專利名稱：一種提高集胞藻pcc6803脂肪酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含有兩個以上雙鍵且碳原子數(shù)為16-22的直鏈脂肪酸。是構(gòu)成高等動、植物細(xì)胞的重要成分之一，對人體具有重要的生理功能。在營養(yǎng)學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著重要作 用。目前市場上的多不飽和脂肪酸的主要來源是深海魚類，但從魚體內(nèi)提取的PUFA具有較重的魚腥味，且魚油資源有限，價格昂貴，存在潛在的污染問題及因過度捕殺致使全球魚類數(shù)量下降，影響海洋生物的多樣化并造成沿岸生態(tài)系統(tǒng)的破壞，進(jìn)而影響生態(tài)可持續(xù)發(fā)展。藍(lán)藻(cyanobacteria)是一類能進(jìn)行光合作用的原核生物，藍(lán)藻細(xì)胞可以利用簡單的無機(jī)物合成有機(jī)物，所表達(dá)的外源基因產(chǎn)物不形成包含體，并且多數(shù)藍(lán)藻及其提取物對人畜無毒，是轉(zhuǎn)基因研究的良好受體。集胞藻PCC 6803 (Synechocystis sp. strainPCC6803)做為一種單細(xì)胞藍(lán)藻，具有生長速度快、培養(yǎng)條件簡單、不產(chǎn)生毒素、細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單、遺傳背景清楚、方便分子操作等特點，適合于利用廣核生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)，是很好的藍(lán)藻基因工程受體。野生型集胞藻PCC 6803中亞油酸(LA)占54. 5%，Y-亞麻酸(GLA)占27. 3%，這為通過轉(zhuǎn)化外源脂肪酸脫飽和酶基因進(jìn)而增加集胞藻PCC 6803中多不飽和脂肪酸含量的研究提供了基礎(chǔ)。植物中脂酰-?；d體蛋白硫脂酶(Acyl-Acyl Carrier Proteinthioesterases, FAT)是游離脂肪酸合成的關(guān)鍵酶,能催化Acyl-ACPs脫去ACP,產(chǎn)生游離脂肪酸。對于植物脂肪酸的鏈長和飽和性有重要作用。植物Fat按其序列高同源性和底物偏好主要分為FatA和FatBl兩個基因家族，不同F(xiàn)AT對底物的選擇不同，這種底物的特異性直接導(dǎo)致了植物油脂儲存在組成上和數(shù)量上的差異。其中FatA基因家族的酶主要對油酰-ACP( 18:1-ACP)有活性，決定著植物體內(nèi)18:1輸出到質(zhì)體外的水平。在大多數(shù)植物中，F(xiàn)atBl基因家族主要傾向于生成飽和的acyl-ACP脂酰碳鏈，如對棕桐酰-ACP (16:0-ACP)、硬脂酰-ACP (18:0-ACP)有活性，單非飽和的油酰-ACP (18:1-ACP)也有少量的活性。目前已從向日葵(Helianthusannuus)、油菜(Brassica napus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)> 蓖麻(Ricinus communis)> 山竹(Garcinia mangsotana)、小麥(Triticum aestivum)、葡萄(Vitis vinifera)等多種植物中獲得FatA基因片段。FatBl基因也已在在加利福尼亞月桂樹(Umbellularia californica)、萼苣花(Cupheahookeriana)、油菜(Brassica napus)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、山竹(Garciniamangostana)、玉米(Zea mays )、毛白楊(Populustomentosa)等植物種子中獲得，但國內(nèi)外在目前的現(xiàn)有技術(shù)中對硫脂酶基因的研究很少，在花生中雖有硫脂酶基因的克隆，但是還沒有硫脂酶基因功能研究的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步驟如下(I) PCR擴(kuò)增集胞藻PCC 6803的psbA2啟動子基因片段、集胞藻PCC 6803的psbA20RF基因片段、Genbank登錄號為⑶324446的花生硫脂酶基因AhFatA和Genbank登錄號為⑶324447的花生硫脂酶基因AhFatBl ；
(2)將步驟(I)獲得的psbA2啟動子基因片段分別與步驟(I)制得的花生硫脂酶基因AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB I進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，分別制得基因片段Promotor+AhFatA 和基因片段 Promotor+AhFatBl ；(3)將步驟(2)制得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatBl經(jīng)融合PCR擴(kuò)增，制得基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBl ；(4)將步驟(I)獲得的psbA20RF基因片段經(jīng)SacII和SacI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的pBluescriptIISK plus T1T2連接,得到質(zhì)粒pBluescriptIISK plus TlT2-downstream ；分別對質(zhì)粒pBluescriptII SK plus TlT2_downstream和質(zhì)粒pUC4K進(jìn)行BamHI單酶切，電泳后分別回收pBluescriptIISK plus TlT2_downstream載體片段和pUC4K中的npt片段，對載體片段去磷酸化后與npt片段連接，得到質(zhì)粒pBluescript II SKplusTlT2-npt-downstream ；(5)將步驟(2)制得的基因片段 Promotor+AhFatA、基因片段 Promotor+AhFatBl或者步驟(3 )制得的基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB I插入步驟(4 )制得的質(zhì)粒pBluescriptll SK