專(zhuān)利名稱(chēng):心肌梗死相關(guān)基因及其體外檢測(cè)的試劑、制劑或試劑盒、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于生物工程中心肌梗死相關(guān)基因相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種心肌梗死相關(guān)基因及其體外檢測(cè)的試劑、制劑或試劑盒、應(yīng)用。
背景技術(shù):
流行病學(xué)與臨床研究表明,冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary arterydisease)是多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家和許多發(fā)展中國(guó)家成人發(fā)病和死亡的主要原因。隨著人均壽命的延長(zhǎng)、物質(zhì)條件的富裕和文化生活方式的西化,許多發(fā)展中國(guó)家(包括中國(guó))的心血管疾病,特別是心肌梗死患病率和死亡率的增高趨勢(shì)已經(jīng)引起了全世界的關(guān)注。預(yù)計(jì)到2020年,心肌梗死和腦卒中將分別成為全球排名第I位和第4位的疾病。雖然近年來(lái)心肌梗死的診斷和治療有了很大發(fā)展,溶栓藥物和介入治療等大大改善了心肌梗死患者的預(yù)后,但其病因?qū)W與發(fā)病機(jī)制的研究仍然進(jìn)展緩慢。自從20世紀(jì)60年代Frmainghma的研究結(jié)果首次公布以來(lái),人們已逐步認(rèn)識(shí)到心肌梗死是由多種危險(xiǎn)因素決定的。除了傳統(tǒng)的心肌梗死危險(xiǎn)因素,如吸煙、肥胖、高血壓等以外,遺傳因素與環(huán)境因素的相互作用在心肌梗死的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。心肌梗死(myocardial infarction ;MI)是冠心病的一種嚴(yán)重狀態(tài),致殘率和死亡率均居冠心病之首。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,遺傳因素在心肌梗死發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)。近年基礎(chǔ)研究表明,某些基因的變異,包括腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、脂質(zhì)代謝系統(tǒng)、凝血與纖溶系統(tǒng)和炎癥因子等基因多態(tài)性可以增加冠心病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。
前列環(huán)素(prostacyclin,PGI2)首先發(fā)現(xiàn)于1976年,是花生四烯酸的一種代謝產(chǎn)物,在正常PH值水中水解成無(wú)活性的6-酮-前列腺素Fl α (6-酮-PGFl α ),在人體中半衰期約為6 min,主要通過(guò)刺激環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的生成而引起血管平滑肌舒張并抑制平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng),同時(shí)有強(qiáng)大的抗血小板聚集作用。另外,PGI2還可以促使內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮(NO),而NO又能促使PGI2生成增加,可見(jiàn)兩者可以形成良性循環(huán),共同參與維持血管平滑肌的舒張。因此自PGI2在1976年被發(fā)現(xiàn)以后人們就考慮其在心血管領(lǐng)域中的應(yīng)用問(wèn)題,早在1979年有研究者提出,PGI2具有減少心肌梗死面積和心肌耗氧量等細(xì)胞保護(hù)作用,但機(jī)制還沒(méi)有完全闡明。目前已經(jīng)肯定的是PGI2對(duì)肺動(dòng)脈高壓的治療作用,并有PGI2制劑和其類(lèi)似物應(yīng)用于臨床,且取得肯定療效。日本學(xué)者Nakayama研究認(rèn)為PGI2類(lèi)似物可以有效地預(yù)防心血管疾病的發(fā)生。由于其舒張血管、抑制血小板聚集和抗平滑肌細(xì)胞增殖的作用,從而阻斷了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的某些環(huán)節(jié),有利于預(yù)防動(dòng)脈血栓性疾病的發(fā)生。因此可以設(shè)想PGI2水平的下降可以降低其對(duì)血管的保護(hù)作用而增加動(dòng)脈血栓性疾病的發(fā)生率。前列環(huán)素合酶(prostacyclin synthase, PGIS)是細(xì)胞色素P450超家族中的成員,能催化前列腺素H2 (PGH2)生成PGI2。