專利名稱:高效降解多環(huán)芳烴和苯系有機物的分枝桿菌16f及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)領(lǐng)域及環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及一株高效降解多環(huán)芳烴和苯系有機物的分枝桿菌16F及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(PAHs)是指兩個或兩個以上苯環(huán)以稠環(huán)和非稠環(huán)形式相連接的有機化合物。PAHs在環(huán)境中普遍存在，其極低的水溶性、穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)是造成這類化合物持久性的主要原因。人類及動物癌癥病變有70%-90%是環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)引起的，而PAHs則是環(huán)境致癌化學(xué)物質(zhì)中最大的一類。由于這類化合物具有致癌、致畸和致突變的特性，對人類健康和生態(tài)環(huán)境均具有潛在的危險而引起世界各國的普遍重視。近幾十年來，環(huán)境中的多環(huán)芳烴(PAHs)含量不斷增加，美國環(huán)保局已經(jīng)列出了 16種PAHs作為環(huán)境污染的優(yōu)先控制污染物(Keith&Telliard，1979)，我國政府也將7種PAHs列入中國環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單。因 此，凈化與修復(fù)PAHs污染的環(huán)境已成為研究的熱點。
盡管PAHs能夠通過化學(xué)氧化、光解和揮發(fā)等途徑降解和轉(zhuǎn)移，但是微生物降解是影響自然界中PAHs持久性的最關(guān)鍵因素。生物修復(fù)被認為是目前去除環(huán)境中有機物的最經(jīng)濟有效的方法。一般來說，隨著多環(huán)芳烴苯環(huán)數(shù)量的增加，其生物降解速率降低。因此，低分子量的多環(huán)芳烴在環(huán)境中能較快被降解，在環(huán)境中存在的時間較短，而高分子量的多環(huán)芳烴因水溶性更低，吸附性更強，從而降低了生物可利用性，較長期存在于環(huán)境中。目前關(guān)于微生物降解PAHs的研究，主要集中于PAHs降解微生物的篩選、分離與純化，目前分離到的降解微生物主要有分枝桿菌(Mycobacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)Jg單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、微球菌屬(Micrococcus)、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、諾卡氏菌屬(Nocardioides)、海桿菌屬(Marinobacter)、弧菌屬(Vibrio)、拜葉林克氏菌屬(Bei jernckia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、藍細菌(Cyanobacteria)、解環(huán)菌屬(Cycloclastieus)等。其中分枝桿菌是一類非常重要的降解細菌。Mycobacteriumvanbaalenii PYR-I 是第一株降解花的分枝桿菌(Hetikamp, 1988 ；Heitkamp 等,1988)。之后，研究人員又發(fā)現(xiàn)許多不同的分枝桿菌，如Mycobacterium sp. strain BBl (Boldrin等，1993)、Mycobacterium sp. RJGII-135 (Schneider 等，1996)、Mycobaterium sp. KR20(Rehmann 等，1998)、Mycobaterium sp. API (Vila 等，2001)及 Mycobaterium sp. JLS(Miller 等，2004)>Mycobacterium flavescens (Dean-Ross, 1996)>Mycobaterium sp. KMS(Chun 等，2012)等。其中 Mycobacterium vanbaalenii PYR-I^Mycobacterium sp. JLS 和Mycobaterium sp. KMS已經(jīng)完成全基因組的測序工作(http://img. jgi. doe. gov )。美國Cerniglia實驗室對Mycobacterium vanbaalenii PYR-I的研究最為深入，率先闡明了花、熒蒽的完整代謝途徑和不同多環(huán)芳烴降解的代謝網(wǎng)絡(luò)(Kim等，2006 ;Kweon等，2007 ；Kweon等，2011)。
