專利名稱：小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定小麥中高、低分子量麥谷蛋白亞基的方法，屬于電化學(xué)分析及分離方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小麥蛋白主要有麥谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白四部分組成。其中小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基對小麥品質(zhì)具有決定性作用，它不僅影響小麥的沉淀值、濕面筋含量、面團(tuán)的形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間以及面團(tuán)的彈性和延展性，而且對小麥的烘烤品質(zhì)也具有決定作用。但是在對小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的電泳分析方法中，由于清蛋白和球蛋白的存在影響了其電泳，而且由于低分子量麥谷蛋白與小麥醇溶蛋白分子量相近，特別是低分子量麥谷蛋白亞基條帶多達(dá)20余條帶型并且主要集中分布，因此在泳圖譜中很難區(qū)分。目前常用于分離小麥高低分子量麥谷蛋白亞基與其它蛋白的溶液配方是含有0.625M2-氨基-2羥甲基-1，3-丙二醇(Tris)(ph＝6.8)、2％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.3％溴酚藍(lán)、5％巰基乙醇和10％甘油的提取液。該溶液雖然能提取小麥高、低分子量麥谷蛋白，也能去除清蛋白，但是不能去除醇溶蛋白和球蛋白，另外該溶液中只用巰基乙醇來打破各亞基之間二硫鍵的結(jié)合，效果不充分，因此在電泳圖譜中，球蛋白和醇溶蛋白的存在，使小麥麥谷蛋白亞基，特別是低分子量麥谷蛋白亞基各條帶的區(qū)分極不明顯，嚴(yán)重影響了小麥麥谷蛋白各亞基的研究及其檢測。只有在充分剔出清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的情況下，并且打破各亞基之間的二硫鍵，才能清晰的區(qū)分高、低分子量麥谷蛋白各亞基，為小麥品質(zhì)的遺傳研究和育種應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提取小麥高低分子量麥谷蛋白亞基的方法，通過加人異丙醇去除小麥蛋白中的醇溶蛋白，加人NaI去除球蛋白，而用水去除清蛋白，加人DDT、VP和巰基乙醇充分打破個(gè)亞基之間二硫鍵的結(jié)合，從而使各亞基處于分離狀態(tài)，為SDS-PAGE奠定良好的基礎(chǔ)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的1、小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，其特征在于采取如下步驟完成A、取1/3單粒小麥種子夾碎放人0.5ml ep管中，加入含有異丙醇和NaI的提取液I，離心分離去除小麥蛋白中的醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白；B、加入含有溶液B和二硫蘇糖醇的提取液II，離心分離；C、加入含有溶液B和4-乙烯基吡啶的提取液III；D、加人麥谷蛋白提取液IV；E、利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行測定。
所述的小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，步驟A所述的溶液I是0.3MNaI溶解于7.5％異丙醇中。
所述的小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，步驟A所述的分離方法是在ep管中加入200μl提取液I，于65℃水浴1-2小時(shí)，10000rpm離心3-5分鐘，棄去上清液。
所述的小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，步驟B所述的提取液II的配制方法是0.04M 2-氨基-2羥甲基-1，3-丙二醇溶解于25％異丙醇中，調(diào)節(jié)pH為8.0得到溶液B，10ml溶液B加入0.1g十二烷基硫酸鈉，200mg二硫蘇糖醇得到提取液II。
所述的小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，步驟B所述的分離方法是在步驟A得到的沉淀物中加人50μl提取液II，懸浮，65℃水浴2小時(shí)，10000rpm離心3分鐘，取上清液。
所述的小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，步驟C所述的提取液III的配制方法是10ml溶液B加入0.1g十二烷基硫酸鈉，140μl 4-乙烯基吡啶得到提取液III。
所述的小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，步驟C所述的分離方法是在步驟B得到的上清液中加入50μl提取液III，65℃水浴1小時(shí)。
所述的小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，步驟D所述的提取液IV的配制方法是2％十二烷基硫酸鈉，5％巰基乙醇，20％甘油，0.2％溴酚藍(lán)，7.57g的2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇，水余量，pH為6.8。
所述的小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，步驟D所述的分離方法是取步驟C的溶液，加人50μl提取液IV，混勻，靜置30分鐘，100℃水浴5分鐘，冷卻后所得溶液即為含有小麥高、低分子量麥谷蛋白的試樣溶液，可冰箱保存或直接進(jìn)行電泳分析。
本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)步效果表現(xiàn)在通過加人一定濃度的異丙醇去除小麥蛋白中的醇溶蛋白，加人NaI去除球蛋白，而用水去除清蛋白，依次加人二硫蘇糖醇、4-乙烯基吡啶和巰基乙醇離心分離充分打破個(gè)亞基之間二硫鍵的結(jié)合，從而使各亞基處于分離狀態(tài)，為利用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳奠定良好的基礎(chǔ)。


