專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法。
背景技術(shù)：
β -甘露聚糖酶是一類能夠水解含有β -1, 4-D-甘露糖苷鍵的內(nèi)切酶，屬于半纖維素酶類。它具有一般非淀粉多糖酶的作用——消除β_甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，促進(jìn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化率和能量利用率；近來很多研究發(fā)現(xiàn)，β -甘露聚糖酶還是一種多功能的促生長劑，它可以促進(jìn)類胰島素生長因子IGF-1的分泌，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，提高瘦肉率；其產(chǎn)物甘露寡糖能改善腸道微生物環(huán)境，提高動物免疫功能。甘露聚糖酶廣泛存在于自 然界中，在一些低等動物、植物和微生物都發(fā)現(xiàn)β_甘露聚糖酶活性的存在。而微生物則是β_甘露聚糖酶的主要來源，微生物來源的β -甘露聚糖酶具有很多優(yōu)點，如酶活性高、提取方便，具有pH、溫度作用范圍廣以及底物專一性較高等特點，因此已經(jīng)在工業(yè)化生產(chǎn)和理論研究中得到廣泛的應(yīng)用。甘露聚糖酶是一種誘導(dǎo)酶，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘露聚糖酶多以甘露聚糖作為碳源誘導(dǎo)酶的表達(dá)，是一種廣泛使用的生產(chǎn)β_甘露聚糖酶的方法。宇佐美曲霉(CGMCC NO. 4290)已在中國專利申請CN2010105440832中公開，其中復(fù)合菌株在300mL三角瓶中裝入20g固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)基包括麥麩17g，豆柏3g，硫酸銨O. 5g，磷酸二氫鈉O. 2g，水25mL，121°C滅菌30min。多層曲盤發(fā)酵配制50kg干料發(fā)酵培養(yǎng)基(麥麩38Kg，豆柏6Kg，稻草粉6Kg，硫酸銨lKg，磷酸二氫鈉O. 5Kg，硫酸鎂O.1Kg),加自來水70Kg。但是隨著生產(chǎn)原料(豆柏等)價格的不斷上漲，酶制劑行業(yè)的成本壓力越來越大，因此一種能夠降低生產(chǎn)成本且能提高酶活性的固體發(fā)酵培養(yǎng)基能使企業(yè)在酶制劑行業(yè)競爭中處于不敗之地。由于魔芋粉中富含甘露聚糖，所以在固體發(fā)酵中常以魔芋粉作為生產(chǎn)β_甘露聚糖酶的碳源。本發(fā)明利用宇佐美曲霉進(jìn)行固體發(fā)酵優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基，找到了一種既可以代替部分豆柏作為氮源又可以作為碳源誘導(dǎo)物誘導(dǎo)酶表達(dá)的發(fā)酵原料，從而獲得了一種既能高效表達(dá)β_甘露聚糖酶又能降低生產(chǎn)成本低的培養(yǎng)基，同時生產(chǎn)β_甘露聚糖酶的過程不產(chǎn)生廢水廢渣、無環(huán)境污染，適用于無污染、低成本的現(xiàn)代酶制劑生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)β -甘露聚糖酶的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，包括使菌種宇佐美曲霉通過發(fā)酵高效表達(dá)甘露聚糖酶的步驟，其中，宇佐美曲霉By247，于2010年11月01日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為=CGMCC NO. 4290，(I)三角瓶固體發(fā)酵生產(chǎn)甘露聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件發(fā)酵培養(yǎng)基包括基料，每IOOg基料包括麩皮6(T80g，豆柏7 20g，棕櫚柏13 20g，基于上述IOOg基料添加魔芋粉O. 7 2. 7g，(NH4) 2S041 3g，KH2PO4I 3g，水113^173mL ；pH 3. (Γ8. 0，滅菌，冷卻后接種f 4mL宇佐美曲霉By247種子液，混合均勻，于培養(yǎng)箱31 33 °C培養(yǎng)72 96h ；(2)曲盤固體發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件發(fā)酵培養(yǎng)基包括基料，每IOOg基料包括麩皮80g，豆柏7g，棕櫚柏13g，基于上述IOOg基料添加魔芋粉50g, (NH4)2SO4 150g，KH2PO4 75g，水11. 5L，自然pH，混合均勻，分裝、滅菌，冷卻后接種7 15% (V/W)的宇佐美曲霉By247種子液，混合均勻，倒入曲盤，置于曲房中31 34°C培養(yǎng)72 96h。根據(jù)本申請的