有研究證實(shí)PGIS主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,但新近研究表明PGIS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)亦有廣泛分布,如大腦皮層和海馬的錐體細(xì)胞以及小腦部位的浦肯野細(xì)胞,作者還發(fā)現(xiàn)PGIS mRNA在血管和中樞大神經(jīng)元中均有大量表達(dá),且二者具有明顯的相關(guān)性。另有一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明PGIS cDNA轉(zhuǎn)染至大鼠血管平滑肌細(xì)胞可以導(dǎo)致PGI2合成增加并且抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。Zou等研究結(jié)果也表明PGIS活性降低可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。上述結(jié)果顯示PGIS不僅可以調(diào)節(jié)PGI2的合成,而且還具有直接的抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用,并可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)具有重要意義。PGI2的生成主要受到PGIS的調(diào)節(jié),而CYP8A1基因是編碼PGIS的基因,其遺傳多態(tài)性對(duì)PGI2的合成存在明顯的影響。PGIS基因定位于第20號(hào)染色體上,長(zhǎng)度大約為60kb并包含10個(gè)外顯子。同年日本學(xué)者Nakayama等對(duì)PGIS基因進(jìn)行了測(cè)序并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)描述。認(rèn)為PGIS基因的長(zhǎng)度為70kb,約為cDNA長(zhǎng)度的30倍,外顯子的長(zhǎng)度范圍為74bp至182bp,內(nèi)含子為Ikb至19kb。近年來(lái)已經(jīng)有大量的臨床研究證實(shí)PGI2在心血管疾病中的作用,其血清水平的高低可能直接決定患者發(fā)生心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)。臨床上該蛋白質(zhì)有可能被優(yōu)先應(yīng)用于心肌梗死患病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種心肌梗死相關(guān)基因及其體外檢測(cè)的試劑、制劑或試劑盒、應(yīng)用,克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足,其能有效解決現(xiàn)有技術(shù)在預(yù)防和治療心肌梗死時(shí)效果不理想的問(wèn)題。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種心肌梗死相關(guān)基因即第八外顯子突變的CYP8A1基因,該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的序列。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種體外檢測(cè)根據(jù)權(quán)利要求1所述的心肌梗死相關(guān)基因的試劑,該試劑用于檢測(cè)CYP8A1基因G1120C位點(diǎn)的多態(tài)性,該試劑包括如下引物
上游引物5’ATGTGACTGTGTGGGCGAG3’ ;
下游引物5’AGGAAGGGGAAGAGGAGGA3’。下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)
上述試劑可為用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析相結(jié)合的試劑或用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與直接測(cè)序法相結(jié)合的試劑。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種有體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的試劑的制劑或試劑盒,該試劑盒包含PCR擴(kuò)增酶及相應(yīng)緩沖液。本發(fā)明的技術(shù)方案之四是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的試劑在制備用于體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的制劑或試劑盒中的應(yīng)用。下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)