plus TlT2-npt_downstream 中，制得重組載體;(6)將步驟(5)制得的重組載體轉(zhuǎn)化至集胞藻PCC6803中，制得轉(zhuǎn)基因集胞藻；(7)將步驟(6)制得的轉(zhuǎn)基因集胞藻在20 30°C條件下通氣培養(yǎng)8 12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增psbA2啟動子基因片段的引物為Promotor-F: 5，-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3，；Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’ ；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位點，在其3’端引入SacI酶切位點，所用引物為psbA2-F:5’ -CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’ ；psbA2-R:5， -AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3，；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增花生硫脂酶基因AhFatA的引物為AhFatA-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGTTGAAGGTTTCATGCAACG-3’ ；AhFatA-R :5’ -GCGGTCGACTCATAATCTTGAAGCTT-3’ ；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增花生硫脂酶基因AhFatBl的引物為AhFatBl-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGGCAACTGCTGCTACTGCT-3’ ；AhFatBl-R :5’ -CTGGTCGACTTAGATGCTTTCGGCTG-3’ ；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中花生硫脂 酶基因AhFatA的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，花生硫脂酶基因AhFatBl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，融合基因AhFatA+AhFatBl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中質(zhì)粒pBluescript II SK plus T1T2采用如下方法制備擴(kuò)增大腸桿菌T1T2終止子的質(zhì)粒PKK233-2，在其5’端引入PstI酶切位點，在其3’端引入BamHI酶切位點，所用引物為T1T2-F:5’ 一ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3，；T1T2-R:5，一TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3，；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存；獲得的片段經(jīng)PstI和BamHI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的pBluescript II SK plus 連接,得到質(zhì)粒 pBluescript II SK plus T1T2。根據(jù)登陸Genbank的兩類花生硫脂酶基因序列(AhFatA :⑶324446 ；AhFatBI ⑶324447)，通過RT-PCR方法，擴(kuò)增兩類花生硫脂酶基因編碼區(qū)全長序列，其中AhFatA基因信使RNA序列為1119個堿基，編碼372個氨基酸(序列如SEQ ID NO. 3所示)，AhFatBl基因信使RNA序列為1242個堿基,編碼413氨基酸(序列如SEQ ID NO. 4, Arachis hypogaeaL.所示)。有益效果(I)本發(fā)明所述方法在集胞藻PCC6803中表達(dá)花生硫脂酶基因AhFatA和AhFatBl及兩類基因的融合基因(AhFatA+AhFatBl)，通過轉(zhuǎn)基因方法增加脂酰-?；d體蛋白硫脂酶基因的表達(dá)。(2)本發(fā)明所述方法獲得的轉(zhuǎn)基因集胞藻在30°C混養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)AhFatA基因陽性集胞藻PCC6803的亞油酸含量增加了 24. 6%，α -亞麻酸含量增加了 18. 8% ;轉(zhuǎn)AhFatBl基因陽性集胞藻PCC6803的硬脂酸含量增加了 116. 8%，α -亞麻酸含量增加了 56. 2% ;轉(zhuǎn)AhFatA+AhFatBl基因陽性集胞藻PCC6803的硬脂酸含量增加了 211. 8%，α -亞麻酸含量增加了 19. 9%，十八碳四烯酸含量則增加了 11.6%。(3)本發(fā)明所述方法獲得的轉(zhuǎn)基因集胞藻在20°C混養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)AhFatA基因陽性集胞藻PCC6803的α -亞麻酸和十八碳四烯酸含量分別增加了 49. 2%和34. 8% ;RAhFatBl基因陽性集胞藻PCC6803的棕櫚油酸和Y -亞麻酸酸含量分別增加了 53. 8%和57. 3% ;轉(zhuǎn)AhFatA+AhFatBl基因陽性集胞藻PCC6803的油酸和α -亞麻酸含量分別增加了 42. 5%和19. 0%。(4)本發(fā)明所述方法獲得的轉(zhuǎn)基因集胞藻具有較強(qiáng)的低溫耐受性。
(5)本發(fā)明首次在集胞藻PCC6803中表達(dá)硫脂酶基因，為對于提高集胞藻PCC6803總脂肪酸含量、增強(qiáng)其生物量具有重要意義，這為集胞藻PCC6803中多不飽和脂肪酸的研究提供了理論支持。