具體實施例方式(I)三角瓶固體發(fā)酵小試生產(chǎn)甘露聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件300mL三角瓶裝15g基料(麩皮擴(kuò)12g，豆柏Hg，棕櫚柏 2 3g)，魔芋粉 O.1 O. 4g, (NH4) 2S04 O. 15 O. 45g, KH2PO4 O. 15 O. 45g,水 17 26mL，pH
3.(Γ8. O,滅菌，冷卻后接種I 4mL種子液，混合均勻，于培養(yǎng)箱31 33°C培養(yǎng)72 96h ；(2)曲盤固體發(fā)酵中試生產(chǎn)β-甘露聚糖酶曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件麩皮6Kg，豆柏O. 5Kg，棕櫚柏lKg，魔芋粉50g，(NH4)2S04 150g，KH2P0475g，水11. 5L，自然pH，混合均勻，分裝、滅菌，冷卻后接種7 15% (V/W)的種子液，混合均勻，倒入曲盤，置于曲房中3f34°C培養(yǎng)72、6h。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，所述發(fā)酵生產(chǎn)β_甘露聚糖酶的方法包括以下步驟①三角瓶固體發(fā)酵小試生產(chǎn)β -甘露聚糖酶斜面種子培養(yǎng)基制備及菌種活化稱粉碎后的大麥芽70g，加300ml的水，在60°C的水浴鍋內(nèi)糖化3 4h，用4層紗布過濾，濾液煮沸后再用脫脂棉過濾即得到澄清的麥芽汁，調(diào)整其糖度為5 10，最后加5. 5g瓊脂粉，煮沸，吸IOmL于各試管內(nèi)，封好試管于121°C滅菌30min，放置斜面。冷卻后于超凈工作臺接種宇佐美曲霉By247菌株，置培養(yǎng)箱32°C培養(yǎng)96h。孢子懸浮液制備吸取IOmL無菌蒸餾水于已長好的宇佐美曲霉麥芽汁斜面培養(yǎng)基中，用滅菌接種環(huán)將孢子輕輕刮下，置于盛有玻璃珠的小三角瓶中，于往復(fù)式搖床上振蕩5h (200r/min)，使孢子充分分散活化，再經(jīng)過無菌脫脂棉過濾即為孢子懸浮液，將孢子濃度稀釋約至1(Τ107個/mL。10%麩皮提取液的制備稱取50g麩皮，加入700mL水，在沸水中煮沸20min，8層紗布過濾，定容至500mL，即為10%麩皮提取液，于4°C冰箱儲存。種子液制備500mL三角瓶中加入50mL 10%麩皮提取液,60mL自來水,O. 5g葡萄糖，4g豆柏粉(過80目)，混合均勻于121°C滅菌30min。冷卻后于超凈工作臺接種2mL孢子懸浮液，于搖床培養(yǎng)箱32°C、400r/min培養(yǎng)48h,即得種子液。使用前于超凈工作臺向種子液中加入滅菌轉(zhuǎn)子，封好瓶口，于攪拌器上把菌體充分分開。發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件 300mL三角瓶裝15g基料(其中麩皮擴(kuò)12g，豆柏f 3g，棕櫚柏 2 3g)，魔芋粉 O.1 O. 4g，(NH4) 2S04 O. 15 O. 45g，KH2PO4 O. 15 O. 45g，自來水17 26mL，pH 3. 0 8· O。121°C滅菌30min,冷卻后接種I 4mL種子液，混合均勻，于培養(yǎng)箱31 33°C培養(yǎng)72 96h，接種后20 24h和40 44h各扣瓶I次。②曲盤固體發(fā)酵中試生產(chǎn)β -甘露聚糖酶菌種與①中的菌種相同，即宇佐美曲霉By247。種子液制備與①中種子液制備方法相同。曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件麩皮6Kg，豆柏O. 5Kg，棕櫚柏lKg，魔芋粉50g，(NH4)2S04 150g, KH2PO4 75g，自來水11. 5L，自然pH?；旌暇鶆颍盅b到8層紗布袋中，121°C滅菌30min。