專利名稱：集胞藻高效雙同源重組載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具體涉及集胞藻高效雙同源重組載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，特別涉及一種集胞藻PCC6803遺傳轉(zhuǎn)化高效雙同源重組載體及其構(gòu)建方法與在集胞藻PCC6803脂肪酸合成中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
藍(lán)藻(cyanobacteria)又稱藍(lán)細(xì)菌，是一類能進(jìn)行光合作用的原核生物。藍(lán)藻細(xì) 胞可以利用簡單的無機(jī)物合成有機(jī)物，所表達(dá)的外源基因產(chǎn)物不形成包含體，并且多數(shù)藍(lán)藻及其提取物對人畜無毒，是轉(zhuǎn)基因研究的良好受體。集胞藻PCC 6803 (Synechocystissp. strainPCC6803)做為一種單細(xì)胞藍(lán)藻，具有生長速度快、培養(yǎng)條件簡單、不產(chǎn)生毒素、細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單、遺傳背景清楚、方便分子操作等特點(diǎn)，適合于利用廣核生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)，是很好的藍(lán)藻基因工程受體。鑒于藍(lán)藻表達(dá)的外源基因產(chǎn)物易純化、不含毒素、藻細(xì)胞培養(yǎng)成本低且不容易污染等的優(yōu)點(diǎn)，隨著藻類基因工程的發(fā)展，使利用藍(lán)藻作為外源基因表達(dá)載體以生產(chǎn)藥物等高附加值產(chǎn)品成為可能。藍(lán)藻基因改造大體分為三個(gè)階段第一，外源DNA通過基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞；第二，外源DNA在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制并得以表達(dá)；第三，外源DNA與宿主細(xì)胞染色體或內(nèi)源質(zhì)粒結(jié)合，或者在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制。外源DNA進(jìn)入藍(lán)藻細(xì)胞在以下幾種情況下可以穩(wěn)定存在首先，外源基因重組進(jìn)宿主染色體；其次，外源基因重組進(jìn)宿主內(nèi)源質(zhì)粒；第三，外源基因以質(zhì)粒形式存在并且能自主復(fù)制。同源重組分單交換形式和雙交換兩種類型。其中同源重組雙交換載體是在外源基因兩側(cè)均有一段與宿主細(xì)胞染色體同源的片段，當(dāng)重組質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，載體上外源基因兩端的同源序列分別與宿主細(xì)胞內(nèi)染色體的相應(yīng)部位發(fā)生交換。這樣，重組載體上的外源基因就隨著同源序列進(jìn)而整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體上，載體上其余片段沒有進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體中。所以，外源基因在外源基因的表達(dá)單元自帶的調(diào)控元件的作用下表達(dá)或者在宿主染色體調(diào)控下表達(dá)。因?yàn)橥粗亟M載體中不含藍(lán)藻中復(fù)制的起始位點(diǎn)，所以在宿主細(xì)胞內(nèi)會(huì)因?yàn)闊o法復(fù)制繼而漸漸丟失。同源重組整合載體上沒有能在藻細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制子，不能獨(dú)立復(fù)制，但含有與宿主染色體同源序列,質(zhì)粒載體進(jìn)入宿主細(xì)胞以后,可通過與宿主細(xì)胞染色體同源序列發(fā)生同源重組單交換或者雙交換，進(jìn)而將外源基因整合到宿主細(xì)胞染色體上，以低拷貝數(shù)基因存在并表達(dá)。目前集胞藻PCC6803遺傳轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)很成熟，而其雙同源重組載體構(gòu)建方法種類繁多，但國內(nèi)外對同源重組載體啟動(dòng)子兼做的上游臂且高效表達(dá)外源基因的報(bào)道很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種集胞藻PCC6803遺傳轉(zhuǎn)化高效雙同源重組載體及其構(gòu)建方法與在集胞藻PCC6803脂肪酸合成中的應(yīng)用。本發(fā)明技術(shù)方案如下集胞藻高效雙同源重組載體，核苷酸序列如SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 9所示。上述集胞藻高效雙同源重組載體的構(gòu)建方法，步驟如下(I) PCR擴(kuò)增集胞藻PCC 6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段作為psbA2啟動(dòng)子基因片段、Genbank登錄號(hào)為X13547.1的集胞藻PCC 6803的psbA20RF基因片段、Genbank登錄號(hào)為U02439.1的大腸桿菌終止子T1T2基因片段、Genbank登錄號(hào)為D13780.1的集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脫氫酶基因片段和Genbank登錄號(hào)為LI 1421.1的集胞藻PCC6803Delta6脂肪酸脫氫酶基因片段； (2)將步驟(I)獲得的psbA2啟動(dòng)子基因片段分別與步驟(I)制得的集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脫氫酶基因片段和集胞藻PCC6803 Delta6脂肪酸脫氫酶基因片段進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，分別制得基因片段Promotor+Delta 15和基因片段Promotor+Delta6 ；(3)將步驟(I)制得的大腸桿菌終止子T1T2基因片段用PstI和BamHI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的pBluescript SK連接,得到質(zhì)粒pBluescript SK T1T2 ；然后將步驟(I)制得的psbA20RF基因片段用SacII和SacI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的質(zhì)粒 pBluescript SK T1T2 連接,得到質(zhì)粒 pBluescript SK TlT2-downstream ；對質(zhì)粒pBluescript SK TlT2_downstream 和質(zhì)粒 pUC4K 進(jìn)行 BamHI 單酶切，電泳后分別回收pBluescript SK TlT2_downstream載體片段和pUC4K中的npt片段,對載體片段去磷酸化后與npt片段連接,得到質(zhì)粒pBluescript SK TlT2-npt_downstream ;(4)將步驟(2)制得的基因片段Promotor+Deltal5，或者，基因片段Promotor+DeIta15 和基因片段 Promotor+Delta6 插入步驟(3)制得的質(zhì)粒 pBluescriptSKTlT2-npt-downstream 中，制得重組載體；(5)將步驟(4)制得的重組載體轉(zhuǎn)化至集胞藻PCC6803中，制得轉(zhuǎn)基因集胞藻；(6)將步驟(5)制得的轉(zhuǎn)基因集胞藻在20 30°C條件下通氣培養(yǎng)8 12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增psbA2啟動(dòng)子基因片段的引物為
Promotor-F: 5，-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3，；Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’ ；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增集胞藻PCC6803的psbA20RF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位點(diǎn)，在其3’端引入SacI酶切位點(diǎn)，所用引物為psbA2-F:5’ -CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’ ；psbA2-R:5， -AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3，；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脫氫酶基因的引物為
Syl5-F:5’ -TAAGGAATTATAACCAAATGCGTCTAGAAATTTCATCG-3’ ；Syl5-R:5’ -CGGCTGCAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAGGTTTCTTTTGATATC-3’ ；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增花生硫脂酶基因Delta6的引物為Sy6-F:5， _TAAGGAATTATAACCAAATGCTAACAGCGGAAAG_3，；Sy6-R:5， -GTCCTGCAGTCAATGATGATGATGATGATGCGATGCTTTGCCCATGGCCT-3，；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存?！じ鶕?jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中集胞藻PCC 6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，集胞藻PCC6803psbA20RF基因psbA2的核苷酸序列SEQ ID NO. 2所示，集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脫氫酶基因Syl5的核苷酸序列如SEQID NO. 3所示，集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脫氫酶基因Sy6的核苷酸序列如SEQ IDNO. 4所示。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的,所述步驟(3)中質(zhì)粒pBluescript SK T1T2的制備方法,具體如下擴(kuò)增大腸桿菌T1T2終止子的質(zhì)粒pKK233-2 (購自Clontech公司)，在其5’端引APstI酶切位點(diǎn)，在其3’端引入BamHI酶切位點(diǎn)，所用引物為T1T2-F:5’ 一ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3，；T1T2-R:5，一TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3，；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存；獲得的片段經(jīng)PstI和BamHI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的pBluescript SK 連接,得到質(zhì)粒 pBluescript SK T1T2。上述集胞藻高效雙同源重組載體在制備二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)中的應(yīng)用。本發(fā)明通過對集胞藻PCC6803psbA2基因ATG前510bp片段作為同源重組載體啟動(dòng)子兼做上游臂，以psbA2基因ORF片段為下游臂，將集胞藻PCC6803脂肪酸代謝相關(guān)的基因Deltal5和Delta6脂肪酸脫氫酶基因進(jìn)行過量表達(dá)，增強(qiáng)集胞藻PCC6803中Deltal5和Delta6脂肪酸脫氫酶基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)花生硫脂酶基因的集胞藻PCC6803中脂肪酸含量有明顯變化，并具有較強(qiáng)的低溫耐受性。