圖1是現(xiàn)有技術(shù)分離分析分析小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基電泳照片圖2是本發(fā)明的分離分析方法小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基電泳照片圖中1、小麥高分子量麥谷蛋白亞基 2、小麥低分子量麥谷蛋白亞基具體實(shí)施方式
一、試驗(yàn)溶液的配制1、提取液I的配制每升7.5％異丙醇中加人45克NaI，得到0.3MNaI溶液；2、提取液B的配制每升25％異丙醇加人0.48克2-氨基-2羥甲基-1，3-丙二醇()，得到0.04M Tris溶液，調(diào)節(jié)pH＝8.0；3、提取液II的配制10ml溶液B加人0.1g十二烷基硫酸鈉(SDS)，在加入200mg二硫蘇糖醇(DTT)；4、提取液III的配制10ml溶液B加人0.1g十二烷基硫酸鈉(SDS)，再加人140μl 4-乙烯基吡啶(VP)；
5、提取液IV的配制2％十二烷基硫酸鈉(SDS)，5％巰基乙醇，20％甘油，0.2％溴酚藍(lán)，7.57g 2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(Tris)，水余量。調(diào)節(jié)pH＝6.8二、試樣制備1、取1/3單粒小麥種子夾碎放人0.5ml ep管中，加入200μl提取液I；2、65℃水浴1-2小時(shí)，10000rpm離心3-5分鐘，棄上清液；3、加人50μl提取液II，懸浮，65℃水浴2小時(shí)；4、10000rpm離心3分鐘，取上清液加50μl提取液III，65℃水浴1小時(shí)；5、加入50μl提取液IV，混勻，靜置30分鐘；6、100℃水浴5分鐘，冷卻后所得溶液即為含有小麥高、低分子量麥谷蛋白的試樣溶液，可直接進(jìn)行下一步電泳，進(jìn)行高、低分子量麥谷蛋白亞基定性研究。
通過對照圖1、圖2高、低分子量麥谷蛋白亞基電泳照片，說明本發(fā)明采用的分離分析方法在充分剔出清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的情況下，并且打破各亞基之間的二硫鍵，才能清晰的區(qū)分高、低分子量麥谷蛋白各亞基，為小麥品質(zhì)的遺傳研究和育種應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明列舉的實(shí)施例旨在進(jìn)一步地闡述小麥中高、低分子量麥谷蛋白亞基分離分析方法，而不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
權(quán)利要求
1.小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，其特征在于采取如下步驟完成A、取1/3單粒小麥種子夾碎放入0.5ml ep管中，加入含有異丙醇和NaI的提取液I，離心分離去除小麥蛋白中的醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白；B、加入含有溶液B和二硫蘇糖醇的提取液II，離心分離；C、加入含有溶液B和4-乙烯基吡啶的提取液III；D、加入麥谷蛋白提取液IV；E、利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，其特征在于步驟A所述的提取液I是0.3MNaI溶解于7.5％異丙醇中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，其特征在于步驟A所述的分離方法是在ep管中加入200μl提取液I，于65℃水浴1-2小時(shí)，10000rpm離心3-5分鐘，棄去上清液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，其特征在于步驟B所述的提取液II的配制方法是0.04M 2-氨基-2羥甲基-1，3-丙二醇溶解于25％異丙醇中，調(diào)節(jié)pH為8.0得到溶液B，10ml溶液B加入0.1g十二烷基硫酸鈉，200mg二硫蘇糖醇得到提取液II。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，其特征在于步驟B所述的分離方法是在步驟A得到的沉淀物中加入50μl提取液II，懸浮，65℃水浴2小時(shí)，10000rpm離心3分鐘，取上清液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，其特征在于步驟C所述的提取液III的配制方法是10ml溶液B加入0.1g十二烷基硫酸鈉，140μl 4-乙烯基吡啶得到提取液III。
7.根據(jù)權(quán)利要求1小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，其特征在于步驟C所述的分離方法是在步驟B得到的上清液中加入50μl提取液III，65℃水浴1小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，其特征在于步驟D所述的提取液IV的配制方法是2％十二烷基硫酸鈉，5％巰基乙醇，20％甘油，0.2％溴酚藍(lán)，7.57g的2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇，水余量，pH為6.8。
9.根據(jù)權(quán)利要求1小麥高、低分子量麥谷蛋白亞基的分離分析方法，其特征在于步驟D所述的分離方法是取步驟C的溶液，加入50μl提取液IV，混勻，靜置30分鐘，100℃水浴5分鐘，冷卻后所得溶液即為含有小麥高、低分子量麥谷蛋白的試樣溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種分離分析小麥中高、低分子量麥谷蛋白亞基的方法，通過加入異丙醇去除小麥蛋白中的醇溶蛋白，加入NaI去除球蛋白，而用水去除清蛋白，加入DDT、VP和巰基乙醇充分打破個(gè)亞基之間二硫鍵的結(jié)合，從而使各亞基處于分離狀態(tài)，為利用十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行測定奠定良好的基礎(chǔ)。
文檔編號G01N27/447GK1851444SQ20051004821
公開日2006年10月25日 申請日期2005年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月26日
發(fā)明者紀(jì)軍, 劉冬成, 王志國, 李俊明, 張愛民 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所