專利名稱：抗紋枯病轉(zhuǎn)基因水稻的培育及專用載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗紋枯病轉(zhuǎn)基因水稻的培育及專用載體。
背景技術(shù)：
水稻紋枯病(sheathblight)是由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)引起的土傳真菌病害。上世紀(jì)60年代以來，伴隨著矮桿品種的推廣、密植和化肥的大量施用，紋枯病在世界范圍內(nèi)成為水稻三大病害之一，一般造成15% — 20%的減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)60%- 70%。該病屬于葉鞘病害，始于植株基部。在水稻群體條件下，一般于分蘗后期至拔節(jié)初期和抽穗期前后20天左右形成2個(gè)發(fā)病高峰，特別是后一個(gè)發(fā)病高峰，菌絲體不僅快速向植株冠層擴(kuò)展(縱向擴(kuò)展)，而且迅速橫向蔓延，使周圍健康植株生病，危害十分嚴(yán)重。病原菌(R. solani kuhn)不僅危害葉鞘，而且可致葉片發(fā)病或失水枯死，影響群體光合作用，嚴(yán)重時(shí)會(huì)致莖桿腐爛而成片倒伏、穎殼發(fā)病、穗子枯死甚至不能完全抽出，對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)影響巨大。由于水稻推廣品種的抗性水平普遍不理想，迄今為止，生產(chǎn)上對(duì)該病的控制主要依賴化學(xué)防治。但在當(dāng)前高肥、大群體和農(nóng)村輕壯年勞動(dòng)力大量轉(zhuǎn)移的情況下，常常由于用藥不及時(shí)或方法不正確，導(dǎo)致防治效果普遍不佳，紋枯病作為主要病害的地位越來越突出，乃至我國南方稻區(qū)的很多地方，該病已上升為水稻第一大病害。培育抗紋枯病水稻新品種是從根本上解決紋枯病危害的唯一出路，也已成為我國水稻生產(chǎn)上的當(dāng)務(wù)之急。隨著分子生物學(xué)、植物病理學(xué)和基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，運(yùn)用基因工程手段提高植物的抗病性，為抗病育種開辟了一條全新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一個(gè)目的是提供GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體的應(yīng)用。本發(fā)明提供的GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N ‘末端第29-171位氨基酸殘基。上述序列表中的序列2由171個(gè)氨基酸構(gòu)成，自氨基末端第1-28位為信號(hào)肽，自氨基末端第29-171位為GAFP2蛋白。上述應(yīng)用中，所述GAFP2蛋白的編碼基因的核昔酸序列為序列表中的序列I或序列表中序列I自5’末端第85-516位核苷酸。上述序列表中的序列I由516個(gè)核苷酸構(gòu)成，自5 ‘末端第1-84位為編碼信號(hào)肽的基因，自5 ‘末端第85-516位為編碼GAFP2蛋白的基因。 上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物抗病性為提高植物紋枯病抗性；
所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為水稻。水稻的品種名具體為水稻“徐稻3號(hào)”。上述應(yīng)用中，所述提高植物紋枯病抗性為提高水稻紋枯病抗性；所述水稻紋枯病具體由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)引起。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，為將GAFP2蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫睫D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的紋枯病抗性高于所述目的植物；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N ‘末端第29-171位氨基酸殘基。上述方法中，所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中序列I自5’末端第85-516位核苷酸。
上述方法中，所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為水稻；水稻的品種名具體為水稻“徐稻3號(hào)”。所述紋枯病為水稻紋枯病，所述水稻紋枯病由立枯絲核菌(Rhizoctonia solaniKiihn)引起；所述GAFP2蛋白的編碼基因通過下述第三個(gè)目的中的重組載體導(dǎo)入所述目的植物中。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種重組載體。本發(fā)明提供的重組載體，為將GAFP2蛋白的編碼基因和驅(qū)動(dòng)所述編碼基因的啟動(dòng)子插入表達(dá)載體得到；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N ‘末端第29-171位氨基酸殘基。上述啟動(dòng)子可為組成型、維管組織特異表達(dá)或真菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，所述組成型啟動(dòng)子優(yōu)選為35S啟動(dòng)子。上述重組載體為將GAFP2蛋白的編碼基因和驅(qū)動(dòng)所述編碼基因的啟動(dòng)子35S插入表達(dá)載體pCambia2300中得到的載體；所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中序列I自5’末端第85-516位核苷酸。