本發(fā)明人根據(jù)先前登陸Genbank的集胞藻PCC6803脂肪酸脫氫酶基因序列(Deltal5 D13780.1 ；DeltaDelta6 L11421.1 )，通過 PCR 方法，擴(kuò)增兩類集胞藻 PCC6803 脂肪酸脫氫酶基因編碼區(qū)全長序列，其中Deltal5基因全長序列為1080個(gè)堿基，編碼359個(gè)氨基酸，Delta6基因全長序列為1080個(gè)堿基，編碼359個(gè)氨基酸。分別將克隆Deltal5脂肪酸脫氫酶基因(Deltal5)及Delta 15和Delta 6脂肪酸脫氫酶基因連接在構(gòu)建好的雙同源重組表達(dá)載體pBluescript SK TlT2-npt_downstream上，并轉(zhuǎn)化至集胞藻PCC6803中，得到轉(zhuǎn)基因集胞藻。在轉(zhuǎn)基因集胞藻中油酸含量明顯高于野生型。本發(fā)明用于構(gòu)建雙同源重組表達(dá)載體的集胞藻PCC6803脂肪酸脫氫酶基因的光誘導(dǎo)啟動(dòng)子psbA2基因序列如SEQ ID NO :1所示；下游臂psbA20RF序列如SEQ ID N0:2所示；大腸桿菌T1T2終止子序列如SEQ ID NO 3所示；Deltal5的cDNA序列如SEQ ID NO 4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示；Delta6的cDNA序列如SEQ ID NO 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示。有益效果(I)本發(fā)明提供了一種集胞藻PCC6803雙同源重組載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，該重組載體利用集胞藻PCC6803中psbA2基因ATG前510bp片段作為啟動(dòng)子兼做上游臂，以psbA2基因ORF片段為下游臂，將集胞藻PCC6803脂肪酸代謝相關(guān)的基因Deltal5和Delta6脂肪酸脫氫酶基因進(jìn)行過量表達(dá)，結(jié)果表明，在集胞藻PCC6803中過表達(dá)集胞藻PCC6803Delta 15、Deltal5和Delta 6脂肪酸去飽和酶基因可明顯提高集胞藻中十八碳四烯酸的含量； (2)本發(fā)明首次在集胞藻PCC6803中過表達(dá)Deltal5和Delta6脂肪酸脫氫酶基因，對于提高集胞藻PCC6803總脂肪酸含量、增強(qiáng)其生物量具有重要意義，為集胞藻PCC6803中多不飽和脂肪酸的研究提供了理論支持；(3)本發(fā)明中應(yīng)用的基因可以為微藻及植物脂肪酸研究提供支持，為進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)EPA和DHA提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)方案。


圖1為集胞藻PCC6803雙同源重組載體結(jié)構(gòu)圖；圖2為30°C混養(yǎng)條件下Deltal5脂肪酸脫氫酶基因在轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803中的Western blot 電泳圖；其中1、野生型集胞藻PCC6803 ;2、轉(zhuǎn)基因藻pSDSyl5 ；圖3為20°C混養(yǎng)條件下Deltal5脂肪酸脫氫酶基因在轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803中的Western blot 電泳圖；其中1、野生型集胞藻PCC6803 ;2、轉(zhuǎn)基因藻pSDSyl5 ；圖4為30°C混養(yǎng)條件下Deltal5脂肪酸去飽和酶基因和Delta6脂肪酸脫氫酶基因在轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803中表達(dá)的Western blot電泳圖；其中1 :野生型集胞藻PCC6803 ；2 :轉(zhuǎn)基因藻pSDSyl5Sy6 ；圖5為30°C混養(yǎng)條件下Deltal5脂肪酸去飽和酶基因和Delta6脂肪酸脫氫酶基因在轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803中表達(dá)的Western blot電泳圖；其中1 :野生型集胞藻PCC6803 ；2 :轉(zhuǎn)基因藻pSDSyl5Sy6 ；圖6為30°C混養(yǎng)條件下Deltal5脂肪酸脫氫酶基因在轉(zhuǎn)Deltal5脂肪酸脫氫酶基因集胞藻PCC6803中的表達(dá)分析；圖7為20°C混養(yǎng)條件下Deltal5脂肪酸脫氫酶基因在轉(zhuǎn)Deltal5脂肪酸脫氫酶基因集胞藻PCC6803中的表達(dá)分析；圖8為30°C混養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸去飽和酶基因和Delta6脂肪酸脫氫酶基因在轉(zhuǎn)Deltal5和Delta6脂肪酸脫氫酶基因集胞藻PCC6803中的表達(dá)分析；圖9為20°C混養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸去飽和酶基因和Delta6脂肪酸脫氫酶基因在轉(zhuǎn)Deltal5和Delta6脂肪酸脫氫酶基因集胞藻PCC6803中的表達(dá)分析； 圖10為30°C混養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)集胞藻Deltal5脂肪酸去飽和酶基因藻株脂肪酸成分氣相色譜分析；圖11為20°C混養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)集胞藻Deltal5脂肪酸去飽和酶基因藻株脂肪酸成分氣相色譜分析；圖12為30°C混養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)集胞藻Deltal5脂肪酸去飽和酶基因和Delta6脂肪酸去飽和酶基因藻株脂肪酸成分氣相色譜分析；圖13為20°C混養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)集胞藻Deltal5脂肪酸去飽和酶基因和Delta6脂肪酸去飽和酶基因藻株脂肪酸成分氣相色譜分析。