圖1為花生硫脂酶基因轉(zhuǎn)集胞藻同源重組載體結(jié)構(gòu)圖；其中A、表達(dá)載體pSDFatA, B、表達(dá)載體 pSDFatBl, C、表達(dá)載體 pSDFatA+FatBl ；圖2為30°C混養(yǎng)條件下外源硫脂酶基因在集胞藻PCC6803中的表達(dá)量柱狀圖；圖3為20°C混養(yǎng)條件下外源硫脂酶基因在集胞藻PCC6803中的表達(dá)量柱狀圖； 圖4為AhFatA基因在集胞藻PCC6803中表達(dá)的Western blot分析；其中1、野生型集胞藻PCC6803 ;2、含表達(dá)載體pSDFatA的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803 ;3、含表達(dá)載體pSDFatA+FatBl的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803。圖5為AhFatBl基因在集胞藻PCC6803中表達(dá)的Western blot分析；1:野生型集胞藻PCC6803 ；2 :含表達(dá)載體pSDFatBl的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803 ；3 含表達(dá)載體pSDFatA+FatBl的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803。圖6為30°C混養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)硫脂酶基因?qū)迳L的影響；圖7為20°C混養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)硫脂酶基因?qū)迳L的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合說明書附圖及實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實驗材料來源大腸桿菌菌株(Escherichia coli) DH5 α及Τ3載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；野生型集胞藻PCC6803購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫；質(zhì)粒ρΚΚ233-2 購自 Clontech 公司；質(zhì)粒pBluescript II SK plus購自天津博美科生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒PUC4k購自中國質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心；其它所使用的酶、試劑及試劑盒等均為市售產(chǎn)品。實施例1分離克隆用于構(gòu)建轉(zhuǎn)集胞藻PCC6803表達(dá)載體的花生硫脂酶基因AhFatA、花生硫脂酶基因AhFatBl和融合基因AhFatA+AhFatBl的cDNA片段及同源重組片段psbA20RFcDNA片段。集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段克隆根據(jù)GenBank 登陸的集胞藻 PCC6803 (登錄號BA000022，AP012205，序列如 SEQID NO. 7, Synchocystis sp. PCC6803 所不)中 psbA20RF cDNA 序列設(shè)計引物psbA2-F 5，-CTTGCGGCCGCCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3，，psbA2-R 5，AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3，，擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，58°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后；72°C延伸10min，4°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳切膠回收，連接到T3載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，篩選陽性克隆并測序。獲得集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段。集胞藻PCC 6803的psbA2啟動子基因片段克隆根據(jù)GenBank 登陸的集胞藻 PCC 6803 (登錄號BA000022，AP012205)中psbA20RF前端序列設(shè)計引物，將psbA20RF前500bp作為啟動子序列(序列如SEQ ID NO. 6，Synchocystis sp. PCC6803 所不)，設(shè)計 PCR 引物Promotor-F: 5，-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3，，
Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTT ATGTAT-3’，擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C延伸10min，4°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳切膠回收，連接到T3載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，篩選陽性克隆并測序。獲得集胞藻PCC 6803的psbA2啟動子基因片段。大腸桿菌T1T2終止子片段克隆根據(jù)GenBank登陸的大腸桿菌T1T2(U02439.1)片段序列(序列如SEQ ID NO :8，)設(shè)計引物T1T2-F:5’ -ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3，；T1T2-R:5， -TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3，；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存；基因片段Promotor+AhFatA 克隆根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的花生FatA序列(登錄號為⑶324446)設(shè)計擴(kuò)增引物，所用引物為AhFatA-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGTTGAAGGTTTCATGCAACG-3’ ；AhFatA-R :5’ -GCGGTCGACTCATAATCTTGAAGCTT-3’ ；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C延伸10min，4°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳切膠回收，獲得花生硫脂酶基因AhFatA。