苯系化合物是一類易揮發(fā)的單環(huán)芳香類化合物，包括苯、甲苯、乙苯、二甲苯等，簡稱為BTEX，BTEX主要存在于原油和石油產(chǎn)品中，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、化纖紡織、塑料化工等行業(yè)，是環(huán)境中分布較廣的一類有毒化合物。與多環(huán)芳烴類似，BTEX也具有“三致效應(yīng)”，被許多國家列入優(yōu)先控制污染物，且已被確認為強致癌物質(zhì)。研發(fā)廢水、廢氣中BTEX的污染控制技術(shù)顯得十分重要和迫切。
目前，微生物降解技術(shù)是降解苯系有機物的最有效方法之一。采用微生物法處理環(huán)境中BTEX等有毒化合物的關(guān)鍵之一便是獲得具有高效降解BTEX能力的優(yōu)良菌株。人們已經(jīng)分離出了多株BTEX降解菌，主要包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、諾卡氏菌屬(Nocardioides)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes)和Cladophialophora等。但是這些已有的降解菌株僅能降解某一種或兩種苯系化合物，降解底物范圍有限，且大多數(shù)菌株的降解效率有待進一步提高。
由上可知，目前用于多環(huán)芳烴或苯系有機物污染修復(fù)的菌劑多是針對兩類污染物中的一種或多種，利用單一細菌或真菌以及混合菌系進行降解。比如在“一種多環(huán)芳烴降解·菌劑的制備方法(公開號CN101423807A)”中，利用新型菌株Mycobacterium sp. SN12，經(jīng)過7天，對芘和菲的降解率分別為91. 5%和95. 2%。在“一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化細菌制備方法(公開號CN 101177679A)”中，42天后微球菌對芘和苯并芘的降解率分別為30. 7%和25. 7%，動膠桿菌對芘和苯并芘的降解率分別為31. 4%和21. 9%。而在“具有降解苯系化合物能力的分枝桿菌及其應(yīng)用(公開號CN 101624576A)”中，菌株Mycobacteriumcosmeticum byf-4在35h時，甲苯被降解完全，苯、乙苯、鄰二甲苯先后在41h、45h、50h被降解完。事實上，土壤或者水體等環(huán)境中的污染尤其是工業(yè)場地的環(huán)境污染常常表現(xiàn)出明顯的復(fù)合污染特征。因此，單獨使用現(xiàn)有菌劑中的任何一種，往往很難奏效。而對PAHs和BTEX兩類污染物均能實現(xiàn)高效降解的菌株較鮮見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種同時具有降解多種多環(huán)芳烴和單環(huán)苯系有機物的分枝桿菌(Mycobacterium sp. ) 16F 及其應(yīng)用。
為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一株高效降解多環(huán)芳烴和苯系有機物的分枝桿菌(Mycobacterium sp. ) 16F,分離自北京焦化廠重度污染土壤中，經(jīng)過人工富集培養(yǎng)、分離純化獲得，該菌經(jīng)Biolog和16SrDNA雙重鑒定為分枝桿菌屬(Mycobacterium sp. ), 16S rDNA的GenBank登錄號為JN966739，菌株命名為16F。微生物學(xué)特性革蘭氏染色陽性，短桿狀，無芽孢，生物學(xué)特性為接觸酶、氧化酶陽性，菌落呈鮮黃色、圓形、邊緣整齊、表面光滑、較濕潤、不透明，專性需氧，24°C至37°C生長良好，可利用麥芽糖、乙酸、龍膽二糖碳源生長，最適生長pH為6. 5-7. 55,對50mg/L的氨節(jié)青霉素具有抗性。該菌株現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期2012年07月18日，保藏編號=CGMCC No. 6367。
本發(fā)明還提供含有所述分枝桿菌16F的菌劑。
本發(fā)明還提供所述分枝桿菌16F或所述菌劑在降解多環(huán)芳烴和/或單環(huán)苯系有機物中的應(yīng)用。所述多環(huán)芳烴為芴、萘、蒽、苊、苊烯、硫芴、咔唑、屈、菲、芘、熒蒽、苯并熒蒽、苯并蒽或苯并芘等中的一種或多種，所述單環(huán)苯系有機物為苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、苯酚、水楊酸或鄰苯二酚等中的一種或多種。