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合說明書附圖及實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)驗(yàn)材料來源大腸桿菌菌株(Escherichia coli) DH5 a及T3載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；野生型集胞藻PCC6803購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫；質(zhì)粒pKK233-2 購自 Clontech 公司；質(zhì)粒pSDpbluescript SK購自天津博美科生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒PUC4k購自中國質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心；其它所使用的酶、試劑及試劑盒等均為市售產(chǎn)品。實(shí)施例1分離克隆用于構(gòu)建轉(zhuǎn)集胞藻PCC6803表達(dá)載體的集胞藻Deltal5脂肪酸去飽和酶基因Deltal5和Delta6脂肪酸去飽和酶基因Delta6的cDNA片段、雙同源重組片段psbA2啟動(dòng)子、psbA20RF cDNA片段和大腸桿菌終止子TlT2cDNA片段。集胞藻PCC 6803的psbA2啟動(dòng)子基因片段克隆根據(jù)GenBank 登陸的集胞藻 PCC 6803 (登錄號(hào)BA000022，AP012205)中psbA20RF前端序列設(shè)計(jì)引物，將psbA20RF前500bp作為啟動(dòng)子序列(序列如SEQ ID NO :1，Synchocystis sp. PCC6803 所不)，設(shè)計(jì) PCR 引物:Promotor-F: 5，-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3，，Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTT ATGTAT-3’，擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后；72°C延伸10min，4°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳切膠回收，連接到T3載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選陽性克隆并測序，獲得集胞藻PCC 6803的psbA2啟動(dòng)子基因片段。集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段克隆根據(jù)GenBank 登陸的集胞藻 PCC6803 (登錄號(hào)BA000022，AP012205，序列如 SEQID NO :2, Synchocystis sp. PCC6803 所不)中 psbA20RF cDNA 序列設(shè)計(jì)引物psbA2-F:5’ -CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’ ；
psbA2-R:5’ -AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3J ；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，58°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后；72°C延伸10min，4°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳切膠回收，連接到T3載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選陽性克隆并測序。獲得集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段。大腸桿菌T1T2終止子片段克隆根據(jù)GenBank登陸的大腸桿菌T1T2(U02439.1)片段序列(序列如SEQ ID NO :3，)設(shè)計(jì)引物
T1T2-F:5’ -ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’ ；T1T2-R:5， -TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3，；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存；基因片段Promotor+Deltal5 克隆根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的集胞藻PCC6803Deltal5序列(登錄號(hào)為D13780.1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，所用引物為Syl5-F:5， -TAAGGAATTATAACCAAATGCGTCTAGAAATTTCATCG-3，；Syl5-R:5’ -CGGCTGCAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAGGTTTCTTTTGATATC-3’ ；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后；72°C 10min，4°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳切膠回收，獲得集胞藻PCC6803的Deltal5基因片段。分別取psbA 2啟動(dòng)子基因片段和Deltal5基因片段2iU為模板，進(jìn)行融合PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 5min ；94°C lmin,55°C lmin,72°C 5min，2 個(gè)循環(huán);加入引物Promotor-F 和 Deltal5_R 各 0. 