分別取psbA2啟動子基因片段和花生硫脂酶基因AhFatA各2μ I為模板，進(jìn)行融合 PCR 反應(yīng)，程序為94 0C 5min, (94 °C lmin, 55 °C lmin, 72 °C 5min) 2cycles,加入引物 Promotor-F 和 AhFatA-R 各 O. 5 μ 1，進(jìn)行如下程序(94 °C 30s, 55 °C 30s,72°C 3min)25cycles，72°C 10min，4°C保存。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物連接到T3載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，篩選陽性克隆并測序。獲得基因片段Promotor+AhFatA?；蚱蜳romotor+AhFatBl 克隆根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的花生FatBl序列(登錄號為⑶324447，⑶324448，EF117308, EF117305, EF117306, EF117309, EF117307)設(shè)計擴(kuò)增引物，所用引物為AhFatBl-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGGCAACTGCTGCTA CTGCT-3’ ；AhFatBl-R :5’ -CTGGTCGACTTAGATGCTTTCGGCTG-3’ ；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳切膠回收，獲得花生硫脂酶基因AhFatBl。分別取psbA2啟動子基因片段和花生硫脂酶基因AhFatBl各2μ I為模板，進(jìn)行融合 PCR 反應(yīng)，所用程序為-MV 5min, (94°C lmin, 55°C lmin, 72°C 5min) 2cycles，加入引物 Promotor-F 和 AhFatBl-R 各 O. 5 μ 1，進(jìn)行如下程序(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min)25cycles,72°C 10min，4°C保存。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物連接到T3載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選陽性克隆并測序。獲得基因片段Promotor+AhFatBl?；蚱蜳romotor+AhFatA+AhFatBl 克隆分別取上述獲得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatBl 各2μ I為模板，進(jìn)行融合PCR反應(yīng)，所用程序為94°C 5min, (94 °C lmin, 60 °C lmin,72 °C 5min) 2cycles,加入引物 Promotor-F 和 AhFatBl-R 各 O. 5 μ I,進(jìn)行如下程序(94 0C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 3min) 25cycles, 72 °C 10min，4 °C 保存。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物連接到T3載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，篩選陽性克隆并測序，獲得基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBlο實施例2轉(zhuǎn)集胞藻PCC6803表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化為更好地研究花生硫脂酶基因的功能，本發(fā)明人通過過表達(dá)技術(shù)使花生硫脂酶基因AhFatA和AhFatBl在集胞藻PCC6803中表達(dá)，根據(jù)轉(zhuǎn)基因陽性集胞藻的表型和脂肪酸組成研究該花生硫脂酶基因的功能。質(zhì)粒pBluscript SK plus T1T2 的制備擴(kuò)增大腸桿菌T1T2終止子的質(zhì)粒PKK233-2，在其5’端引入PstI酶切位點，在其3’端引入BamHI酶切位點，所用引物為T1T2-F:5’ -ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3，；T1T2-R:5’ -TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’ ；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。獲得的片段經(jīng)PstI和BamHI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的pBluscript SK plus 連接,得到質(zhì)粒 pBluscript SK plus T1T2。轉(zhuǎn)集胞藻PCC6803表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下將實施例1制得的psbA20RF陽性克隆(含psbA20RF cDNA片段)用SacII和SacI雙酶切，回收psbA20RF cDNA片段；用同樣的方法雙酶切質(zhì)粒pBluescript II SKplus T1T2回收載體片段I。用回收的psbA20RF cDNA片段和載體片段I做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。