專利名稱：轉(zhuǎn)基因大豆a2704-12的lamp檢測引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12的LAMP檢測引物及方法。
背景技術(shù)：
隨著全球轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的日益增多，以及越來越多的轉(zhuǎn)基因作物特異品系獲得商品化生產(chǎn)，檢測特異性品系已成為國際上轉(zhuǎn)基因成分檢測的發(fā)展趨勢(shì)。目前，檢測轉(zhuǎn)基因特異品系的方法主要有普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法。普通P CR方法，具有耗時(shí)長，操作繁瑣，靈敏度不夠，容易產(chǎn)交叉污染，質(zhì)控復(fù)雜，假陽性、假陰性比例偏高等缺點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光PCR方法則具有成本昂貴、技術(shù)要求高、需要大型的儀器設(shè)備等缺點(diǎn)，均已經(jīng)不能滿足食品中轉(zhuǎn)基因成分的日常監(jiān)管和食品生產(chǎn)行業(yè)內(nèi)部質(zhì)控的需求。因此，目前急需建立能夠普遍適用于檢驗(yàn)檢疫一線的基層實(shí)驗(yàn)室的快速、簡便、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因品系檢測方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4飛條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件￠3 °C左右)保溫30 — 60分鐘，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物(焦磷酸鎂)，形成乳白色沉淀，通過觀察濁度，或加入顯色液觀察顏色變化來判定結(jié)果。LAMP技術(shù)具有簡便、高效、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，在靈敏度、特異性能媲美甚至優(yōu)于普通PCR技術(shù)，不依賴任何專門的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。LAMP技術(shù)在食源性致病微生物的快速檢測中已得到廣泛應(yīng)用，但在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測上的應(yīng)用研究很少。目前，國內(nèi)采用LAMP技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的研究尚處于起步階段，且主要應(yīng)用于啟動(dòng)子、外源基因的檢測，極少應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因品系的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種普遍適用于基層實(shí)驗(yàn)室的快速、簡便、準(zhǔn)確、特異檢測轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12的LAMP檢測引物及方法。本發(fā)明首先提供了一種轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12的LAMP檢測引物，所述LAMP檢測引物如下
外引物 F3 :5，-GAC ACA TCT CAT TGC ACT GA-3’
外引物 B3 :5，-CGA GTT CTG TTA GGT CCT CTA-3’
內(nèi)引物 FIP :5，-TGG CGT AAT AGC GAA GAG GCG TGA GTT ATT TAT CAG CCA AGC-3’內(nèi)引物 BIP :5，-GGA TGT GCT GCA AGG CGA TTT ACA ACG TCG TGA CTG G-3’
環(huán)引物 LF :5’ -CCG CAC CGA CAT AAG AAG A-3’
環(huán)引物 LB :5’ -AAG TTG GGT AAC GCC AGG-3’。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12的LAMP檢測方法，利用所述的LAMP檢測引物，以fei DNA聚合酶大片段啟動(dòng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，通過觀察濁度，或加入顯色液觀察顏色變化來判定檢測結(jié)果。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件為63°C溫育lh，80°C保溫5min;反應(yīng)體系為10 XThermoPol 緩沖液 2. 5 μ L，10 μ mol/L 外引物 F3 O. 5 μ L, 10 μ mol/L 外引物 B3O. 5 μ L, 40 ymol/L 環(huán)引物 LF O. 5 μ L, 40 ymol/L 環(huán)引物 LB 0. 5μ L,40 ymol/L 內(nèi)引物FIP I. Ομ L,40 μ mol/L 內(nèi)引物 BIP I. O μ L，10 mmol/L dNTPs 4. 0μ L,5 mol/L 甜菜堿
6.0μ L, 150 mmol/L 硫酸鎂 I. 0 μ L，8 U/μ L Bst DNA 聚合酶大片段 I. 0 μ L，100 ng/μ LDNA 模板 2· O μ L，ddH20 4· 5 μ L。本發(fā)明建立的LAMP檢測方法的優(yōu)點(diǎn)①快速、高效擴(kuò)增約I h即可完成，且產(chǎn)率高；②簡便在核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物-焦磷酸鎂沉淀，通過觀察濁度或加入顯色液觀察顏色變化就可判定檢測結(jié)果，不需要特殊的、昂貴的儀器設(shè)備，操作非常簡便；③高特異性采用六個(gè)區(qū)段、四條或六條 引物，擴(kuò)增特異性高，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。國內(nèi)外還未見轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12品系的LAMP檢測引物及方法的報(bào)道，本發(fā)明首次設(shè)計(jì)、篩選到了轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12品系的LAMP檢測引物，并建立了 LAMP檢測方法。