5 y I，進(jìn)行如下擴(kuò)增程序94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，25個(gè)循環(huán)；72°C 10min，4°C保存。連接到T3載體克隆載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選陽性克隆并測序。獲得基因片段Promotor+Deltal5?；蚱蜳romotor+Delta6 克隆根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的集胞藻PCC6803含有Del ta6序列(登錄號(hào)為L11421.1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，所用引物為Sy6-F:5’ _TAAGGAATTATAACCAAATGCTAACAGCGGAAAG_3’ ；Sy6-R:5， -GTCCTGCAGTCAATGATGATGATGATGATGCGATGCTTTGCCCATGGCCT-3，；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳切膠回收，獲得集胞藻PCC6803的Delta6基因片段。分別取psbA 2啟動(dòng)子和Delta6基因片段2 ill為模板，進(jìn)行融合PCR反應(yīng)，所用程序?yàn)?4 °C 5min ；94 °C lmin, 55 °C lmin, 72 °C 5min, 2 個(gè)循環(huán)；加入引物 Promotor-F和 Deltal5-R 各 0. 1，進(jìn)行如下擴(kuò)增程序94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 3min，25 個(gè)循環(huán)，72°C 10min，4°C保存。連接到T3載體克隆載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選陽性克隆并測序。獲得基因片段Promotor+Delta6。實(shí)施例2
轉(zhuǎn)集胞藻PCC6803雙同源重組表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化通過過表達(dá)技術(shù)使在集胞藻PCC6803中過量表達(dá)集胞藻PCC6803的Deltal5基因片段和Delta6基因片段，根據(jù)轉(zhuǎn)基因陽性集胞藻的表型和脂肪酸組成研究集胞藻PCC6803雙同源從組載體的構(gòu)建方法及在脂肪酸合成中的應(yīng)用。質(zhì)粒pBluscript SK plus_TlT2 的制備擴(kuò)增大腸桿菌T1T2終止子的質(zhì)粒pKK233-2 (購自Clontech公司)，在其5’端引APstI酶切位點(diǎn)，在其3’端引入BamHI酶切位點(diǎn)，所用引物為·
T1T2-F:5’ 一ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3’ ；T1T2-R:5’ 一TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3’ ；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存；獲得基因片段經(jīng)PstI和BamHI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的pBluescript SK 連接,得到質(zhì)粒 pBluescript SK T1T2。轉(zhuǎn)集胞藻PCC6803表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下將實(shí)施例1制得的psbA20RF陽性克隆(含psbA20RF基因片段)用SacII和SacI雙酶切，回收psbA20RF基因片段；用同樣的方法雙酶切質(zhì)粒pBluescript SK T1T2回收載體片段I。用回收的psbA20RF基因片段和載體片段I做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。通過篩選陽性克隆，獲得前期載體，命名為pBluescript SK TlT2_downstream。將質(zhì)粒PUC4k用BamHI單酶切，回收卡那霉素抗性npt片段,質(zhì)粒pBluescriptSKTlT2-doWnStream用BamHI單酶切，回收載體片段2。用回收的npt片段和載體片段2做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，通過酶切篩選陽性克隆，獲得卡那霉素抗性載體，命名為pBluescript SK TlT2-npt-downstream。將實(shí)施例1中得到的陽性克隆Promotor+Deltal5、Promotor+Delta6質(zhì)粒DNA分別用SalI酶切，回收基因片段Promotor+Deltal5和基因片段Promotor+Delta6。同樣，對含有T1T2終止子且具有卡那霉素抗性的質(zhì)粒pBluescript SK TlT2-npt_downstream進(jìn)行Sal I單酶切，回收載體片段3。分別將基因片段Promotor+DeltalS和基因片段Promotor+Delta6和載體片段3做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a。通過酶切篩選陽性克隆，獲得集胞藻PCC6803原核表達(dá)載體，分別命名為表達(dá)載體pSDSyl5 (見圖1A)、表達(dá)載體pSDSy6。將pSDSy6質(zhì)粒經(jīng)NdeI和SacII雙酶切后，分別連入經(jīng)相同雙酶切的pSDSyl5質(zhì)粒，得到串聯(lián)表達(dá)的pSDSyl5Sy6質(zhì)粒(見圖1B)。通過自然轉(zhuǎn)化方法(Williams,J. G. K. (1988)Construction of specificmutationsin photosystem 11 photosynthetic reaction center by geneticengineering methods inSynechocystis 6803. Methods Enzymol. 167:766-778.)將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入集胞藻PCC6803中，經(jīng)抗生素篩選，鑒定得到轉(zhuǎn)基因陽性集胞藻。