冷卻后接種7 15% (V/W)的種子液，混合均勻，倒入曲盤(IOOcmX 50cmX 5cm)中，厚度2 5cm，蓋上4層紗布，置于曲房中31 34°C培養(yǎng)72 96h，期間分別于20 24h和40 44h各翻曲I次并補(bǔ)加無菌水，使發(fā)酵曲握在手里既不松散又不出水為宜。③體外酶解飼料對照組稱取10. OOg飼料(不添加任何酶)或飼料原料，按固液比為1:10加入pH5. O的O. lmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，置于水浴搖床進(jìn)行反應(yīng)。酶解溫度40°C，酶解時間5h，酶解開始后，每隔I小時振蕩I次，每次lOmin，速度120r/min。酶解結(jié)束后加入5mL 10%三氯乙酸溶液，搖勻，靜置5min,取出酶解液適量4000r/min離心IOmin,收集上清夜,測定
還原糖含量。加酶組稱取10. OOg飼料(不添加任何酶)或飼料原料,加入β -甘露聚糖酶提取液，添加量為50U/g飼料(飼料原料)；按固液比為1:10加入pH 5. O的O. lmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，置于水浴搖床進(jìn)行反應(yīng)。酶解溫度40°C，酶解時間5h，酶解開始后，每隔I小時振蕩I次，每次lOmin，速度12 0r/min。酶解結(jié)束后加入5mL10%三氯乙酸溶液，搖勻，靜置5min,取出酶解液適量4000r/min離心IOmin,收集上清夜,測定還原糖含量。本發(fā)明的特點是1.利用廉價的麩皮、棕櫚柏等農(nóng)副產(chǎn)品作為固體發(fā)酵的主要原料，降低生產(chǎn)成本，充分利用自然界可再生資源，響應(yīng)國家的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略；2.利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行三角瓶發(fā)酵和曲盤發(fā)酵產(chǎn)β_甘露聚糖酶活性比原發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)β -甘露聚糖酶活性分別提高了 2. 04和1. 73倍；3.本發(fā)明生產(chǎn)的甘露聚糖酶體外酶解飼料和原料中的甘露聚糖及其衍生物的能力比其它市售β_甘露聚糖酶的能力要強(qiáng)。4.將本發(fā)明生產(chǎn)的甘露聚糖酶應(yīng)用于動物試驗表明動物的生產(chǎn)性能得到了顯著的提高，即本發(fā)明生產(chǎn)的β_甘露聚糖酶能夠很好地分解棕櫚柏中的抗?fàn)I養(yǎng)因子β-甘露聚糖及其衍生物；5.本發(fā)明生產(chǎn)的β -甘露聚糖酶的耐溫性能比其它市售β -甘露聚糖酶的耐溫性能要好。綜上所述，棕櫚柏和魔芋粉具有高含量的甘露聚糖，且價格比豆柏便宜得多，用兩者代替部分豆柏既可以降低生產(chǎn)成本，又可以顯著提高甘露聚糖酶的酶活性。目前常規(guī)飼料原料的價格普遍上漲，促使非常規(guī)飼料的應(yīng)用，如在常規(guī)飼料中添加棕櫚柏代替部分玉米或豆柏飼喂家禽，本發(fā)明生產(chǎn)的甘露聚糖酶以棕櫚柏作為發(fā)酵原料之一，動物試驗結(jié)果表明其能夠很好地分解非常規(guī)飼料中的棕櫚柏的抗?fàn)I養(yǎng)因子，能夠顯著地提高動物的生產(chǎn)性能。本發(fā)明生產(chǎn)的甘露聚糖酶的耐溫性能、分解飼料和原料能力以及動物試驗的效果都比其它市售β_甘露聚糖酶要好。


圖1 β -甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度圖2 β -甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性圖3ρΗ對β -甘露聚糖酶活力的影響圖4ρΗ對β -甘露聚糖酶穩(wěn)定性的影響(在各pH緩沖溶液中40°C保溫2h)圖5β-甘露聚糖酶70°C耐溫性能的比較(①為本發(fā)明的甘露聚糖酶，② ⑤組為其它市售β -甘露聚糖酶)
具體實施例方式為了本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，下面通過實驗步驟說明本發(fā)明，并結(jié)合具體實施例對本發(fā)明更進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于所列的幾個實施例。1.試劑與溶液1.1乙酸一乙酸鈉緩沖溶液稱取無水醋酸鈉16. 06g,用800mL蒸餾水溶解，然后用醋酸溶液調(diào)整pH至