上述重組載體具體按照如下方法制備I)將所述GAFP2蛋白的編碼基因替換pBI221載體中的⑶S片段，得到的中間載體pBI 35S-GAFP2 ；將所述GAFP2蛋白的編碼基因替換PBI221載體中的⑶S片段進(jìn)一步具體為將上述序列表中序列I所示的核苷酸取代PBI221載體的XbaI和SacI酶切識(shí)別位點(diǎn)間的小片段(⑶S片段)得到的重組載體。2)用 HindIII 和 SacI 酶切中間載體 pBI35S_GAFP2 得到 1300bp35S_GAFP2 片段，將所述35S-GAFP2片段插入pCambia2300載體HindIII和SacI酶切位點(diǎn)間得到重組載體。含有上述表達(dá)載體的重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明將含有信號(hào)肽的GAFP2基因?qū)胨局蝎@得轉(zhuǎn)基因水稻，可以高效地抵抗紋枯病菌的侵染，與非轉(zhuǎn)基因水稻相比，轉(zhuǎn)GAFP2水稻具有穩(wěn)定的、明顯增強(qiáng)的抗紋枯病能力，其病指數(shù)顯著降低，說明轉(zhuǎn)GAFP2水稻表達(dá)的GAFP2蛋白能夠在信號(hào)肽的引導(dǎo)下將成熟肽GAFP2準(zhǔn)確定位于胞外，從而有效增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)真菌病源物侵染的抗性。


圖I為轉(zhuǎn)GAFP2水稻株系的分子鑒定結(jié)果圖2為水稻紋枯病菌的培養(yǎng)及水稻接種圖片
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè) 途徑得到。實(shí)施例I、含有GAFP2的高效表達(dá)載體pCambia2300-35S_GAFP2的構(gòu)建人工合成GAFP2基因，GAFP2的核苷酸序列為序列表中的序列1，該基因編碼的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述序列表中的序列I由516個(gè)核苷酸構(gòu)成，自5 ‘末端第1-84位為編碼信號(hào)肽的基因，自5 ‘末端第85-516位為編碼GAFP2蛋白的基因。上述序列表中的序列2由171個(gè)氨基酸構(gòu)成，自氨基末端第1-28位為信號(hào)肽，自氨基末端第29-171位為GAFP2蛋白。將GAFP2基因(序列表中的序列I)連接到pUCm_T (購自上海生工生物工程有限公司)上，構(gòu)建載體PUCm-GAFP2。用XbaI和SacI酶切pUCm_GAFP2，得到516bp酶切后的GAFP2片段，經(jīng)該片段與用同樣的酶切去I. 9Kb GUS片段的pBI221載體(購自Clontech Laboratories, Inc.)骨架連接，得到中間載體pBI 35S-GAFP2。用HindIII 和 SacI 酶切中間載體 pBI35S_GAFP2 得到 1300bp35S_GAFP2 片段，該片段與經(jīng)過同樣酶切后的8740bp的pCambia2300 (購自Cambia Laboratories公司)載體骨架連接，得到表達(dá)載體pCambia2300-35S-GAFP2 (經(jīng)過酶切驗(yàn)證為陽性)；該表達(dá)載體的細(xì)菌和植物抗性基因?yàn)榭敲顾乜剐曰騅an r+和NPTII篩選標(biāo)記基因，該表達(dá)載體pCambia2300-35S-GAFP2 為將 35S_GAFP2(35S+ 序列表 I)插入載體 pCambia2300 的 HindIII和SacI酶切位點(diǎn)間得到的載體。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)GAFP2水稻的獲得及功能研究
一、轉(zhuǎn)GAFP2水稻的獲得I、轉(zhuǎn)GAFP2水稻的獲得I)將實(shí)施例I中獲得的表達(dá)載體pCambia2300-35S_GAFP2轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404 (購自 Invitrogen 公司)中，得到根癌農(nóng)桿菌 LBA4404/pCambia2300-35S_GAFP2。2)分別挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCambia2300-35S-GAFP2單菌落，接種于20ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和30mg/L鏈霉素的YEP培養(yǎng)基中，28° C、280rpm過夜培養(yǎng)至0D600為O. 7 O. 8。然后5000rpm離心，棄上清液，沉淀用NB-液體培養(yǎng)基重新懸浮。最后將水稻“徐稻3號(hào)”(徐軍，段祥茂，劉強(qiáng)，楊波，徐宗進(jìn)，周煒，陳留根和仲維功.2008.徐稻3號(hào)水稻超高產(chǎn)栽培試驗(yàn)研究.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué).3:29-31.公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；以下簡稱為野生型水稻)幼胚的愈傷組織在懸浮液中浸泡30分鐘。3)將經(jīng)過上述2)處理得到的愈傷組織用無菌吸水紙吸干，放置于NB培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)4 6天后，用無菌水將外植體洗凈，在半固體NB培養(yǎng)基(添加250ug/ml的羧芐青霉素或頭孢噻肟)上培養(yǎng)愈傷組織進(jìn)行一篩，在冷熒光燈下28°C培養(yǎng)16天，抗性愈傷選擇出來進(jìn)行二篩。將快速生長的轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇出來，轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基中，在12小時(shí)光照，12小時(shí)黑暗的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)大約兩周左右直至分化出小芽。4)把小苗轉(zhuǎn)移到含30ml 1/2MS培養(yǎng)基的盒子中，在冷熒光燈下28°C培養(yǎng)小苗10-14天。