具體步驟取對數(shù)培養(yǎng)期(0D730=0. 6)的集胞藻PCC680330ml于室溫，4500g離心8min，棄上清；加新鮮BG-1l液體培養(yǎng)基洗滌一次后，加新鮮BG-1l液體培養(yǎng)基至終濃度0D730=4. 8，并立刻用來轉(zhuǎn)化；將收集的藻液分裝到到1. 5ml EP管中(每管400 )，每管加5-10 y g質(zhì)粒，弱光條件下光照溫育6小時(shí)，期間搖晃一次。將混合物涂到含有卡那抗生素(12ug/ml)的BG-1l平板培養(yǎng)基上。約10天可見轉(zhuǎn)化子。制得含表達(dá)載體pSDSyl5的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803、含表達(dá)載體pSDSyl5Sy6的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因集胞藻陽性植株中Deltal5和Delta6基因表達(dá)量水平檢測以含表達(dá)載體pSDSyl5的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803、含表達(dá)載體pSDSyl5Sy6的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803為材料，提取總RNA進(jìn)行Real timequantitative PCR分析。具體方法如下采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)并利用液氮研磨法從Deltal5和Deltal5+Delta6基因的集胞藻和野生型集胞藻中提取總RNA。具體操作步驟如下取50ml0D=1.8的藍(lán)藻，4°C，5000rpm離心IOmin收集藻細(xì)胞，液氮中研磨至細(xì)粉面狀后加入1.5ml離心管中，迅速加入Iml TRIZOL (購自Invitrogen公司),顛倒混勻，室溫靜置5min,4°C, 11900rpm離心IOmin,取上清液至新的1. 5ml離心管中，加入200 U I三氯甲燒,用手劇 烈震蕩15s,靜置3 5min, 4°C，11900rpm離心10 15min。取上清到新的1. 5ml離心管中，加入500ml異丙醇,顛倒混勻后室溫靜置lOmin。4°C, 11900rpm離心lOmin。去上清,力口A Iml 75%乙醇(v/v),顛倒振蕩幾次，4°C,7500rpm離心lOmin。棄上清,室溫下敞口晾干至沉淀透明，加入適量DEPC-H2O溶解沉淀，制得Deltal5基因片段和Deltal5+Delta6基因片段的集胞藻和野生型集胞藻PCC6803總RNA。以上述制得的Deltal5基因片段和Deltal5+Delta6基因片段的集胞藻和野生型集胞藻PCC6803總RNA為模板，用TaKaRa公司生產(chǎn)的PrimeScriptTM RT-PCRKit反轉(zhuǎn)錄成cDNA。具體操作步驟如下依次加入I ii I Oligo dT Primers (2. 5 u M)> I u I dNTP Mixture (10mM)>2 u g總RNA和DEPC-H2O至IOu I0于PCR儀上65°C，5min進(jìn)行變性退火反應(yīng)，離心20s秒鐘，依次加入 4u I 5XPrimeScript Buffer、0.5u I RNase Inhibitor (40U/U I)>0.5 U IPrimeScript RTase (for 2step)和 5 u I RNase Free ddH20,42 °C 30min 后 95 °C 5min,即獲得第一鏈cDNA ；以獲得的第一鏈cDNA為模板，以集胞藻PCC6803rnpB基因?yàn)閮?nèi)參基因，以 TaKaTa 公司 PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)進(jìn)行 Real-timequantitative PCR檢測。其中集胞藻PCC6803rnpB內(nèi)參基引物序列為上游Pl :5，-GTGAGGACAGTGCCACAGAA-3，；下游P2 :5，-TGCACCCTTACCCTTTTCAG-3’ ；Deltal5 基因的 Real-time quantitative PCR 引物序列為上游P3 :5，-CGTACTCACCATGCCAACAC-3，；下游P4 :5，-AGGCGATCAGAGGCAAGTAA-3，；Delta6 基因的 Real-time quantitative PCR 引物序列為上游P5 :5，-CTGGGCATGACCTACGATTT-3，；下游P6 :5，-ATACGTACTGCGCCATCTCC-3，。Real-time quantitative PCR 具體操作步驟如下依次加入12. 5iil 2 X SYBR premix Ex Taq ( )、上下游引物各1. Oyl、cDNA 模板 2. Oii I 和 8. 5 ii I ddH20。95°C 預(yù)變性 lmin ；95°C 10s, 60 °C 30s, 72 °C 30s, 42 個(gè)循環(huán)；95°C 10s，58°C 30s，72°C 5min ;55°C ls，81 個(gè)循環(huán)，每隔 0. 5s 檢測一次。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因集胞藻陽性植株中DeItal5和Delta6蛋白水平檢測