4.8 5. 0，最后定容至1000mL。1. 2DNS 試劑取酒石酸鉀鈉182g，溶于500mL蒸餾水中加熱，于熱溶液中依次加入3，5—二硝基水楊酸6. 3g,氫氧化鈉21g,苯酹5g,亞硫酸鈉5g,攪拌至溶解,冷卻后用蒸懼水定容至IOOOmL,貯于棕色試劑瓶中，溫室下放置15天以后使用，使用有效期一個半月。1.3 0.5%槐豆膠溶液用pH 4. 8 5. O的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制。1. 41%甘露糖標(biāo)準(zhǔn)液精確稱取經(jīng)105°C烘至恒重的甘露糖1. 0000g,于容量瓶中用蒸餾水定容至IOOmL制成1%甘露糖標(biāo)準(zhǔn)液。2.分析方法2.1甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取1%甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1. 0，2. 0，3. 0，4. 0，5. 0，6. OmL于50mL容量瓶中，用蒸餾水制成每HiL分別含甘露糖200，400，600，800，1000,1200 Ug的標(biāo)準(zhǔn)液。各取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液0. 5mL于25mL比色管中，加2mL pH 4. 8^5. O的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，加2. 5mLDNS試劑煮沸5min。冷卻后加水5mL，搖勻，520nm處測定光密度，以0. 5mL水代替標(biāo)準(zhǔn)液作空白。以所得的光密度值為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)甘露糖液濃度的二分之一的值(即0. 100，0. 200,0. 300,0. 400,0. 500,0. 600，此為每管中甘露糖的mg數(shù))為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 2待測酶液的制備精確稱取一定量的樣品約1. OOOg于50mL比色管中，加入19mL蒸餾水于漩渦混合器中震蕩至溶解，放于室溫浸泡45min，浸提過程中每15min震蕩一次。浸提后取上清液作為待測酶液，待測酶液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)待用。2. 3 β -甘露聚糖酶活性測定于25mL比色管A、B中加入底物溶液2mL，55°C預(yù)熱5min后在A管中加入0. 5mL適當(dāng)稀釋的酶液，55°C水浴中精確反應(yīng)lOmin，在A、B管中各加入2. 5mL DNS試劑，B管中補(bǔ)加O. 5mL酶液,立即煮沸5min,用冰水迅速冷卻后加入蒸懼水5mL,振蕩搖勻，于520nm出測定光密度(B管為空白對照)，并從甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖含量并折算成酶單位。[酶活定義在55°C、pH4. 8^5. O條件下，Imin分解槐豆膠中的β -甘露聚糖產(chǎn)生具有還原能力相當(dāng)于I μ mo I甘露糖所需的酶量,規(guī)定為I個酶活單位(實為國際單位IU),以μ mol/min表不]。2. 4還原糖測定吸取適量的上清液，置于25mL比色管中，補(bǔ)水至2. 5mL，空白組加入2. 5mL蒸餾水，各加入DNS溶液2. 5mL，沸水顯色5min，用冰水迅速冷卻，加入5mL蒸餾水，振蕩搖勻，于520nm處測定光密度，參照甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求出還原糖含量。實施例1三角瓶固體發(fā)酵β -甘露聚糖酶I基料(麩皮80g，豆柏 7g，棕櫚柏 13g)，魔芋粉 O. 7g，(NH4) 2S04 2g，KH2PO4Ig,水153mL。三角瓶固體發(fā)酵培養(yǎng)基300mL三角瓶15g基料(其中麩皮12g，豆柏lg，棕櫚柏2g)，魔芋粉 O. lg, (NH4)2SO4 O. 3g, KH2PO4 O. 15g，自來水 23mL，pH 5. O0發(fā)酵條件121°C滅菌30min，冷卻后接種2mL孢子懸浮液，混合均勻，于32°C培養(yǎng)96h，接種后22h和40h各扣瓶I次。