最后把幼苗轉(zhuǎn)移到盆里，在溫室中培養(yǎng)，得到Ttl代轉(zhuǎn)GAFP2水稻。NB培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL水中含有下述物質(zhì)N6 (Chu (N6) Basal SaltMixture, Sigma-Aldrich, C1416)大量(20 X) 50ml, B5 (B5 基本培養(yǎng)基，上海恒斐生物試劑有限公司，BS1304)有機(jī)(IOOX)IOml, B5 微量(IOOX)IOml,鐵鹽(100X) 10ml，2，4-D (O. 2mg/ml) 10ml,脯氨酸 500mg,水解酪蛋白 300mg,鹿糖 30g,瓊脂 8g, pH 5. 8。生根培養(yǎng)基的配方為MS(Murashige&Skoog 基本培養(yǎng)基，Sigma-Aldrich, M5519)粉劑2. 17g，B5(B5基本培養(yǎng)基，上海恒斐生物試劑有限公司，BS1304)有機(jī)(IOOX)IOml,NAA(1_ 蔡乙酸,Sigma-Aldrich, N0640,0. 2mg/ml), 2. 5ml MET(蛋氛酸，Sigma-Aldrich,459240,0. 2mg/ml) 5ml，蔗糖 20g,瓊脂 8g，pH5. 8。 采用同樣的方法，將空載體pCambia2300轉(zhuǎn)入水稻“徐稻3號(hào)〃中獲得Ttl代轉(zhuǎn)空載體水稻。將Ttl代轉(zhuǎn)GAFP2水稻和Ttl代轉(zhuǎn)空載體水稻播種，收種，分別得到T1代轉(zhuǎn)GAFP2水稻和T1代轉(zhuǎn)空載體水稻。2、轉(zhuǎn)GAFP2A稻的分子鑒定I)、提取總 DNA提取T1代轉(zhuǎn)GAFP2水稻單株的新鮮幼嫩葉片的基因組DNA，采用常規(guī)CTAB法提取。2)、PCR 檢測以步驟I)獲得的各單株葉片的基因組DNA為模板，以GAFP2-F引物5’ -AGC CATGGC AGC ATC CGC AAG-3，和 GAFP2-R 引物:5，-GCG TCG ACC TAT TCT CTT AGA CCG T-3，作為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)的總體積為20μ 1，程序?yàn)橄?4° C3min;然后94° C 40s，55 ° C30s, 72。C40s, 30 個(gè)循環(huán)后；72。C 延伸 lOmin。以實(shí)施例I中獲得的質(zhì)粒pCambia2300-35S_GAFP2為陽性對(duì)照(CK2)，以野生型水稻的基因組DNA為陰性對(duì)照(CK1)。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，結(jié)果如圖I所示，1-16為Tl代轉(zhuǎn)GAFP2水稻；CK1為陰性對(duì)照；CK2為陽性對(duì)照，可以看出，得到516bp目的片段為陽性Tl代轉(zhuǎn)GAFP2水稻，圖中泳道為1-5、8-10、12-16的Tl代轉(zhuǎn)GAFP2水稻為陽性Tl代轉(zhuǎn)GAFP2水稻，而陰性對(duì)照野生型水稻沒有目的片段。采用同樣的方法檢測T1代轉(zhuǎn)空載體水稻也沒有目的片段。二、轉(zhuǎn)GAFP2水稻的紋枯病抗性檢測(田間接病實(shí)驗(yàn))I、菌種及其培養(yǎng)方法水稻紋枯病的病原菌為立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)菌株RH-9 (記載在如下文獻(xiàn)中左士敏，張亞芳，殷躍軍，陳宗祥和潘學(xué)彪.2006.田間水稻紋枯病抗性鑒定體系的建立和完善，揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào) 農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版.27(4) :57-61 ;公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；也可以從江蘇省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所獲得。菌種培養(yǎng)方法扁平的木質(zhì)短棒(10X2X2) mm，置于培養(yǎng)皿中(只鋪I層)Jppda培養(yǎng)基(不漫過接種物)，滅菌后，接入菌絲塊，室溫下暗培養(yǎng)3-4天后，待菌絲遍布培養(yǎng)基表面時(shí)，可用于接種水稻。2、鑒定材料田間種植采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每小區(qū)種植水稻3行，每行12株。株行距為22.5cmX12.0cm。中等施肥水平，保持淺水灌溉不脫水。鑒定材料在田中隨機(jī)分布，按水稻正常的播種時(shí)間和田間管理方式進(jìn)行種植，保持田間的適當(dāng)濕度，以利于紋枯病的發(fā)生。上述水稻為編號(hào)為SG2陽性Tl代轉(zhuǎn)GAFP2水稻、水稻“徐稻3號(hào)”和T1代轉(zhuǎn)空載體水稻。3、田間接種方法待上述步驟2種植的編號(hào)為SG2陽性Tl代轉(zhuǎn)GAFP2水稻、水稻“徐稻3號(hào)”和T1代轉(zhuǎn)空載體水稻生長到大田拔節(jié)初期(正常半旱秧育秧的秧苗，約在移栽后35天左右)以鑷子將短火柴棒嵌入自上向下第3葉鞘內(nèi)側(cè)，使葉鞘包莖狀態(tài)不變，并在相應(yīng)的葉片上做好 標(biāo)記。每株接種3個(gè)莖桿，詳見圖2。以非轉(zhuǎn)基因野生型水稻“徐稻3號(hào)”作為對(duì)照(CK)，T1代轉(zhuǎn)空載體水稻也作為對(duì)照。4、發(fā)病檢測感病對(duì)照充分發(fā)病，且病情基本穩(wěn)定時(shí)(大約在抽穗后30天左右)，進(jìn)行病情調(diào)查。調(diào)查小區(qū)中間行中間8株(即兩邊各去除2株)，采用揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院潘學(xué)彪研究組制定的基于葉鞘位的0-9級(jí)病級(jí)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)其中O級(jí)為植株無病；9級(jí)為植株因病非正常死亡；O 3級(jí)為抗?。? 6級(jí)為中等抗病至中等感??