通過篩選陽性克隆，獲得前期載體，命名為pBluescript II SK plusTlT2_downstream0將質(zhì)粒用BamHI單酶切，回收卡那霉素抗性npt片段,質(zhì)粒pBluescript IISKplus TlT2-downstream用BamHI單酶切，回收載體片段2。用回收的npt片段和載體片段2做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，通過酶切篩選陽性克隆，獲得卡那霉素抗性載體，命名為 pBluescript II SK plus TlT2-npt-downstream。將實施例1 中得到的陽性克隆 Promotor+AhFatA、Promotor+AhFatBl、Promotor+AhFatA+AhFatBl 質(zhì)粒 DNA 分別用 Sail 酶切，回收基因片段 Promotor+AhFatA、基因片段Promotor+AhFatBl和基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBl。同樣，對含有T1T2終止子且具有卡那霉素抗性的質(zhì)粒pBluescript II SK plus TlT2npt_downstream進(jìn)行Sail單酶切，回收載體片段3。分別將基因片段Promotor+AhFatA、基因片段Promotor+AhFatBl和基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBl和載體片段3做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。通過酶切篩選陽性克隆，獲得集胞藻PCC6803原核表達(dá)載體，分別命名為表達(dá)載體pSDFatA (見圖1A)、表達(dá)載體pSDFatBl (見圖1B)、表達(dá)載體pSDFatA+FatBl (見圖1C)。通過自然轉(zhuǎn)化方法(Williams,J. G. K. (1988)Construction of specificmutations inphotosystem 11 photosynthetic reaction center by geneticengineering methods in Synechocystis 6803. Methods Enzymol. 167:766-778.)將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入集胞藻PCC6803中，經(jīng)抗生素篩選，鑒定得到轉(zhuǎn)基因陽性集胞藻。具體步驟取對數(shù)培養(yǎng)期(0D730 = 0.6)的集胞藻PCC680330ml于室溫，4500g離心8min，棄上清；加新鮮BG-1l洗滌一次后，加新鮮BG-1l至終 濃度0D730 = 4. 8，并立刻用來轉(zhuǎn)化；將收集的藻液分裝到到1. 5ml EP管中(每管400 μ I),每管加5_10 μ g質(zhì)粒，弱光條件下光照溫育6小時，期間搖晃一次。將混合物涂到含有卡那抗生素(12yg/ml)的BG-1l平板上。約10天可見轉(zhuǎn)化子。制得含表達(dá)載體pSDFatA的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803、含表達(dá)載體pSDFatBl的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803、含表達(dá)載體pSDFatA+FatBl的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803。實施例3轉(zhuǎn)基因集胞藻陽性植株中花生硫脂酶基因AhFatA、花生硫脂酶基因AhFatBl和AhFatA+AhFatBl基因表達(dá)量水平檢測以含表達(dá)載體pSDFatA、pSDFatBl、pSDFatA+FatBl的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803為材料,提取總RNA進(jìn)行Real time quantitative PCR分析。具體操作步驟如下取50ml OD =1. 8的藍(lán)藻,4°C, 5000rpm離心IOmin收集藻細(xì)胞，液氮中研磨至細(xì)粉面狀后加入1. 5ml離心管中，迅速加入Iml TRIZ0L(Invitrogen),顛倒混勻，室溫靜置5min,4°C, 11900rpm離心IOmin,取上清液至新的1. 5ml離心管中，加入200 μ I三氯甲烷，用手劇烈震蕩15s，靜置3-5min，4°C，11900rpm離心10_15min。取上清到新的1. 5ml離心管中，加入500ml異丙醇,顛倒混勻后室溫靜置lOmin。4°C, 11900rpm離心IOmin0去上清,加入Iml 75%乙醇,顛倒振蕩幾次,4°C, 7500rpm離心lOmin。棄上清,室溫下敞口晾干至沉淀透明。加入適量DEPC-H2O溶解沉淀。以上述制得的含表達(dá)載體pSDFatA的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803、含表達(dá)載體pSDFatBl的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803、含表達(dá)載體pSDFatA+FatBl的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803總RNA為模板，用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA。具體操作步驟如下依次加入I μ I Oligo dT Primers (2. 5 μ Μ) > I μ I dNTPMixture (IOmM)、2 μ g 總 RNA 和 DEPC-H20 至 10 μ I。于 PCR 儀上 65 °C，5min 進(jìn)行變性退火反應(yīng)。離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物等的混合液聚集于離心管底部。依次加入4μ1