以含表達(dá)載體pBluscrip-SD-Deltal5的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803、含表達(dá)載體pBluscrip-SD-Deltal5+Delta6的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803為材料，提取藻總蛋白，利用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)基因陽性集胞藻中Deltal5和Delta6蛋白質(zhì)水平。具體方法如下取藻細(xì)胞離心收集后用5mL 40mM的Tris-Cl (pH8. 0)懸浮，然后加入適量的直徑為0. 17mm左右的玻璃珠(購自sigma公司)至玻璃珠界面上方有0. 5mL的懸浮液。通過潤旋振蕩器以最大速率震蕩lmin，然后置于冰上lmin，如此重復(fù)5次。在4000rpm低速離心IOmin收集上清，再將所收集的上清用較高轉(zhuǎn)速6000rpm進(jìn)行離心lOmin，收集上清。即得到藻細(xì)胞總蛋白。取適量樣品，加等體積的2XBSA，沸水中煮10分鐘。離心后放_(tái)20°C存放。取少量樣品，稀釋一定倍數(shù)(5\、10\、20\)，以40禮Tris-Cl (pH8. 0)為參照空白，測蛋白質(zhì)濃度。利用10%SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，每個(gè)上樣孔50iig蛋白。電泳結(jié)束后，通過印記法轉(zhuǎn)移到PVDF(Millip0re，BillleriCa，MA)。然后按照何慶芳等人的方法進(jìn)行免疫化學(xué)分析，檢測 Deltal5 和 Delta6 蛋白質(zhì)水平(Qingfang He 等,Eur. J. Bilchem.，1999, 263，561-570)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因集胞藻中，均檢測出Deltal5和Delta6蛋白質(zhì)水平，而野生型中則沒有信號(hào)，見圖2，3，4，5。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因集胞藻陽性植株中脂肪酸成分分析在30°C，30 ii E. m_2. s—1持續(xù)光照下，取含表達(dá)載體pSDSyl5的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803、含表達(dá)載體pSDSyl5Sy6的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻，離心后收集菌體，40°C干燥，經(jīng)甲酯化后進(jìn)行氣象色譜分析；具體步驟如下( I)稱取適量樣品于厭氧培養(yǎng)管中。(2)加入氯乙酰甲醇4mL。氯乙酰甲醇=1:10 (體積比)。(3)精確加入ImL含有C19:0內(nèi)標(biāo)的正己烷溶液。內(nèi)標(biāo)濃度為lmg/mL。(4)蓋緊管蓋，80°C水浴兩小時(shí)。取出冷卻至室溫。(5)加入7%的碳酸鉀溶液5mL,振蕩均勻,靜置lOmin, I, OOOrpm離心5min分層。(6)吸取上層液相，由中國農(nóng)大農(nóng)業(yè)部飼料研究中心進(jìn)行氣相色譜分析。與對照野生型集胞藻PCC6803相比，在30 V及20°C混養(yǎng)條件下含表達(dá)載體pSDSyl5的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803、含表達(dá)載體pSDSyl5Sy6的轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803脂肪酸含量變化見表I和表2。表I
膽_酸含量
嫌株溫度(FatlyackIsCTKiteiU <%)
I Strains) (tl CI :1 (li;2 CIiiJnf. Ctl;Jn3 C1 :4
野‘1.: J( 7— 7工《,9 Ll.S^xLO 1626±U I—45x(>.2 144x4.3
'WTI 20 3.y4i .2 tl ,75±0.6 14.72*1.3 2.53±(l.3 1.54^0.2 l.53±3.(
30 2—73*11.3 2^80i<l5I 1732*2.1 9J]iL3 ft 34±7.3
pSDSvI5
' 2 3J ±I>.7 .23dU 23.05±2.3 10 * Lft m.li±5.7表權(quán)利要求
1.集胞藻高效雙同源重組載體，核苷酸序列如SEQID NO. 8或SEQ ID NO. 9所示。
2.權(quán)利要求1所述集胞藻高效雙同源重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下 (1)PCR擴(kuò)增集胞藻PCC6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段作為psbA2啟動(dòng)子基因片段、Genbank登錄號(hào)為X13547.1的集胞藻PCC 6803的psbA20RF基因片段、Genbank登錄號(hào)為U02439.1的大腸桿菌終止子T1T2基因片段、Genbank登錄號(hào)為D13780.1的集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脫氫酶基因片段和Genbank登錄號(hào)為L11421.1的集胞藻PCC6803Delta6脂肪酸脫氫酶基因片段； (2)將步驟(I)獲得的psbA2啟動(dòng)子基因片段分別與步驟(I)制得的集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脫氫酶基因片段和集胞藻PCC6803Delta6脂肪酸脫氫酶基因片段進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，分別制得基因片段Promotor+Delta 15和基因片段Promotor+Delta6 ； (3)將步驟(I)制得的大腸桿菌終止子T1T2基因片段用PstI和BamHI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的pBluescript SK連接,得到質(zhì)粒pBluescript SK T1T2 ； 然后將步驟(I)制得的psbA20RF基因片段用SacII和SacI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的質(zhì)粒 pBluescript SK T1T2 連接,得到質(zhì)粒 pBluescript SK TlT2-downstream ； 對質(zhì)粒pBluescript SK TlT2_downstream和質(zhì)粒pUC4K進(jìn)行BamHI單酶切，電泳后分別回收pBluescript SK TlT2_downstream載體片段和pUC4K中的npt片段，對載體片段去磷酸化后與npt片段連接,得到質(zhì)粒pBluescript SK TlT2-npt-downstream ； (4)將步驟(2)制得的基因片段Promotor+DeltalS，或者，基因片段Promotor+DeIta15 和基因片段 Promotor+Delta6 插入步驟(3)制得的質(zhì)粒 pBluescriptSKTlT2-npt-downstream 中，制得重組載體； (5)將步驟(4)制得的重組載體轉(zhuǎn)化至集胞藻PCC6803中，制得轉(zhuǎn)基因集胞藻； (6)將步驟(5)制得的轉(zhuǎn)基因集胞藻在20 30°C條件下通氣培養(yǎng)8 12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。
