一種高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D及其基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領域。具體地，本發(fā)明涉及一種高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D及其基因和應用，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。本發(fā)明的甘露聚糖酶具有以下性質：最適pH為5.0，在pH3.5-8.0范圍內(nèi)，該酶能夠維持其60%以上的酶活力，最適反應溫度為65℃，并在50℃下非常穩(wěn)定，另外，其比活力為3133U?mg–1。該甘露聚糖酶具有酸性、高比活、較好的耐熱性，可作應用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術方案就可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)性質優(yōu)良適合工業(yè)應用的甘露聚糖酶。
【專利說明】一種高比活酸性β -甘露聚糖酶Man5D及其基因和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D及其基因和應用。
【背景技術】
[0002]植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素及木質素等物質構成。甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，是由β_1，4-?-甘露糖連接而成的線狀多聚體，在多糖的側鏈上主要有葡萄糖基、乙?；桶肴樘腔热〈鶊F。β -甘露聚糖酶(β -mannanase EC3.2.1.78)是一種水解甘露聚糖的內(nèi)切水解酶，以內(nèi)切方式降解甘露糖主鏈β -1, 4糖苷鍵，釋放出短的β_1，4甘露寡糖。
[0003]近年來，隨著甘露寡糖生理功能的發(fā)現(xiàn)，綠色飼料的興起以及人們環(huán)保意識的增強，能源的再生利用研究，人們對β -甘露聚糖酶的研究和利用已進入了一個新的階段。
甘露聚糖酶已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、飼料、造紙、紡織印染、石油開采、精細化工及生物技術等諸多領域，是一種新型的工業(yè)酶，具有很大的潛在應用價值。
[0004]甘露聚糖酶廣泛存在于細菌、放線菌、真菌、植物、動物等生物中。細菌來源的甘露聚糖酶主要是酸偏中性的甘露聚糖酶。其分子量多在35kDa~55kDa之間，最適反應作用溫度為50°C~70°C。目前研究最多的是芽孢桿菌，除嗜堿性芽孢桿菌的最適作用PH達到 pH9.0以上，大多最適反應pH在5.5~8.0之間。真菌的β -甘露聚糖酶一般呈酸性，分子量大約在45kDa~55kDa，最適作用pH為4.0~6.0，最適作用溫度為55°C~75°C。相對細菌而言，真菌來源的甘露聚糖酶最適反應pH值、pH穩(wěn)定性都偏低，耐熱性比細菌差。目前國內(nèi)外，雖然許多β`_甘露聚糖酶被克隆分離及性質測定，但這些酶的性質特征，均存在一些缺陷，例如，PH作用范圍不合適，熱穩(wěn)定性差，表達量低等，均不能滿足實際應用的需要。因此人們希望能夠找到一種新的能夠滿足實際應用需求的β_甘露聚糖酶，從而能夠進一步推廣該β-甘露聚糖酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應用。
[0005]本發(fā)明從Staphylotrichum coccosporum NBRC31817 菌株中得到了一個新的β_甘露聚糖酶基因，其編碼的甘露聚糖酶具有以下幾個優(yōu)點:酸性、較好的熱穩(wěn)定性、高比活、強的蛋白酶抗性、容易發(fā)酵生產(chǎn)。所有這些優(yōu)點都意味著新發(fā)明的β_甘露聚糖酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中，將會更有應用價值比以前所報道的β_甘露聚糖酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種酸性、較好熱穩(wěn)定性、高比活的β -甘露聚糖酶。
[0007]本發(fā)明的再一目的是提供上述β_甘露聚糖酶的基因。
[0008]本發(fā)明的再一目的是提供包含上述β -甘露聚糖酶的重組載體。
[0009]本發(fā)明的再一目的是提供包含上述甘露聚糖酶基因的重組菌株。
[0010]本發(fā)明的再一目的是提供一種制備β_甘露聚糖酶的方法。
[0011]本發(fā)明的再一目的是提供上述β_甘露聚糖酶的應用。[0012]本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種性質優(yōu)良的、適合于在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應用的新的甘露聚糖酶。該甘露聚糖酶Man?，其氣基酸序列如SEQ ID N0.1:
[0013]
【權利要求】
1.一種高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1或 SEQ ID N0.2 所示。
2.一種高比活酸性β_甘露聚糖酶基因，其特征在于，編碼權利要求1所述的一種高比活酸性β -甘露聚糖酶Man?。
3.根據(jù)權利要求2所述的高比活酸性β-甘露聚糖酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 或 SEQ ID N0.5 所示。
4.包含權利要求2所述高比活酸性β_甘露聚糖酶基因的重組表達載體。
5.包含權利要求2所述高比活酸性β-甘露聚糖酶基因的重組表達載體pPIC9_man5D。
6.包含權利要求2所述高比活酸性β_甘露聚糖酶基因的重組菌株。
7.包含權利要求2所述高比活酸性β-甘露聚糖酶基因的重組菌株GS115/manro。
8.一種制備高比活酸性β_甘露聚糖酶Man?的方法，其特征在于，包括以下步驟: (O以權利要求4所述的重組表達載體轉化宿主細胞； (2)培養(yǎng)宿主細胞； (3)分離純化獲得β-甘露聚糖酶Man?。
9.權利要求1所述高比活酸性β-甘露聚糖酶Man?的應用。
【文檔編號】C12N1/19GK103642779SQ201310733016
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月26日 優(yōu)先權日:2013年12月26日
【發(fā)明者】姚斌, 羅會穎, 王彩虹, 石鵬君, 黃火清, 王亞茹, 楊培龍, 柏映國, 孟昆 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所