上述試劑盒中可包含PCR擴(kuò)增酶及相應(yīng)緩沖液。 本發(fā)明對(duì)心肌梗死相關(guān)基因及其體外檢測(cè)的試劑、制劑或試劑盒和應(yīng)用做了詳細(xì)介紹,該體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的試劑盒除了可以用于體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的多態(tài)性外,還可以用于檢測(cè)、預(yù)防、診斷或治療心肌梗死,從而降低心肌梗死的發(fā)生率,對(duì)預(yù)防和治療心肌梗死疾病具有重大的意義。
圖1為本發(fā)明中心肌梗死相關(guān)基因的基因組結(jié)構(gòu)示意圖,從圖中可以看出心肌梗死相關(guān)基因,由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。圖2為本發(fā)明中心肌梗死相關(guān)基因序列變異的篩查流程示意圖。圖3為本發(fā)明的部分測(cè)序圖譜。圖4為本發(fā)明的G1120C多態(tài)性位點(diǎn)的酶切圖譜。其中如泳道3顯示待測(cè)個(gè)體G1120C位點(diǎn)的基因型為C/G雜合子;泳道I顯示待測(cè)個(gè)體的G1120C位點(diǎn)為C/C純合子;泳道2顯示待測(cè)個(gè)體的G1120C位點(diǎn)為G/G純合子。
具體實(shí)施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明,現(xiàn)參照下列實(shí)施例及附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明,實(shí)施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件進(jìn)行如Sambrook等人所著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(New fork: Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1,一種心肌梗死相關(guān)基因即第八外顯子的CYP8A1基因,該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所不的序列。含有CYP8A1的基因的待測(cè)樣品可以從來(lái)自試驗(yàn)者的細(xì)胞獲得,如來(lái)自血液、尿、唾液、胃液、頭發(fā)、活組織檢查和尸體解剖材料的細(xì)胞,優(yōu)選來(lái)自血液。實(shí)施例2,一種體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的試劑,該試劑用于檢測(cè)CYP8A1基因G1120C位點(diǎn)的多態(tài)性, 該試劑包括如下引物
上游引物5’ATGTGACTGTGTGGGCGAG3’ ;
下游引物5’AGGAAGGGGAAGAGGAGGA3’。本CYP8A1基因與在Genbank中登記號(hào)為5740 (Gene ID)的CYP8A1基因相比,為第八外顯子突變;具體地,為G1120C多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因?yàn)镃,C1120C A/G多態(tài)性位點(diǎn)為按照在CYP8A1基因組中的位置定義的,具體來(lái)說(shuō)是從CYP8A1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)算起為+1,第1120個(gè)堿基為C。所謂“基因多態(tài)性”指的是在人群中,各個(gè)體基因的核苷酸序列存在的差異。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知,本發(fā)明所述的多態(tài)性位點(diǎn)為單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn),即基因組序列中單核苷酸發(fā)生改變;核苷酸酸序列的差異可以體現(xiàn)在DNA水平上或者RNA水平上,所以,本發(fā)明的心肌梗死相關(guān)基因可以體現(xiàn)在DNA水平,RNA水平上,優(yōu)選DNA水平,更優(yōu)選基因組DNA。目前關(guān)于復(fù)雜性狀疾病的研究有兩種策略,連鎖分析的方法和病例-對(duì)照研究。由于心肌梗死是一種多因素疾病,是由遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,因而采用連鎖分析較為困難。從遺傳的角度分析,冠心病/心肌梗死屬?gòu)?fù)雜遺傳性狀疾病。對(duì)該疾病的發(fā)生起作用的因素中,除環(huán)境因素外,起作用的基因總數(shù)估計(jì)多達(dá)上百條,各個(gè)基因之間又存在著相互作用,基因又和環(huán)境之間存在相互作用。冠心病/心肌梗死的發(fā)生具有一定的家族聚集性,但更多的是一些散發(fā)病例。發(fā)生心肌梗死的大都是一些高齡病人,往往等知道的時(shí)候病人已經(jīng)死亡,因此很不容易收集到心肌梗死的家系資料。所以本發(fā)明采用病例對(duì)照研究。