專利名稱：特異分子標(biāo)記法鑒定煙草 “中煙90” 品種純度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異分子標(biāo)記法鑒定煙草“中煙90”品種純度的方法，屬于煙草育種與生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
種子是農(nóng)業(yè)最基本的生產(chǎn)資料，種子質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前主栽煙草品種混雜和種子退化比較嚴(yán)重，給農(nóng)民帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。開展種子純度檢驗(yàn)對保證種子質(zhì)量和提高煙草生產(chǎn)效益具有重要意義。
種子純度是評價(jià)煙草種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，目前我國采用的煙草種子純度鑒定方法主要為常規(guī)鑒定法。其中常規(guī)鑒定法主要包括種子形態(tài)鑒定法、幼苗形態(tài)鑒定法、物理化學(xué)鑒定法、大田期形態(tài)鑒定法。這些方法在煙草種子純度和品種一致性的檢測中起著重要的作用，但是這些方法都有一定的缺陷或局限性，主要為所需費(fèi)用高、周期長的問題。特別是小區(qū)種植鑒定，需5-7個(gè)月才能完成，且許多性狀受栽培技術(shù)及環(huán)境因素的影響，其結(jié)果會產(chǎn)生偏差，同時(shí)鑒定者的觀測經(jīng)驗(yàn)也制約著鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，20世紀(jì)80年代開始，生化鑒定開始應(yīng)用到煙草種子純度，主要包括同工酶電泳、蛋白質(zhì)電泳、高效液相色譜等方法，這些方法發(fā)展很快，檢驗(yàn)種子純度準(zhǔn)確性高。但是，這類檢測技術(shù)成本相對較高，且遺傳信息量有限，加上烤煙品種遺傳背景狹窄，這些方法揭示品種間的多態(tài)性有限，其應(yīng)用受到了限制。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，作為育種的輔助工具，具有高效、準(zhǔn)確、不受環(huán)境影響等特點(diǎn)，其應(yīng)用越來越受到重視。特別是SSR標(biāo)記技術(shù)，具有結(jié)果可靠，重復(fù)性好，多態(tài)性豐富，操作簡單，呈共顯性遺傳等特點(diǎn)。十分有利于種子純度檢驗(yàn)。只要找到特異的SSR引物，在一個(gè)品種中具有特征帶，就可以快速鑒定出雜種。“中煙90”是中國農(nóng)科院煙草科學(xué)研究所通過SpeightG-28、單育2號和凈葉黃三親本復(fù)合雜交，經(jīng)分類選擇、定向培育的一個(gè)具有多抗性且推廣面積較大的烤煙新品。通過與“K326”品種作對比試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，“中煙90”品種具有以下優(yōu)點(diǎn)1、優(yōu)質(zhì)適產(chǎn)。該品種與“K326”對比，平均每畝增加煙葉20干克；2、抗病性明顯?！爸袩?0”對黑脛病、赤星病和氣候斑病的抗性比“K326”的強(qiáng)。3、農(nóng)藝性狀好?！爸袩?0”植株呈筒型，葉為長橢圓形，株高90-120厘米，可留葉21片左右。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種特異分子標(biāo)記法鑒定煙草“中煙90”品種純度的方法；目的在于利用主栽煙草品種中的特征SSR引物，提供一種快速、高效鑒定煙草“中煙90”品種純度的方法。一種特異分子標(biāo)記法鑒定煙草“中煙90”品種純度的方法，包括如下步驟(I)設(shè)計(jì)特異性引物，以煙草品種“中煙90”的基因組DNA (采用CTAB/NaCl法)為模板，得到“中煙90”特征條帶，“中煙90”特征條帶大小分別為159bp和98bp (圖I)。
所述特異性引物為正向引物F 5/ — GAACAGATTGCTGAAACTGAGAGA—3'其序列如 Seq ID No 1 所示；反向引物R 5/ — GATGAGGTGGAGGCACAAG—3'其序列如 Seq ID No :2 所示；(2)進(jìn)行品種鑒定以待測品種的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增總體積為15μ 1，具體為 I. 5μ I 的 10 X PCRbuffer, 2. 5mmol/L 的 MgCl2,0. 25mmol/L 的 dNTPs, Taq 酶 I. 0U，模板DNA20-25ng，步驟I)所述的正向和反向引物各O. 36 μ mol/L，不足部分ddH20補(bǔ)足；PCR擴(kuò)增在MYCYCLE擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)镈NA 94°C預(yù)變性4min ;94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C復(fù)性lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ;最后擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存。(3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳緩沖液為I X TBE,電壓120V，電泳時(shí)間2. 5小時(shí)；電泳結(jié)束后，凝膠顯色采用銀染方法，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察、照相。(4)品種的鑒定依據(jù)步驟3)中待測樣品的凝膠成像，對照步驟I)中“中煙90”的特征條帶，若有“中煙90”的特征條帶出現(xiàn)的，則為“中煙90”純種；若無“中煙90”特征條帶出現(xiàn)的，則為雜種。
