專利名稱：大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效qtl 的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳育種領(lǐng)域，涉及大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆籽粒蛋白質(zhì)是當(dāng)今世界上最重要的植物蛋白來源，其含量為40%左右。培育高籽粒蛋白質(zhì)含量的大豆材料，是大豆品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之一。傳統(tǒng)的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量育種是通過表型進(jìn)行選擇。大豆籽粒蛋白質(zhì)含量表型的測定可以通過化學(xué)法測定和光譜法進(jìn)行測定?；诨瘜W(xué)法測定大豆籽粒蛋白質(zhì)含量，需要對大豆種子進(jìn)行破壞，同時需要大量時間和勞力?；诠庾V法測定能快速準(zhǔn)確對大豆種子蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，但光譜法測定需要先建立大豆籽粒蛋白質(zhì)含量模型，同時光譜儀器較貴，一般實(shí)驗室一般無實(shí)力購買。大豆籽粒蛋白質(zhì)含量是典型的數(shù)量性狀，由多基因控制、易受環(huán)境影響，表型選擇具有很大的盲目性。隨著分子生物學(xué)和基于組學(xué)的迅速發(fā)展，以及數(shù)量性狀作圖方法的不斷完善，使得數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait loci, QTL)定位變成了現(xiàn)實(shí)。利用分子標(biāo)記定位數(shù)量性狀QTL，其實(shí)質(zhì)就是分析分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀QTL之間的連鎖關(guān)系。基于獲得的標(biāo)記基因型分離與數(shù)量性狀的量之間的關(guān)系，可直接把握數(shù)量性狀基因，并開發(fā)可應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular-assisted selection, MAS)育種的技術(shù)。利用MAS進(jìn)行育種，核心是找到與性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記。在雙親本構(gòu)建的群體，進(jìn)行QTL定位，結(jié)果一般只限定在兩親本的范圍內(nèi)，同時由于重組代數(shù)較少，定位的結(jié)果在很大的區(qū)間內(nèi)，利用自然材料的關(guān)聯(lián)分析，可以分析整個自然材料的變異，同時基于自然材料歷史的重組事件，定位的精度較高，能夠找到與性狀緊密連鎖的標(biāo)記。目前雖然定位了大量大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL，但發(fā)現(xiàn)新的主效QTL及與主效QTL緊密連鎖的標(biāo)記任是大豆遺傳學(xué)家和育種家們的一個長期目標(biāo)和挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL及其分子標(biāo)記。本發(fā)明的另一目的是提供該大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記在大豆品質(zhì)育種中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一個大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL，所述主效QTL位點(diǎn)位于大豆第8號染色體Gm08:13000kb-17000kb，所述的緊密連鎖標(biāo)記Z56位于大豆第8號染色體Gm08:14193kb。所述的主效QTL位點(diǎn)在‘NJRSXG’重組自交系中解釋10. 7%的大豆籽粒蛋白特征，在地方材料中解釋4. 6%的大豆籽粒蛋白特征，在WT133和XG30的雜交組合中F2:3解釋了 24. 0%的遺傳特征，在F2:4解釋了 20. 0%的遺傳特征。本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56，該分子標(biāo)記的上游引物序列為SEQ ID NO.1，下游引物序列為SEQ ID NO. 2。本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56在大豆育種中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56在大豆育種中的應(yīng)用，優(yōu)選用所述的Z56引物對擴(kuò)增大豆基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，如果獲得18(Tl90bp的擴(kuò)增片段，則表明存在本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量增效QTL位點(diǎn)，預(yù)測該大豆具有較高的籽粒蛋白質(zhì)含量，如果獲得15(Tl60bp的擴(kuò)增片段，則表明存在本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量減效QTL位點(diǎn)，預(yù)測該大豆具有較低的籽粒蛋白質(zhì)含量。