所述病例對(duì)照研究就是在采用隨機(jī)挑選的兩組人群中(病例和對(duì)照)比較某等位基因的頻率。本發(fā)明在新疆維維爾族人群中通過(guò)大樣本的統(tǒng)計(jì)分析(500例心肌梗死患者和500例對(duì)照),經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn),最后以確鑿的證據(jù)證明了具有本發(fā)明的Gl 120C多態(tài)性位點(diǎn)的CYP8A1基因?yàn)樾募」K老嚓P(guān)基因,C等位基因的攜帶者患心肌梗死的危險(xiǎn)性較G等位基因攜帶者增加了 2倍。實(shí)施例3,作為上述實(shí)施例的優(yōu)選,該試劑為用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析相結(jié)合的試劑或用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與直接測(cè)序法相結(jié)合的試劑。試劑盒中檢測(cè)G1120C位點(diǎn)的試劑根據(jù)檢測(cè)方法的不同而不同,例如,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析相結(jié)合方法來(lái)檢測(cè)G1120C多態(tài)性位點(diǎn)時(shí),試劑盒中可以含有限制性?xún)?nèi)切酶和相應(yīng)的酶切圖譜,例如EcoR I限制性?xún)?nèi)切酶和相應(yīng)的酶切圖譜。實(shí)施例4,一種有體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的試劑的制劑或試劑盒,其特征在于該試劑盒包含PCR擴(kuò)增酶及相應(yīng)緩沖液。本發(fā)明檢測(cè)第八外顯子區(qū)域多態(tài)性的心肌梗死相關(guān)基因的試劑盒可以用于體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的多態(tài)性;第八外顯子區(qū)域突變的心肌梗死相關(guān)基因的試劑盒可以用于檢測(cè)、預(yù)防、診斷或治療心肌梗死;體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的方法可以用于檢測(cè)、預(yù)防、診斷或治療心肌梗死。實(shí)施例5,一種體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的試劑在制備用于體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的制劑或試劑盒中的應(yīng)用。 本發(fā)明檢測(cè)第八外顯子區(qū)域多態(tài)性的心肌梗死相關(guān)基因的試劑盒可以用于體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的多態(tài)性;第八外顯子區(qū)域突變的心肌梗死相關(guān)基因的試劑盒可以用于檢測(cè)、預(yù)防、診斷或治療心肌梗死;體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的方法可以用于檢測(cè)、預(yù)防、診斷或治療心肌梗死。實(shí)施例6,與上述實(shí)施例的不同之處在于,試劑盒還包含PCR擴(kuò)增酶及相應(yīng)緩沖液。實(shí)施例7,研究對(duì)象的選取
心肌梗死組(MI組)500例,選自2006年I月 2010年3月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心住院患者,符合世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于缺血性心臟病的命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組500例,選擇同期住院經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查排除心肌梗死的體檢者。兩組均為維吾爾族人群,年齡和性別構(gòu)成比均匹配,具有均衡性。納入標(biāo)準(zhǔn):MI組按照世界衛(wèi)生組織制定的缺血性心臟病的診斷標(biāo)準(zhǔn),選擇發(fā)病3個(gè)月之內(nèi)的新發(fā)MI病例,且全部經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)有一支或多支血管閉塞或嚴(yán)重狹窄。對(duì)照組選擇有冠脈造影資料且結(jié)果證實(shí)無(wú)冠狀動(dòng)脈病變的住院體檢者。兩組在納入研究前簽署知情同意書(shū)。剔除標(biāo)準(zhǔn)MI組臨床資料不全者及同時(shí)合并以下疾病之一者予以剔除。(如主動(dòng)脈夾層、風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病者、多臟器功能衰竭以及具有精神障礙不能配合者)。對(duì)照組有精神障礙者或經(jīng)多普勒檢查證實(shí)有頸動(dòng)脈斑塊或狹窄者,予以剔除。實(shí)施例8,心肌梗死相關(guān)基因序列變異篩查