重復(fù)5批次三角瓶發(fā)酵試驗結(jié)果表明，成熟發(fā)酵曲料經(jīng)45飛(TC鼓風(fēng)烘箱烘干粉碎，β -甘露聚糖酶平均酶活性達(dá)到26072U/g干曲。實施例2三角瓶固體發(fā)酵`β -甘露聚糖酶2三角瓶固體發(fā)酵培養(yǎng)基300mL三角瓶15g基料(其中麩皮llg，豆柏1. 5g，棕櫚柏 2. 5g)，魔芋粉 O. 3g，(NH4) 2S04 O. 45g，KH2PO4 O. 3g，自來水 26mL，ρΗ7· 0。發(fā)酵條件121°C滅菌30min，冷卻后接種4mL孢子懸浮液，混合均勻，于33°C培養(yǎng)84h,接種后20h和40h各扣瓶I次。重復(fù)5批次三角瓶發(fā)酵試驗結(jié)果表明，成熟發(fā)酵曲料經(jīng)45飛(TC鼓風(fēng)烘箱烘干粉碎，β -甘露聚糖酶平均酶活性達(dá)到24867U/g干曲。實施例3曲盤固體發(fā)酵β -甘露聚糖酶I曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮6Kg，豆柏O. 5Kg，棕櫚柏lKg，魔芋粉50g，(NH4)2SO4 150g，KH2PO4 75g，自來水 11. 5L，自然 pH。發(fā)酵條件混合均勻，分裝到8層紗布中，121°C滅菌30min。冷卻后接種10%種子液，混合均勻,倒入曲盤(IOOcmX 50cmX 5cm)中，厚度4cm,置于32°C曲房中培養(yǎng)96h,期間分別于22h和42h各翻曲I次并補(bǔ)加無菌水，使基料握在手里而不松散為宜。重復(fù)5批次曲盤發(fā)酵試驗結(jié)果表明，成熟發(fā)酵曲料經(jīng)45飛(TC熱風(fēng)烘干粉碎，β -甘露聚糖酶平均酶活性達(dá)到22041U/g干曲。實施例4曲盤固體發(fā)酵β -甘露聚糖酶2曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮6Kg，豆柏O. 5Kg，棕櫚柏lKg，魔芋粉50g，(NH4)2SO4 150g，KH2PO4 75g，自來水 11. 5L，自然 pH。發(fā)酵條件混合均勻，分裝到8層紗布中，121 °C滅菌30min。冷卻后接種13%種子液，混合均勻,倒入曲盤(IOOcmX 50cmX 5cm)中，厚度5cm,置于33°C曲房中培養(yǎng)88h,期間分別于24h和42h各翻曲I次并補(bǔ)加無菌水，使基料握在手里而不松散為宜。重復(fù)5批次曲盤發(fā)酵試驗結(jié)果表明，成熟發(fā)酵曲料經(jīng)45飛(TC熱風(fēng)烘干粉碎，β -甘露聚糖酶平均酶活性達(dá)到21108U/g干曲。本發(fā)明利用誘變后的宇佐美曲霉By247菌株優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基，三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后生產(chǎn)的活性達(dá)到26072U/g干曲；曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后生產(chǎn)的β_甘露聚糖酶活性達(dá)到22041U/g干曲。分別比宇佐美曲霉By247菌株原固體發(fā)酵的酶活性(12763U/g干曲)提高了 2. 04倍和1. 73倍。三角瓶發(fā)酵是曲盤發(fā)酵的基礎(chǔ)，以三角瓶發(fā)酵優(yōu)化后的培養(yǎng)基擴(kuò)大一定的倍數(shù)后進(jìn)行曲盤發(fā)酵，在本實施例中三角瓶優(yōu)化得到的培養(yǎng)基擴(kuò)大發(fā)酵(曲盤發(fā)酵)生產(chǎn)β -甘露聚糖酶的酶活性損失不大。對比實施例1根據(jù)CN2010105440832公開的內(nèi)容發(fā)酵比宇佐美曲霉By247菌株生產(chǎn)β -甘露聚糖酶，300mL三角瓶中裝入20g固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)基包括麥麩17g，豆柏3g，硫酸銨O. 5g,磷酸二氫鈉O. 2g,水25mL, 121°C滅菌30min。多層曲盤發(fā)酵配制50kg干料發(fā)酵培養(yǎng)基(麥麩38Kg，豆柏6Kg，稻草粉6Kg，硫酸銨lKg，磷酸二氫鈉O. 5Kg，硫酸鎂O.1Kg),加自來水70Kg。