3.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增psbA2啟動(dòng)子基因片段的引物為Promotor-F:5’ -GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’ ；Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’ ； 擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。
4.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增集胞藻PCC6803的psbA20RF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位點(diǎn)，在其3’端引入SacI酶切位點(diǎn)，所用引物為psbA2-F:5’ -CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’ ；psbA2-R:5’ -AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3’ ； 擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。
5.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脫氫酶基因的引物為Syl5-F :5’ -TAAGGAATTATAACCAAATGCGTCTAGAAATTTCATCG-3’ ；Syl5-R :5’ -CGGCTGCAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAGGTTTCTTTTGATATC-3’ ； 擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。
6.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR擴(kuò)增花生硫脂酶基因Delta6的引物為Sy6-F :5’ -TAAGGAATTATAACCAAATGCTAACAGCGGAAAG-3’ ；Sy6-R :5’ -GTCCTGCAGTCAATGATGATGATGATGATGCGATGCTTTGCCCATGGCCT-3’ ； 擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存。
7.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(I)中集胞藻PCC6803的psbA2基因ATG前510bp基因片段核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，集胞藻PCC6803psbA20RF 基因 psbA2 的核苷酸序列 SEQ ID NO. 2 所示，集胞藻 PCC6803Deltal5 脂肪酸脫氫酶基因Syl5的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，集胞藻PCC6803Deltal5脂肪酸脫氫酶基因Sy6的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
8.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法,其特征在于，所述步驟(3)中質(zhì)粒pBluescriptSKT1T2的制備方法，具體如下 擴(kuò)增大腸桿菌T1T2終止子的質(zhì)粒pKK233-2，在其5’端引入PstI酶切位點(diǎn)，在其3’端引入BamHI酶切位點(diǎn)，所用引物為T1T2-F :5’ 一ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3’ ；T1T2-R:5’ 一TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3’ ； 擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性30s，72°C延伸30s, 35個(gè)循環(huán)后，72°C 10min，4°C保存；獲得的片段經(jīng)PstI和BamHI雙酶切后與經(jīng)相同酶切的pBluescript SK 連接,得到質(zhì)粒 pBluescript SK T1T2。
9.權(quán)利要求1所述集胞藻高效雙同源重組載體在制備二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具體涉及集胞藻高效雙同源重組載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。集胞藻高效雙同源重組載體，核苷酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。本發(fā)明還公開該集胞藻高效雙同源重組載體的構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述集胞藻高效雙同源重組載體在集胞藻PCC6803中過表達(dá)集胞藻PCC6803Delta 15、Delta15和Delta 6脂肪酸去飽和酶基因可明顯提高集胞藻中十八碳四烯酸的含量。
文檔編號(hào)C12R1/89GK103014053SQ20121052904
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者何慶芳, 陳高, 畢玉平, 張燕, 李偉智, 楊連群, 范仲學(xué), 邊斐, 馬德源, 彭振英 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心