整個(gè)心肌梗死相關(guān)基因序列變異篩查流程見(jiàn)圖2。從病例組中隨機(jī)挑選48例心肌梗死患者作為篩查對(duì)象,構(gòu)成96條染色體,這個(gè)樣本量可提供95%的把握度檢測(cè)到少見(jiàn)等位基因頻率大于1%的序列變異。所有個(gè)體均為維吾爾族,且無(wú)任何血緣關(guān)系。根據(jù)NCBI中公布的CYP8A1外顯子序列,通過(guò)blast數(shù)據(jù)庫(kù)比較獲得CYP8A1基因序列。檢測(cè)多態(tài)性的方法是利用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。利用Primer 5. O軟件設(shè)計(jì)PCR引物,擴(kuò)增CYP8A1基因全部外顯子及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)。引物序列見(jiàn)表I。反應(yīng)體系(25 μ I):基因組模板DNA 50ng (來(lái)自血液標(biāo)本,按照常規(guī)方法將白細(xì)胞內(nèi)的DNA用苯酚-氛仿法或者用鹽析法提取出來(lái)即可)、10XPCR Buffer 2.5 μ I,dNTPsl 4 1(10臟01/1),引物?1、卩2各0.5 μ I (20 pmol/μ I ),DNA 模板 I yl,TaqDNA聚合酶2.5U(0.5 μ D0在96孔PCR自動(dòng)循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR循環(huán)參數(shù)96°C預(yù)變性5分鐘;經(jīng)94°C 30秒,58-620C 45秒,72°C I分鐘;循環(huán)35周后于72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)純化2遍后進(jìn)行測(cè)序反應(yīng),以PCR引物作為測(cè)序引物。測(cè)序在ABI 3500測(cè)序儀上完成。圖3顯示部分測(cè)序圖譜。結(jié)果以中國(guó)新疆維吾爾族為研究對(duì)象,經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的序列篩查工作,從CYP8A1基因序列中發(fā)現(xiàn)新的SNP位點(diǎn),根據(jù)通行的命名規(guī)則命名為G1120C,位于CYP8A1基因序列的第8外顯子區(qū)。實(shí)施例9,采用PCR-RFLP方法檢測(cè)本發(fā)明的心肌梗死相關(guān)基因G1120C多態(tài)性 方法PCR反應(yīng)體系(25 μ I):基因組模板DNA 50ng(來(lái)自血液標(biāo)本,按照常規(guī)方
法將白細(xì)胞內(nèi)的DNA用苯酚-氛仿法或者用鹽析法提取出來(lái)即可)UOXPCR Buffer 2.5μ I, dNTPsl μ 1(10 mmol/L),引物 Ρ1、Ρ2 各 O. 5 μ I (20 pmol/μ 1),DNA 模板 I μ I,Taq DNA聚合酶2. 5 U (O. 5 μ I)。在96孔PCR自動(dòng)循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR循環(huán)參數(shù)96°C預(yù)變性5分鐘;經(jīng)94°C 30秒,58-62°C 45秒,72°C I分鐘;循環(huán)35周后于72°C延伸10分鐘。引物如下
5’ ATGTGACTGTGTGGGCGAG3’
5, AGGAAGGGGAAG AGGAGGA3,
擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為275堿基,選用EcoR I限制性?xún)?nèi)切酶(立陶宛MBI公司)進(jìn)行酶切。酶切條件參見(jiàn)生產(chǎn)廠家的操作手冊(cè)。然后在2%的瓊脂糖膠上電泳后用紫外透射儀觀察長(zhǎng)度。結(jié)果如圖4所示,當(dāng)275堿基長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物切割后產(chǎn)生了 230和45兩種長(zhǎng)度的片段時(shí),說(shuō)明G1120C位點(diǎn)的等位基因?yàn)镚,當(dāng)只有275堿基長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物時(shí),說(shuō)明G1120位點(diǎn)的等位基因?yàn)镃。由于圖4所示的待測(cè)樣品為來(lái)自待測(cè)個(gè)體的DNA,所以,如泳道3所示,產(chǎn)生3種片段,則該待測(cè)個(gè)體G1120C位點(diǎn)的基因型為C/G雜合子;攜帶C和G兩種等位基因;如泳道I所示,只有一個(gè)片段,該待測(cè)個(gè)體的G1120C位點(diǎn)為C/C純合子,攜帶C等位基因;如泳道2所示,只產(chǎn)生2條有用的片段,待測(cè)個(gè)體的G1120C位點(diǎn)為G/G純合子,攜帶G等位基因。實(shí)施例10,利用PCR與直接測(cè)序法檢測(cè)本發(fā)明的G1120C多態(tài)性