本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56在檢測所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56的引物對，該分子標(biāo)記的上游引物序列為SEQ ID NO.1，下游引物序列為SEQ ID NO. 2。本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56的引物對在檢測本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL中的應(yīng)用。一種檢測大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的方法，利用本發(fā)明所述的引物對擴(kuò)增大豆基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，如果獲得185bp的擴(kuò)增片段，則表明存在本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL。本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56的引物對在大豆育種中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56的引物對在大豆育種中的應(yīng)用，優(yōu)選用用所述的Z56引物對擴(kuò)增大豆基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，如果獲得18(Tl90bp的擴(kuò)增片段，則表明存在本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量增效QTL位點(diǎn)，預(yù)測該大豆具有較高的籽粒蛋白質(zhì)含量，如果獲得15(Tl60bp的擴(kuò)增片段，則表明存在本發(fā)明所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量減效QTL位點(diǎn)，預(yù)測該大豆具有較低的籽粒蛋白質(zhì)含量。本發(fā)明大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL連鎖的分子標(biāo)記是通過下列步驟篩選的(I)利用先進(jìn)2號和趕泰2-2雜交，得到雜種F1，通過‘單粒傳’法構(gòu)建群體，獲得147個F2:7代重組自交系(‘NJRSXG，)。(2)利用SSR分子標(biāo)記分析兩個親本，統(tǒng)計分析親本間具有多態(tài)性的位點(diǎn)，在重組自交系鑒定親本間具有多態(tài)性標(biāo)記的遺傳類型，然后對其進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建‘NJRSXG’的遺傳連鎖圖譜。(3)對先進(jìn)2號和趕泰2-2及其衍生的‘NJRSXG’群體的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，利用混合線性模型(QTLNetwork 2. O)進(jìn)行定位,在第8號染色體15300kb附近檢測到大豆籽粒蛋白質(zhì)含量的主效QTL。(4)利用大豆第8號染色體13000kb_17000kb的indel信息,設(shè)計新的分子標(biāo)記。

(5)利用國豕大 改良中心保存的366份大 地方材料，測定大 桿粒蛋白質(zhì)含量表型，同時鑒定新設(shè)計分子標(biāo)記的遺傳帶型。(6)利用地方材料表型數(shù)據(jù)和分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)最緊密連鎖標(biāo)記Ζ56。在4環(huán)境下都能檢測到，4環(huán)境聯(lián)合的解釋率為4. 6%。(7)利用WT133和XG30(國家大豆改良中心保存)配制新的雜交組合，提取F2(WXF2)代單株DNA，分析Z56在F2單株的遺傳帶型。(8)將WT133和XG30組合的F2:3和F2:4種成株行，測定株行籽粒蛋白質(zhì)含量，利用Z56和籽粒蛋白質(zhì)含量表型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Z56遺傳帶型在F2:3解釋了 24. 0%的遺傳特征，在F2:4解釋了 20. 0%的遺傳特征。有益效果本發(fā)明在國際·上首次鑒定了一個位于大豆Gm08號染色體Gm08:13000kb_17000kb區(qū)域控制大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL，同時發(fā)現(xiàn)一個緊密連鎖標(biāo)記Z56。Z56分子標(biāo)記在地方材料和雜交后代中的表現(xiàn)使其在大豆籽粒蛋白質(zhì)含量的育種中具有重要的價值。1、首次鑒定了位于大豆Gm08號染色體Gm08:13000kb-17000kb附近的一個控制大
豆籽粒蛋白質(zhì)含量分子標(biāo)記。2、緊密連鎖分子標(biāo)記Z56。在地方材料4個環(huán)境中，大S·籽粒蛋白質(zhì)含量與分子標(biāo)記Z56引物對相關(guān)性都顯著，在配制組合中，F(xiàn)2單株基因型能有效預(yù)測的F2:3和F2:4代籽粒蛋白質(zhì)含量表型，在育種實(shí)踐中有很好的應(yīng)用前景。3、本發(fā)明提出了利用大豆種質(zhì)資源中籽粒蛋白質(zhì)含量QTL的方法。