圖I為轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12的特異序列，加框的是大豆基因組內(nèi)含子，陰影的是大腸桿菌IacZ基因，加下劃線的是CaMV 35S啟動(dòng)子。圖2為4套引物反應(yīng)溫度的測試結(jié)果。A. setl引物；B. set2引物；C. set3引物；D. set4引物；1_6.反應(yīng)溫度分別為60. 0°C>61. 2°C>61. 9°C>63. 3°C>64. 1°C>64. 80C0圖3為第一、三、四套引物在反應(yīng)溫度為60°C的特異性測定結(jié)果。A. setl引物；B. set3引物；C. set4引物；I. ddH20 ；2.非轉(zhuǎn)基因大米；3.非轉(zhuǎn)基因小麥；4.非轉(zhuǎn)基因玉米；5.非轉(zhuǎn)基因大豆；6.轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2品系；7.轉(zhuǎn)基因大豆Mon89788品系；8· 5%轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12品系。圖4為LAMP方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果。I. ddH20 ;2.非轉(zhuǎn)基因大米；3.非轉(zhuǎn)基因小麥；4.非轉(zhuǎn)基因玉米；5.非轉(zhuǎn)基因大豆；6·轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423-1品系；7·轉(zhuǎn)基因大豆DP356043品系；8·轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2品系；9.轉(zhuǎn)基因大豆Mon89788品系；10.轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系(5%); 11. 5%A2704-12 ；12. 2704-12 標(biāo)準(zhǔn)品。圖5為LAMP法靈敏度測定實(shí)時(shí)監(jiān)控結(jié)果。I. 5% A2704-12 ；2. 0. 5% A2704-12 ；3. 0. 1% A2704-12 ；4. 1% A2704-12 ；5.
0.05% A2704-12 ；6. 0. 01% A2704-12 ；7.非轉(zhuǎn)基因大豆。圖6為LAMP法靈敏度測定結(jié)果。I.非轉(zhuǎn)基因大豆；2. 0. 01% A2704-12 ；3. 0. 05% A2704-12 ；4. 0. 1% A2704-12 ；5. 0.5% A2704-12 ；6. 1% A2704-12 ；7. 5% A2704-12。圖7為送檢樣品中A2704-12品系的LAMP檢測結(jié)果。AflO分別為ddH20、非轉(zhuǎn)基因大豆、油豆腐、脫脂大豆、香干、正康雞蛋豆奶、正康草莓豆奶、玉米種子、奶香味韓味玉米、辣味韓味玉米；βΓιο分別為玉米淀粉、大米、白稞干、米粉干、小麥、面粉、餅干、馬鈴薯淀粉、薯片、番茄；cf 10分別為番茄醬、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因玉米酒糟柏、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因油菜籽、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因非種用黃大豆、美國進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆、巴西進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆、阿根廷進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆、O. 1% A2704-12、5% A2704-12。
具體實(shí)施例方式I試驗(yàn)材料
A2704-12標(biāo)準(zhǔn)品DNA購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。非轉(zhuǎn)基因大豆、油豆腐、脫脂大豆、香干、正康雞蛋豆奶、正康草莓豆奶、玉米種子、奶香味韓味玉米、辣味韓味玉米、玉米淀粉、大米、白稞干、米粉干、小麥、面粉、餅干、馬鈴薯淀粉、薯片、番茄、番茄醬、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因玉米酒糟柏、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因油菜籽、進(jìn)口轉(zhuǎn)基因非種用黃大豆、美國進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆、巴西進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆、阿根廷進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆由本實(shí)驗(yàn)室收集。采用CTAB法提取試驗(yàn)材料的DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?2主要試劑、耗材
dNTPs溶液(每種核苷酸濃度10 mmol/L)購自廈門泰京公司'Bst DNA聚合酶大片段(8 U/μ L)及l(fā)OXThermolPol緩沖液為美國NEB公司產(chǎn)品；甜菜堿(5mol/L)、硫酸鎂溶液(lmol/L)為Sigma公司產(chǎn)品；SYBR Green I熒光染料(10000X )為廈門百維信生物科技有限公司產(chǎn)品；LAMP專用薄壁管、穩(wěn)定液購自廣州華峰生物科技有限公司。3主要儀器與設(shè)備
冷凍混合研磨儀、渦旋儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、生物安全柜、梯度PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司的7500)。4LAMP引物的設(shè)計(jì)
