(nèi)源基因，因此，該基因的超量表達(dá)不會影響植物的食品安全性，可廣泛應(yīng)用于各種植物的育種應(yīng)用。
文檔編號C12N15/29GK103073626SQ20121053100
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者向陽, 杜才富, 馬正強, 韓宏仕, 張敏琴, 王麗群, 宋敏 申請人:貴州省油菜研究所