本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到了擴(kuò)增出“中煙90”特征條帶的特異性引物，利用“中煙90”的特征引物進(jìn)行純度檢驗(yàn)，檢測結(jié)果可靠且直觀，相比傳統(tǒng)的常規(guī)檢測方法操作簡單，檢測效率高，成本更低。


圖I為本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物在9個(gè)品種中的擴(kuò)增結(jié)果，其中1.K326 ；2.中煙 90 ;3. NC89 ;4. NC297 ;5.中煙 100;6.翠碧一號；7.紅花大金元；8. K346 ;9.云煙 87;M. Marker ;箭頭指向?yàn)椤爸袩?0”特征帶分別為159bp和98bp。圖2為“中煙90”品種純度鑒定，品種順序如表I中的編號。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I確定中煙90特征帶I、供試材料如表I:表I供試材料
權(quán)利要求
1. 一種特異分子標(biāo)記法鑒定煙草“中煙90”品種純度的方法，其特征在于包括如下步驟 1)設(shè)計(jì)特異性引物，以煙草品種“中煙90”的基因組DNA為模板，采用CTAB/NaCl法擴(kuò)增得到“中煙90”特征條帶，“中煙90”特征條帶大小分別為159bp和98bp ； 所述特異性引物為 正向引物 F 5/ — GAACAGATTGCTGAAACTGAGAGA— 3'其序列如 Seq ID No 1 所示； 反向引物 R 5/ 一GATGAGGTGGAGGCACAAG— 3'其序列如 Seq ID No 2 所示； 2)進(jìn)行品種鑒定 以待測品種的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增總體積為15 μ I，具體為I.5μ I 的 10 X PCRbuffer, 2. 5mmol/L 的 MgC12，0. 25mmol/L 的 dNTPs, Taq 酶 I. 0U,模板DNA20-25ng，步驟I)所述的正向和反向引物各O. 36 μ mol/L，不足部分ddH20補(bǔ)足；PCR擴(kuò)增在MYCYCLE擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)镈NA 94°C預(yù)變性4min ;94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C復(fù)性lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ;最后擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存； 3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳 擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳緩沖液為1XTBE，電壓120V，電泳時(shí)間2. 5小時(shí)；電泳結(jié)束后，凝膠顯色采用銀染方法，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察、照相； 4)品種的鑒定 依據(jù)步驟3)中待測樣品的凝膠成像，對照步驟I)中“中煙90”的特征條帶，若有“中煙90”的特征條帶出現(xiàn)的，則為中煙90純種；若無中煙90特征條帶出現(xiàn)的，則為雜種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種特異分子標(biāo)記法鑒定煙草“中煙90”品種純度的方法，是利用SSR分子標(biāo)記鑒定烤煙“中煙90”品種的純度；本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到了擴(kuò)增出中煙90特征條帶的特異性引物，利用“中煙90”的特征引物進(jìn)行純度檢驗(yàn)，檢測結(jié)果可靠且直觀，相比傳統(tǒng)的常規(guī)檢測方法操作簡單，檢測效率高，成本更低。利用本發(fā)明檢驗(yàn)周期短，即在苗期階段就可通過本方法檢測種子純度，且標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，不受人為以及環(huán)境的影響，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
文檔編號C12Q1/68GK102965443SQ20121052925
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者楊龍, 黃莉莎, 王玉軍, 曹恒春, 王毅 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)