方法首先對(duì)G1120C位點(diǎn)進(jìn)行PCR反應(yīng),具體條件及引物參見(jiàn)實(shí)施例3。對(duì)PCR產(chǎn)物在ABI 3500測(cè)序儀上直接讀取序列。結(jié)果如圖2和圖3所示,為本發(fā)明的測(cè)序過(guò)程及部分測(cè)序圖。其中圖2的測(cè)序圖中I至3分別顯示本發(fā)明待測(cè)個(gè)體的G1120C多態(tài)性位點(diǎn)為,CC純合子、C/G雜合子及GG純
口 4^ ο實(shí)施例11,多態(tài)位點(diǎn)與心肌梗死的關(guān)聯(lián)研究為進(jìn)一步從遺傳的角度探討C反應(yīng)蛋白基因和心肌梗死發(fā)病之間的關(guān)系,并為國(guó)內(nèi)外已有的同類(lèi)研究提供遺傳流行病學(xué)的證據(jù),運(yùn)用PCR-RFLP的國(guó)際通行的基因分型方法,在收集到的500例心肌梗死患者和相應(yīng)的500例對(duì)照中,體外檢測(cè)來(lái)自待測(cè)個(gè)體的樣品中Gl 120C位點(diǎn)的多態(tài)性,從而分析Gl 120C位點(diǎn)在心肌梗死患者和正常對(duì)照人群的分布差異。
首先運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg平衡是一種群體遺傳學(xué)的概念主要是指一民族生活在某一地區(qū)、能相互隨機(jī)雜交的一群人體,這個(gè)群體所具有的全部遺傳信息稱(chēng)為該群體的基因庫(kù),它直接反映本地區(qū),本民族的遺傳特征。這些遺傳信息的表達(dá)形式基因頻率和基因型頻率,在沒(méi)有突變、遷移和遺傳漂變的條件下,群體中基因頻率和基因型頻率遵守保持不變即為Hardy-Weinberg平衡。這樣既有遺傳多態(tài)性,又具備遺傳的穩(wěn)定性。對(duì)基因分型結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),基因分型結(jié)果符合Hardy-Weinberg平衡,因此可以排除實(shí)驗(yàn)誤差,該基因分型結(jié)果比較可靠。分析結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)論單因素分析發(fā)現(xiàn),多態(tài)位點(diǎn)G1120C的三種基因型個(gè)體在病例組和對(duì)照組中的分布有明顯差異(p〈0. 05), C/G顯隱性遺傳模式進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),C等位基因的攜帶者相對(duì)G等位基因的攜帶者在病例組和對(duì)照組中有顯著差別(P〈0. 05),其中C等位基因的攜帶者患心肌梗死的危險(xiǎn)性是G等位基因的攜帶者患心肌梗死的危險(xiǎn)性的2倍。干擾病例對(duì)照研究最嚴(yán)重的因素包括人群在遺傳基礎(chǔ)上的混雜、病例入選時(shí)因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)不嚴(yán)格產(chǎn)生的疾病混雜等,在排除了以上幾個(gè)混雜因素的基礎(chǔ)上,發(fā)明人挑選了 500個(gè)研究樣本和相應(yīng)的對(duì)照,這在國(guó)際同類(lèi)研究中屬于比較大的研究樣本,為了進(jìn)一步分析G1120C位點(diǎn)對(duì)心肌梗死危險(xiǎn)度的貢獻(xiàn),在調(diào)整了年齡、生化指標(biāo)、高血壓、糖尿病等心肌梗死其它危險(xiǎn)因素的影響后,進(jìn)行多變量logistic回歸模型分析。logistic回歸模型分析是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的一種普通的分析方法,它主要用于二分變量的分析,可以用來(lái)調(diào)整對(duì)整個(gè)分析造成混雜的因素。結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果如表3所示,多變量logistics回歸模型分析表明G1120C仍然保持為心肌梗死的危險(xiǎn)因素。結(jié)論說(shuō)明第八外顯子區(qū)域突變的CYP8A1基因?yàn)樾募」K老嚓P(guān)基因,并且對(duì)于C反應(yīng)蛋白Gl 120C位點(diǎn),攜帶C等位基因個(gè)體患心肌梗死的危險(xiǎn)性比攜帶G等位基因的個(gè)體患心肌梗死的危險(xiǎn)性顯著升高。實(shí)施例12,多態(tài)位點(diǎn)G1120C是心肌梗死的一個(gè)遺傳易感因素的功能上的證據(jù) G1120C本身位于CYP8A1基因編碼區(qū),該位點(diǎn)的突變屬于一種非同義突變,很有可能會(huì)