實施例5本發(fā)明的β -甘露聚糖酶體外酶解試驗為了更好地顯示本發(fā)明生產(chǎn)的酸性β -甘露聚糖酶的性能，本實施例采用本發(fā)明生產(chǎn)的酸性甘露聚糖酶、對比例生產(chǎn)的甘露聚糖酶以及其它市售酸性甘露聚糖酶進(jìn)行體外酶解試驗，比較它們之間酶解液中的還原糖生產(chǎn)量見下表I。表I幾種β -甘露聚糖酶對飼料、原料體外酶解結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.ー種發(fā)酵生產(chǎn)￠-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括宇佐美曲霉By247通過發(fā)酵表達(dá)￠-甘露聚糖酶的步驟，其中，宇佐美曲霉By247的保藏編號為=CGMCCNO.4290， (1)三角瓶固體發(fā)酵生產(chǎn)￠-甘露聚糖酶 發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件 發(fā)酵培養(yǎng)基包括基料，每IOOg基料包括麩皮6(T80g，豆柏7 20g，棕櫚柏13 20g，基于上述 IOOg 基料添加魔芋粉 0. 7 2. 7g，(NH4) 2S04 I 3g，KH2PO4 I 3g，水 113 173mL ；pH3.(T8. 0，滅菌，冷卻后接種f 4mL宇佐美曲霉By247種子液，混合均勻，于培養(yǎng)箱33°C培養(yǎng)72 96h ； (2)曲盤固體發(fā)酵生產(chǎn)￠-甘露聚糖酶 曲盤發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 發(fā)酵培養(yǎng)基包括基料，每IOOg基料包括麩皮80g，豆柏7g，棕櫚柏13g，基于上述IOOg基料添加魔芋粉50g, (NH4)2SO4 150g, KH2PO4 75g，水11. 5L，自然pH，混合均勻，分裝、滅菌，冷卻后接種7 15% (V/W)的宇佐美曲霉By247種子液，混合均勻，倒入曲盤，置于曲房中31 34°C培養(yǎng)72 96h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)3-甘露聚糖酶的方法，其特征在于，宇佐美曲霉By247種子液的制備過程如下 (1)斜面種子培養(yǎng)基制備及菌種活化稱粉碎后的大麥芽70g，加300ml的水，在60°C的水浴鍋內(nèi)糖化3 4h，過濾，濾液煮沸后再過濾即得到澄清的麥芽汁，調(diào)整其糖度為5 10，最后加5. 5g瓊脂粉，煮沸，吸于各試管內(nèi)，封好試管于121°C滅菌30min，放置斜面，冷卻后接種宇佐美曲霉By247菌株，置培養(yǎng)箱32°C培養(yǎng)96h ； (2)孢子懸浮液制備吸取無菌蒸餾水于已長好的宇佐美曲霉麥芽汁斜面培養(yǎng)基中，用滅菌接種環(huán)將孢子輕輕刮下，置于盛有玻璃珠的小三角瓶中，于往復(fù)式搖床上振蕩5h，200r/min,使孢子充分分散活化，再經(jīng)過濾即為孢子懸浮液，將孢子濃度稀釋約至10卜107個/mL ； (3)10%麩皮提取液的制備稱取50g麩皮，加入700mL水，在沸水中煮沸20min，8層紗布過濾，定容至500mL，即為10%麩皮提取液，于4°C冰箱儲存； (4)種子液制備500mL三角瓶中加入50mL10%麩皮提取液，60mL自來水，0. 5g葡萄糖，4g豆柏粉，混合均勻于121°C滅菌30min，冷卻后于超凈工作臺接種2mL孢子懸浮液，于搖床培養(yǎng)箱32°C、400r/min培養(yǎng)48h，即得種子液。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法。所述方法包括宇佐美曲霉By247通過發(fā)酵表達(dá)β-甘露聚糖酶的步驟。本發(fā)明生產(chǎn)的甘露聚糖酶以棕櫚粕作為發(fā)酵原料之一，動物試驗結(jié)果表明其能夠很好地分解非常規(guī)飼料中的棕櫚粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子，能夠顯著地提高動物的生產(chǎn)性能。本發(fā)明生產(chǎn)的甘露聚糖酶的耐溫性能、分解飼料和原料能力以及動物試驗的效果都比其它市售β-甘露聚糖酶要好。
文檔編號C12N9/42GK103045564SQ201210531670
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者謝志恒, 王敏, 崔細(xì)鵬, 周平發(fā), 翁曉輝, 史寶軍 申請人:廣東溢多利生物科技股份有限公司