圖1 :地方材料Z56弓丨物對擴(kuò)增產(chǎn)物。其中1-46為地方材料，M 50bp DNA Marker,箭頭所指為185bp特異擴(kuò)增條帶。圖2 =WXF2群體Z56弓丨物對擴(kuò)增產(chǎn)物。其中I為WT133材料帶型，2位XG30材料帶型，3-48位WXF2群體F2材料擴(kuò)增帶型，M:50bp DNA Marker,箭頭所指為185bp特異擴(kuò)增條帶。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的獲得(I)、‘NJRSXG’ 群體構(gòu)建利用我國兩個大豆材料先進(jìn)2號和趕泰2-2進(jìn)行雜交，得到雜種F1，通過“單籽傳”法構(gòu)建群體，獲得147個F2:7代重組自交系(‘NJRSXG’)?！皢巫褌鳌狈ú襟E如下在父母本雜交當(dāng)代從母本植株上收獲的一粒種子種植后長成一個Fl代單株，其自交(即自花授粉)結(jié)實(shí)收獲I株&代種子，后者種植長成一個包含分離性狀的F2代株行，它的每一單株自交結(jié)實(shí)收獲F3代種子，將分離的同類性狀植株單株收獲并脫粒裝袋，每株種子次年單獨(dú)種植一個F3株行，自交結(jié)實(shí)收獲F4代種子，……，直至各家系內(nèi)不同植株之間的性狀完全穩(wěn)定一致。像這樣最初由單粒種子經(jīng)過連續(xù)多代自交、分離、純化、種植、選育及鑒定等程序，最終發(fā)展成一個有數(shù)百個重組自交系構(gòu)成的大群體，即為“單籽傳”法構(gòu)建群體。(2)、‘NJRSXG’群體遺傳圖譜的構(gòu)建利用SSR分子標(biāo)記方法分析兩個親本及147個重組自交系材料，統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點(diǎn)在后代群體中的遺傳類型。利用Jionmap3. O作圖軟件，構(gòu)建了一張包含400個SSR標(biāo)記的‘NJRSXG’群體的遺傳連鎖圖譜。采用CTAB法提取‘NJRSXG’大豆葉片的基因組DNA，所用引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(10ul)，其中含有3ulDNA模板(15ng)、上下游引物(O. 2mmol/L)各1. 5ul、1. 2ulMgC12 (2. 5mmol/L)、0· 24ul dNTP (10mmol/L, N=A, C, G, T),0. 12ul Taq酶(5U/ul)和1. 4ul ddH20。PCR反應(yīng)程序:95°C變性5min ;隨后進(jìn)行33個循環(huán)的94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s ;再經(jīng)72°C延伸IOmin ;最后4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。膠片在BIO-RAD visadoc3. OCBio-RAD, USA)成像系統(tǒng)中掃描分析。(3) ‘NJRSXG’群體大豆籽粒蛋白質(zhì)含量表型測定利用1095Knifetec樣品磨(FOSS Tecator,瑞士)將‘NJRSXG’群體干燥大豆種子磨粉。利用VECTOR 22/N傅立葉紅外光譜儀測定大豆種子粉光譜，利用建立的大豆蛋白質(zhì)含量模型預(yù)測大豆種子蛋白質(zhì)含量。(4)結(jié)果與分析利用QTLNetwork 2. O結(jié)合‘NJRSXG’群體表型數(shù)據(jù)和分子數(shù)據(jù)，進(jìn)行大豆籽粒蛋白質(zhì)含量的QTL定位，在第8號染色體15300kb附近(Satt089)發(fā)現(xiàn)大豆籽粒蛋白質(zhì)含量的主效QTL，5環(huán)境聯(lián)合有10. 7%的表型解釋率。實(shí)施例2.大豆籽粒蛋白質(zhì)含量 主效QTL緊密標(biāo)記Z56的獲得(I)分子標(biāo)記開發(fā) 利用公布的大豆物理圖譜信息及國家大豆改良中心測序材料的序列信息，在第8號染色體Gm08:13000kb-17000kb區(qū)域設(shè)計多個分子標(biāo)記。( 2 )地方材料表型測定用于分析的大豆地方材料包含全國6個生態(tài)區(qū)的366份材料，利用1095Knifetec樣品磨(FOSS Tecator,瑞士)將干燥大豆種子磨粉。利用VECTOR 22/N傅立葉紅外光譜儀測定大豆種子粉光譜，利用建立的大豆蛋白質(zhì)含量模型預(yù)測大豆種子蛋白質(zhì)含量。( 3 )地方材料分子標(biāo)記鑒定采用CTAB法提取大豆地方材料葉片的基因組DNA，PCR反應(yīng)體系(IOul)，其中含有 3ulDNA 模板(15ng)、上、下游引物(0. 2mmol/L)各1. 5ul、l. 2ulMgC12(2. 5mmol/L)、0. 24ul dNTP (IOmmoI/L,N=A, C, G, T),0. 12ul Taq 酶(5U/ul)和1. 4ul ddH20。PCR 反應(yīng)程序95°C變性5min ;隨后進(jìn)行33個循環(huán)的94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s ;再經(jīng)72°C延伸IOmin ;最后4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。膠片在 BI0-RADvisadoc3. O (Bio-RAD, USA)成像系統(tǒng)中掃描分析。(4)、結(jié)果與分析在設(shè)計的多個分子標(biāo)記中，Z56具有最小的P值和最大的表型解釋率，認(rèn)為是與籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL緊密連鎖的標(biāo)記。在366份地方材料中Z56只有兩種等位變異，條帶大小分別為155bp和185bp，擁有185bp帶型的材料具有很大高籽粒蛋白質(zhì)含量的可能。在4環(huán)境聯(lián)合分析中Z56的表型解釋率為4. 6% (表I)。Z56分子標(biāo)記上游引物序列為SEQID NO.1，下游引物序列為SEQ ID NO. 2。表1Z56分子標(biāo)記在366份地方材料中多個環(huán)境下的表現(xiàn)