影響PGIS的水平或活性。進(jìn)而影響其下游產(chǎn)物PGI2濃度,從而使不同的個(gè)體產(chǎn)生對(duì)心肌梗死的遺傳易感性增加。針對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物特定的靶位點(diǎn)可以有效抑制由于基因突變導(dǎo)致的PGI2的水平下降,抑制血管收縮和血小板聚集,從而降低心肌梗死的發(fā)生率。這將會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。發(fā)明人研究了不同基因型之間PGI2的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),C等位基因攜帶者和G等位基因攜帶者比較,血漿6-酮-PGFl α水 平明顯降低UKQ. 05)。結(jié)論進(jìn)一步說(shuō)明第8外顯子突變的CYP8A1基因?yàn)樾募」K老嚓P(guān)基因。該位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)對(duì)新藥研制具有十分重要的意義。實(shí)施例13,體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因即CYP8A1基因的試劑盒一種體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的試劑盒,該試劑盒包含 I)擴(kuò)增G1120C位點(diǎn)的引物
5’ ATGTGACTGTGTGGGCGAG3’
5, AGGAAGGGGAAGAGGAGGA3,
2) PCR擴(kuò)增酶及相應(yīng)緩沖液;
3) EcoR I限制性?xún)?nèi)切酶和相應(yīng)的酶切圖譜。
權(quán)利要求
1.一種心肌梗死相關(guān)基因即第八外顯子突變的CYP8A1基因,其特征在于該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的序列。
2.—種體外檢測(cè)根據(jù)權(quán)利要求1所述的心肌梗死相關(guān)基因的試劑,其特征在于該試劑用于檢測(cè)CYP8A1基因G1120C位點(diǎn)的多態(tài)性,該試劑包括如下引物 上游引物5’ATGTGACTGTGTGGGCGAG3’ ; 下游引物5’AGGAAGGGGAAGAGGAGGA3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的試劑,其特征在于該試劑為用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析相結(jié)合的試劑或用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與直接測(cè)序法相結(jié)合的試劑。
4.一種有根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的試劑的制劑或試劑盒,其特征在于該試劑盒包含PCR擴(kuò)增酶及相應(yīng)緩沖液。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的試劑在制備用于體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的制劑或試劑盒中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于試劑盒中包含PCR擴(kuò)增酶及相應(yīng)緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程中心肌梗死相關(guān)基因相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種心肌梗死相關(guān)基因及其體外檢測(cè)的試劑、制劑或試劑盒、應(yīng)用,該心肌梗死相關(guān)基因即第八外顯子突變的CYP8A1基因,該基因的核苷酸序列具有SEQIDNO:1所示的序列。本發(fā)明對(duì)心肌梗死相關(guān)基因及其體外檢測(cè)的試劑、制劑或試劑盒和應(yīng)用做了詳細(xì)介紹,該體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的試劑盒除了可以用于體外檢測(cè)心肌梗死相關(guān)基因的多態(tài)性外,還可以用于檢測(cè)、預(yù)防、診斷或治療心肌梗死,從而降低心肌梗死的發(fā)生率,對(duì)預(yù)防和治療心肌梗死疾病具有重大的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103045625SQ20121053120
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者馬依彤, 謝翔, 楊毅寧, 王寶珠, 付真彥, 李曉梅, 馬翔 申請(qǐng)人:新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院