用于設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12品系LAMP引物的序列如圖I所示。委托廣州迪澳生物科技有限公司設(shè)計(jì)，獲得4套LAMP引物(表I)。委托上海生工公司合成所用引物。用ddH20將外引物稀釋至lOymol/L，環(huán)引物、內(nèi)引物稀釋至40ymol/L，按外引物環(huán)引物內(nèi)引物體積比為I :1 2的比例混勻內(nèi)、外、環(huán)引物，作為引物混合液，分別標(biāo)記為setl、set2、set3和 set4。表I LAMP 引物取非轉(zhuǎn)基因大豆樣品(即空白樣品0%)的DNA溶液，稀釋至IOOng/μ L，按體積比，將含量為100%的Α2704-12標(biāo)準(zhǔn)品DNA配制成含量分別為5%、1%、0· 5%、0· 1%、0· 05%和O. 01%的模擬樣品DNA。6 LAMP引物的篩選
以5% A2704-12模擬樣品DNA為模板，取60°C 65°C，進(jìn)行4套LAMP引物擴(kuò)增效果的測試。反應(yīng)體系為甜菜堿4 μ L、dNTPs 3. 5 μ L，引物混合液2 μ L，lOXThermolPol緩沖液
2.5 μ L，硫酸鎂(100mol/L) I μ L，Bst DNA 聚合酶大片段 I μ L，DNA 模板 2 μ L，ddH20 調(diào)節(jié)總體積至25 μ L。在LAMP專用薄壁管的一側(cè)加20 μ L穩(wěn)定液和IyL SYBR Green I熒光染料(1000Χ )，另一側(cè)(反應(yīng)區(qū))加反應(yīng)混合液。反應(yīng)條件60°C 65°C，lh ;80°C 5min。反應(yīng)完成后，顛倒管子，將兩側(cè)的液體混勻、顯色，立即觀察結(jié)果，若反應(yīng)區(qū)的混合液呈桔色(黑白顯示時(shí)呈透明)的即為 陰性結(jié)果，呈綠色(黑白顯示時(shí)呈渾濁)的即為陽性結(jié)果。根據(jù)溫度篩選結(jié)果，選定反應(yīng)溫度，測定選定的LAMP引物的特異性。篩選結(jié)果如圖2所示，第一套、第四套引物的6個(gè)溫度均呈渾濁，即為陽性結(jié)果；而第二套引物的6個(gè)溫度、第三套引物在63. 3°C時(shí)均呈透明，即為陰性結(jié)果，因而放棄第二套引物進(jìn)行下一步的測試。分別以ddH20、非轉(zhuǎn)基因大米、非轉(zhuǎn)基因小麥、非轉(zhuǎn)基因玉米、非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2品系、轉(zhuǎn)基因大豆Mon89788品系和5%轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12品系的DNA為模板，選取第一、三、四套引物均為陽性結(jié)果的60°C為反應(yīng)溫度，進(jìn)行這3套引物的特異性測試。結(jié)果如圖3所示，第一套引物擴(kuò)增非轉(zhuǎn)基因大豆時(shí)也會(huì)得到陽性結(jié)果，第三套引物均為陰性結(jié)果，而第四套引物只有5%轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12品系為陽性結(jié)果。第四套引物的穩(wěn)定性、特異性最好，因此選定第四套引物作為轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12品系的LAMP引物。7 LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化
在LAMP反應(yīng)體系中加入SYBR Green I熒光染料(10 X )，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。反應(yīng)條件60°C 65°C Ih, 80°C 5 min。反應(yīng)體系加SYBR Green I熒光染料(IOX)O. 5yL，其余成分同上。重復(fù)2管。以反應(yīng)曲線的出峰時(shí)間、出峰高度、重復(fù)性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取適宜的反應(yīng)溫度。由于第四套引物在60°C 65°C都能得到陽性結(jié)果，到底哪個(gè)溫度最適宜，因此首先對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，61°C、62°C時(shí)，2個(gè)重復(fù)的出峰時(shí)間差距較大，表明穩(wěn)定性不好；60°C、63°C、64°C和65°C時(shí)，2個(gè)重復(fù)的出峰時(shí)間均較一致，而63°C時(shí)的出峰高度為最大。因此，選用63°C作為A2704-12的LAMP檢測的適宜反應(yīng)溫度。8 LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化
選取Mg2+濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、引物用量共4個(gè)變量參數(shù)，用篩選到的引物、優(yōu)化后的反應(yīng)溫度，進(jìn)行單因素變化實(shí)驗(yàn)，對(duì)LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。Mg2+濃度分別為4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L。甜菜喊濃度分別為 0. 6mol/L、0. 8mol/L、I. 0mol/L、I. 2mol/L0 dNTPs 濃度分別為 I. 2mmol/L、I. 4mmol/L、I. 6mmol/L、I. 8mmol/L。引物混合液分別取lyL、2yL、4yL。以反應(yīng)曲線的出峰時(shí)間、出峰高度(以出峰時(shí)間為主)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)上述參數(shù)進(jìn)行比較。優(yōu)化結(jié)果得出最佳參數(shù)為Mg2+濃度6mmol/L、甜菜堿I. 2mol/L、dNTPs I. 6mmol/L、引物混合液4 μ L。建立的最佳反應(yīng)體系如表2所示。表2優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系(25 μ L)
9 LAMP方法的特異性測定