5X PrimeScript Buffer>0. 5 μ IRNase Inhibitor(40U/μ I)、0·5 μ I PrimeScriptRNase (for 2step)和 5 μ I RNase Free ddH20。42°C，30min 后 95°C 5min。即已獲得第一鏈cDNA。以獲得的第一鏈cDNA為模板，以集胞藻PCC6803rnpB基因為內(nèi)參基因，以TaKaTa公司 PrimeScript RT reagent Kit (Perfect RealTime)進(jìn)行 Real-time quantitativePCR檢測。其中集胞藻PCC6803rnpB內(nèi)參基引物序列為上游引物P1: 5 ’ -GTGAGGACAGTGCCACAGAA-3，；下游引物P2 :5，-TGCACCCTTACCCTTTTCAG-3 ’ ；AhFatA 基因的 Real-time quantitative PCR 引物序列為上游引物P3 :5 ’ -AGGCCTCATATGGGTCACTG-3，；下游引物P4 :5 ’ -TGACTTGATCGGTCGCATAG-3，； AhFatBl 基因的 Real-time quantitative PCR 引物序列為上游引物P5 :5 ’ -GCAGCCAATCTTGGAGAGTC-3，；下游引物P6 :5 ’ -TCAGCACCATCTTCAAGTCG-3 ’。Real-time quantitative PCR 具體操作步驟如下依次加入 12. 5 μ I 2X SYBRpremix Ex Taq (TM)、上下游引物各1. O μ l、cDNA 模板 2· O μ I 和 8· 5 μ I ddH20。95°C預(yù)變性lmin。95°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s，42 個循環(huán)。95°C 10s, 58°C 30s, 72°C 5min。55°C Is,81個循環(huán)，每隔0.5s檢測一次。實施例4轉(zhuǎn)基因集胞藻陽性植株中AhFatA、AhFatBl和AhFatA+AhFatBl蛋白水平檢測以轉(zhuǎn)化AhFatA、AhFatBl和AhFatA+AhFatBl基因的集胞藻和野生型集胞藻PCC6803為材料,提取藻總蛋白，利用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)基因陽性集胞藻種AhFatA、AhFatBl和AhFatA+AhFatBl蛋白質(zhì)水平。具體方法如下取自養(yǎng)生長的藻細(xì)胞離心收集后用5mL40mM的Tris-Cl (pH8. O)懸浮，然后加入適量的直徑為O. 17mm左右的玻璃珠(購自Sigma公司)至玻璃珠界面上方有O. 5mL的懸浮液。通過渦旋振蕩器以最大速率震蕩lmin，然后置于冰上lmin，如此重復(fù)5次。在4000rpm低速離心IOmin收集上清，再將所收集的上清用較高轉(zhuǎn)速6000rpm進(jìn)行離心lOmin，收集上清。即得到藻細(xì)胞總蛋白。取適量樣品，加等體積的2XBSA，沸水中煮10分鐘。離心后放-201存放。取少量樣品，稀釋一定倍數(shù)(5\、10\、20\)，以401111 Tris-Cl (pH8. O)為參照空白，測蛋白質(zhì)濃度。利用10%SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，每個上樣孔50yg蛋白。電泳結(jié)束后，通過印記法轉(zhuǎn)移到PVDF膜。然后按照何慶芳等人的方法進(jìn)行免疫化學(xué)分析，檢測AhFatA、AhFatBl 和 AhFatA+AhFatBl 蛋白質(zhì)水平(Qingfang He 等，Eur. J. Bilchem. , 1999,263，561-570)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因集胞藻中，均檢測出AhFatA、AhFatBI和AhFatA+AhFatBl蛋白質(zhì)水平，而野生型中則沒有信號，見圖4，圖5。實施例5轉(zhuǎn)基因集胞藻陽性植株中脂肪酸成分分析在30°C，30 μ E. m_2. s—1持續(xù)光照下，取轉(zhuǎn)基因集胞藻和野生型集胞藻，離心后收集菌體，40°C干燥，經(jīng)甲酯化后進(jìn)行氣象色譜分析；具體步驟如下(I)稱取適量樣品于厭氧培養(yǎng)管中。(2)加入氯乙酰甲醇4mL。氯乙酰甲醇=1:10 (體積比)。(3)精確加入ImL含有C19:0內(nèi)標(biāo)的正己烷溶液。內(nèi)標(biāo)濃度為lmg/mL。(4)蓋緊管蓋，80°C水浴兩小時。取出冷卻至室溫。(5)加入7%的碳酸鉀溶液5mL,振蕩均勻,靜置lOmin, I, OOOrpm離心5min分層。
(6)吸取上層液相，由中國農(nóng)大農(nóng)業(yè)部飼料研究中心進(jìn)行氣相色譜分析。與對照野生型集胞藻PCC6803相比，在30°C混養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)基因集胞藻
PCC6803pSDFatA、pSDFatBl、pSDFatA+FatBl脂肪酸含量變化如表I所示，20°C混養(yǎng)條件下
轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803pSDFatA、pSDFatBl、pSDFatA+FatBI脂肪酸含量變化如表2所示。表I
權(quán)利要求
1.一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步驟如下 (1)PCR擴(kuò)增集胞藻PCC6803的psbA2啟動子基因片段、集胞藻PCC 6803的psbA20RF基因片段、Genbank登錄號為⑶324446的花生硫脂酶基因AhFatA和Genbank登錄號為⑶324447的花生硫脂酶基因AhFatBl ； (2)將步驟(I)獲得的psbA2啟動子基因片段分別與步驟(I)制得的花生硫脂酶基因AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB I進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，分別制得基因片段Promotor+AhFatA 和基因片段 Promotor+AhFatBl ； (3)將步驟(2)制得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatBl經(jīng)融合PCR 擴(kuò)增，制得基因片段 Promotor+AhFatA+AhFatBl ； (4)將步驟(I)獲得的psbA20RF基因片段經(jīng)SacII和SacI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的 pBluescript II SK plus T1T2 連接，得到質(zhì)粒 pBluescript II SK plusTlT2-downstream ； 分別對質(zhì)粒 pBluescript II SK plus TlT2_downstream 和質(zhì)粒 pUC4K 進(jìn)行 BamHI單酶切，電泳后分別回收pBluescript II SK plus TlT2_downstream載體片段和pUC4K中的npt片段，對載體片段去磷酸化后與npt片段連接，得到質(zhì)粒pBluescript II SKplusTlT2-npt-downstream。