權(quán)利要求
1.一個大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL，其特征在于所述主效QTL位點(diǎn)位于大豆第8號染色體Gm08:13000kb-17000kb，所述的緊密連鎖標(biāo)記Z56位于大豆第8號染色體Gm08:14193kb。
2.權(quán)利要求1所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56，其特征在于該分子標(biāo)記的上游引物序列為SEQ ID NO.1，下游引物序列為SEQ ID NO. 2。
3.權(quán)利要求2所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56在大豆育種中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于用所述的Z56引物對擴(kuò)增大豆基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，如果獲得18(Tl90bp的擴(kuò)增片段，則表明存在權(quán)利要求1所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量增效QTL位點(diǎn)，預(yù)測該大豆具有較高的籽粒蛋白質(zhì)含量，如果獲得15(Tl60bp的擴(kuò)增片段，則表明存在權(quán)利要求1所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量減效QTL位點(diǎn)，預(yù)測該大豆具有較低的籽粒蛋白質(zhì)含量。
5.權(quán)利要求2所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56在檢測權(quán)利要求1所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56的引物對，其特征在于該分子標(biāo)記的上游引物序列為SEQ ID NO. 1，下游引物序列為SEQ ID NO. 2。
7.權(quán)利要求6所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56的引物對在檢測權(quán)利要求I所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL中的應(yīng)用。
8.—種檢測權(quán)利要求1所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的方法，其特征在于利用權(quán)利要求6所述的引物對擴(kuò)增大豆基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，如果獲得18(Tl90bp的擴(kuò)增片段，則表明存在權(quán)利要求1所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量增效QTL，如果獲得15(Tl60bp的擴(kuò)增片段，則表明存在權(quán)利要求1所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量減效QTL位點(diǎn)。
9.權(quán)利要求6所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56的引物對在大豆育種中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于用權(quán)利要求6所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記Z56的引物對擴(kuò)增大豆基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，如果獲得18(Tl90bp的擴(kuò)增片段，則表明存在權(quán)利要求1所述的大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL位點(diǎn)，預(yù)測該大豆具有較高的籽粒蛋白質(zhì)含量。
全文摘要
本發(fā)明公開了大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明大豆籽粒蛋白質(zhì)含量主效QTL，所述主效QTL位點(diǎn)位于大豆第8號染色體Gm08:13000kb-17000kb。該分子標(biāo)記的上游引物序列為SEQ ID NO.1，下游引物序列為SEQ ID NO.2。在新配置的雜交組合中，以待測F2單株大豆籽粒的基因組DNA為模板，Z56引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物中具有一個大小為180bp-190bp的特異DNA片段的待測大豆為候選的具有高籽粒蛋白質(zhì)含量材料。利用本發(fā)明的分子標(biāo)記可以簡便快捷的篩選大豆籽粒高蛋白質(zhì)材料，可以加快大豆籽粒高蛋白質(zhì)含量育種。
文檔編號C12N15/11GK103045588SQ201210531628
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者蓋鈞鎰, 張英虎, 趙團(tuán)結(jié) 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)