選擇不同轉(zhuǎn)基因大豆品系、不同植物的DNA，按照優(yōu)化好的反應(yīng)溫度、反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP反應(yīng)，從而驗(yàn)證建立的LAMP方法的特異性。結(jié)果如圖4所示，僅5% A2704-12模擬樣品和A2704-12標(biāo)準(zhǔn)品為陽性結(jié)果，其他均為陰性結(jié)果，表明建立的轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12品系的LAMP檢測方法特異性很好，沒有出現(xiàn)假陽性結(jié)果。10 LAMP方法的靈敏度測定
各取2 μ L上述配制的模擬DNA樣品，測定LAMP法的靈敏度。結(jié)果如圖5、6所示，實(shí)時(shí)監(jiān)控和顯色的測定結(jié)果完全一致，最低限均可達(dá)到0. 1%。實(shí)時(shí)監(jiān)控結(jié)果(圖5)顯示，所有陽性結(jié)果的出峰時(shí)間均在25min之前，因此，反應(yīng)時(shí)間設(shè)為60min已足夠。轉(zhuǎn)基因大 A2704012品系是允許商品化生廣的、我國農(nóng)業(yè)部允許進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因品系。目前各國對(duì)允許商品化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因品系普遍采用標(biāo)識(shí)管理，而對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理最嚴(yán)的歐盟將標(biāo)識(shí)的最低限量定為0. 9%，即當(dāng)食品中某一成分的轉(zhuǎn)基因含量達(dá)到0. 9%時(shí)，必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)。因此，本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因大豆Α2704012品系LAMP檢測方法的靈敏度已達(dá)到目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)的限量要求，能滿足日常檢測需求。11送檢樣品中A2704-12品系的LAMP檢測
用建立的LAMP方法檢測送檢樣品DNA中是否含有A2704-12品系，結(jié)果如圖7所示，除陽性對(duì)照(0. 1% A2704-12、5% A2704-12)外，僅進(jìn)口轉(zhuǎn)基因非種用黃大豆、美國進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆、巴西進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆、阿根廷進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆中檢出A2704-12品系，而市場流通的黃大豆(即非轉(zhuǎn)基因大豆)及豆制品、其他作物及其制品中均未檢出A2704-12品系。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12的LAMP檢測引物，其特征在于所述LAMP檢測引物如下外引物 F3 :5，-GAC ACA TCT CAT TGC ACT GA-3’外引物 B3 :5，-CGA GTT CTG TTA GGT CCT CTA-3’內(nèi)引物 FIP :5，-TGG CGT AAT AGC GAA GAG GCG TGA GTT ATT TAT CAG CCA AGC-3’內(nèi)引物 BIP :5，-GGA TGT GCT GCA AGG CGA TTT ACA ACG TCG TGA CTG G-3’ 環(huán)引物 LF :5’-CCG CAC CGA CAT AAG AAG A-3’環(huán)引物 LB :5’ -AAG TTG GGT AAC GCC AGG-3’。
2.—種轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12的LAMP檢測方法，其特征在于利用權(quán)利要求I所述的LAMP檢測引物，以ifeiDNA聚合酶大片段啟動(dòng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，通過觀察濁度，或加入顯色液觀察顏色變化來判定檢測結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12的LAMP檢測方法，其特征在于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件為63°C溫育lh，80°C保溫5min ;反應(yīng)體系為10 XThermoPol緩沖液 2.5yL，10 μπιοΙ/L 外引物 F3 O. 5 μ L, 10 ymol/L 外引物 Β3 O. 5 μ L, 40 ymol/L 環(huán)引物 LF O. 5 μ L, 40 ymol/L 環(huán)引物 LB O. 5 μ L, 40 μ mol/L 內(nèi)引物 FIP I. O μ L，40 μ mol/L內(nèi)引物 BIP I. O μ L，10 mmol/L dNTPs 4. Ομ L,5 mol/L 甜菜堿 6. OyL, 150 mmol/L 硫酸鎂 I. 0 μ L，8 U/μ L Bst DNA 聚合酶大片段 I. O μ L，100 ng/ μ L DNA 模板 2· O μ L, ddH204· 5 μ L0
全文摘要
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12的LAMP檢測引物及方法。所述LAMP檢測引物如SEQIDNO1-6，利用所述的LAMP檢測引物，以BstDNA聚合酶大片段啟動(dòng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，通過觀察濁度，或加入顯色液觀察顏色變化來判定檢測結(jié)果。本發(fā)明提供的一種普遍適用于基層實(shí)驗(yàn)室的快速、簡便、準(zhǔn)確、特異檢測轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12的LAMP檢測引物及方法，快速、高效、簡便，擴(kuò)增特異性高，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102965444SQ20121053069
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者邵碧英, 陳文炳, 曾瑩, 繆婷玉, 彭娟 申請(qǐng)人:福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心