；7 9級(jí)為感病，作為評(píng)級(jí)指標(biāo)(詳見左士敏，張亞芳，殷躍軍，陳宗祥和潘學(xué)彪.2006.田間水稻紋枯病抗性鑒定體系的建立和完善，揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)·農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版.27(4) :57-61 ;王子斌，左示敏，李剛，陳夕軍，陳宗祥，張亞芳和潘學(xué)彪.2009.水稻紋枯病幾種田間病級(jí)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)的比較研究.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)·農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版.3(4) :9-14)。每個(gè)小區(qū)取三個(gè)單株鑒定，最高病級(jí)為一株植物各個(gè)分蘗莖桿中發(fā)病最重莖桿的病級(jí)為指標(biāo)，平均病級(jí)是以主莖和大分蘗病級(jí)的平均數(shù)為指標(biāo)，以此兩種指標(biāo)(病級(jí)指數(shù))的鑒定分析結(jié)果見如下表I和表2所示。T1代轉(zhuǎn)空載體水稻對(duì)照抗病結(jié)果與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?br> 無差異。表I為以最高病級(jí)為指標(biāo)，進(jìn)行的抗病結(jié)果鑒定情況田間小田間小田間小待瀾!品種株系號(hào)區(qū)重復(fù)區(qū)重復(fù)區(qū)$復(fù)重復(fù)平均載體平均
權(quán)利要求
1.GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N‘末端第29-171位氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于 所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中序列I自5’末端第85-516位核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于 所述調(diào)控植物抗病性為提高植物紋枯病抗性； 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為水稻。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于 所述提高植物紋枯病抗性為提高水稻紋枯病抗性； 所述水稻紋枯病具體由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)引起。
5.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將GAFP2蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫睫D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的紋枯病抗性高于所述目的植物；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N ‘末端第29-171位氨基酸殘基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中序列I自5’末端第85-516位核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為水稻； 所述紋枯病為水稻紋枯病，所述水稻紋枯病由立枯絲核菌(Rhizoctonia solaniKiihn)引起； 所述GAFP2蛋白的編碼基因通過下述權(quán)利要求8或9所述的重組載體導(dǎo)入所述目的植物中。
8.—種重組載體，為將GAFP2蛋白的編碼基因和驅(qū)動(dòng)所述編碼基因的啟動(dòng)子插入表達(dá)載體得到；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N ‘末端第29-171位氨基酸殘基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將GAFP2蛋白的編碼基因和驅(qū)動(dòng)所述編碼基因的啟動(dòng)子35S插入表達(dá)載體pCambia2300中得到的載體； 所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中序列I自5’末端第85-516位核苷酸。
10.含有權(quán)利要求8或9所述表達(dá)載體的重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種GAFP2蛋白在培育抗紋枯病轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用及專用載體。本發(fā)明提供了GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N‘末端第29-171位氨基酸殘基。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明將GAFP2導(dǎo)入水稻中獲得轉(zhuǎn)基因水稻，可以有效增強(qiáng)對(duì)水稻紋枯病的抗性。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102965392SQ20121053056
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者儲(chǔ)成才, 王義琴, 劉豐澤, 陳帥 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所