(5)將步驟(2)制得的基因片段Promotor+AhFatA、基因片段Promotor+AhFatBl或者步驟(3)制得的基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBl插入步驟(4)制得的質(zhì)粒pBluescriptIISK plus TlT2-npt_downstream 中，制得重組載體； (6)將步驟(5)制得的重組載體轉(zhuǎn)化至集胞藻PCC6803中，制得轉(zhuǎn)基因集胞藻； (7)將步驟(6)制得的轉(zhuǎn)基因集胞藻在20 30°C條件下通氣培養(yǎng)8 12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增psbA2啟動子基因片段的引物為Promotor-F:5’ -GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’ ；Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’ ； 擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位點，在其3’端引入SacI酶切位點，所用引物為psbA2-F :5’ -CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’ ；psbA2-R :5’ AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3’ ； 擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增花生硫脂酶基因AhFatA的引物為AhFatA-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGTTGAAGGTTTCATGCAACG-3’ ；AhFatA-R :5’ -GCGGTCGACTCATAATCTTGAAGCTT-3’ ；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增花生硫脂酶基因AhFatBl的引物為AhFatBl-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGGCAACTGCTGCTACTGCT-3’ ；AhFatBl-R :5’ -CTGGTCGACTTAGATGCTTTCGGCTG-3’ ； 擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中花生硫脂酶基因AhFatA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，花生硫脂酶基因AhFatBl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，融合基因AhFatA+AhFatBl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中質(zhì)粒pBluescriptIISKplus T1T2采用如下方法制備 擴(kuò)增大腸桿菌T1T2終止子的質(zhì)粒ρΚΚ233-2，在其5’端引入PstI酶切位點，在其3’端弓丨入BamHI酶切位點，所用引物為T1T2-F:5’ -ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’ ；T1T2-R:5’ -TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’ ； 擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存；獲得的片段經(jīng)PstI和BamHI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的pBluescript II SK plus 連接,得到質(zhì)粒 pBluescript II SK plus T1T2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步驟如下(1)PCR擴(kuò)增psbA2啟動子、花生硫脂酶基因AhFatA和AhFatB1；(2)經(jīng)融合PCR，Promotor+AhFatA和Promotor+AhFatB1；(3)經(jīng)融合PCR擴(kuò)增，制得Promotor+AhFatA+AhFatB1；(4)插入質(zhì)粒中，制得重組載體；(5)經(jīng)轉(zhuǎn)化制得轉(zhuǎn)基因集胞藻；(6)在30℃條件下培養(yǎng)，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。本發(fā)明所述方法獲得的轉(zhuǎn)基因集胞藻在30℃混養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)AhFatA基因陽性集胞藻PCC6803的亞油酸含量明顯增加，具有廣闊應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/63GK103014037SQ201210529390
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者畢玉平, 陳高, 何慶芳, 張燕, 李偉智, 邊斐, 范仲學(xué), 單雷, 彭振英, 馬德源 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心