前述的應(yīng)用，其是將分枝桿菌16F的菌懸液加入到含有多環(huán)芳烴和/或單環(huán)苯系有機物的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，在30°C 150rpm避光條件下?lián)u床培養(yǎng)，進行底物降解。其中，分枝桿菌 16F 的菌懸液濃度為 3. 5 X IO8 4. 5 X 108CFU/mL,優(yōu)選 4. I X 108CFU/mL。
所述基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基配方為硫酸銨2. 5g，硫酸亞鐵O. 28mg，磷酸氫二鈉I. 5g，磷酸二氫鉀I. 36g，硫酸鎂O. 25g，氯化鈣10. 7mg,氯化鈉O. 5g，氯化鐵O. 004g, I. OmL微量金屬液，ImL維生素復(fù)合溶液，加水至IOOOmL并將pH控制在7. 2-7. 4，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用。其中微量金屬液的組成為=CoCl2 · 6H2035mg, CuCl2O. 20mg, Η3Β036· Omg, MnCl2 · 4H2025mg, Na2MoO4 · 2H20 3. Omg, NiCl2 · 2H20 2. Omg, ZnCl22. 5mg，加水至 IOOOmL ;維生素復(fù)合溶液的組成為:維生素B61. Omg,維生素H O. 5mg,維生素C I. 5mg,加水至IOOOmL0
分枝桿菌16F的功能特性如下可以在好氧條件下以芴、萘、蒽、苊、菲、芘和苯并花為唯一碳源和能源生長并降解。例如，當(dāng)荷、花、苯并花的初始濃度分別為50m g/L、IOOmg/L和12. 5mg/L時，7天、5天和15天后的降解去除率分別為91. 3%,92. 9%和48. 8%，并且還能利用苯、間二甲苯、甲苯、水楊酸、鄰苯二酹等其他多種芳香有機物，對初始濃度為200ppm的苯、200ppm的甲苯和IOOppm的二甲苯，在5天、4天和3天后的降解去除率分別為99. 9%，99. 6%和90%。對鏈霉素、利福平、四環(huán)素、卡那霉素等抗生素敏感，對老化土壤中的混合多環(huán)芳烴降解效果較好，21天對總多環(huán)芳烴的去除率達到了 76. 45%。
本發(fā)明進一步提供用于擴增所述分枝桿菌16F 16SrDNA的引物對，包括上游引物5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和下游引物 5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
本發(fā)明的分枝桿菌(Mycobacterium sp. ) 16F可以高效、安全、快速地降解多環(huán)芳烴和單環(huán)苯系化合物，其可在好氧條件下以芴、萘、蒽、苊、菲、芘和苯并芘為唯一碳源和能源生長并降解，并且還能利用苯、間二甲苯、甲苯、水楊酸、鄰苯二酚等其他多種芳香有機物。對鏈霉素、利福平、四環(huán)素、卡那霉素等抗生素敏感，對老化土壤中的混合多環(huán)芳烴和水體中的單環(huán)苯系有機物降解效果較好，可以用于芳香烴類有機復(fù)合污染的水土環(huán)境的修復(fù)與凈化，對于促進可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，具有廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明提供的同時具有降解多種多環(huán)芳烴和單環(huán)苯系有機物的分枝桿菌16F，為開展多種高環(huán)多環(huán)芳烴和苯系有機物降解的機理研究和多環(huán)芳烴復(fù)合污染水土環(huán)境修復(fù)技術(shù)的構(gòu)建提供了新的種質(zhì)資源，并為研發(fā)復(fù)合污染土壤的修復(fù)技術(shù)體系提供了科學(xué)依據(jù)。


圖I為本發(fā)明實施例2中菌株16F降解初始濃度為IOOppm的芘紫外掃描圖。
圖2為本發(fā)明實施例2中菌株16F針對初始濃度為50ppm的芘的降解曲線。
圖3為本發(fā)明實施例2中菌株16F針對初始濃度為200ppm的芘的降解曲線。
圖4為本發(fā)明實施例2中不同金屬離子對菌株16F降解率的影響。
圖5為本發(fā)明實施例2中菌株16F針對初始濃度為50mg/L的芴的降解曲線。
圖6為本發(fā)明實施例2中菌株16F針對初始濃度為12. 5mg/L的苯并芘的降解曲線。
圖7為本發(fā)明實施例4中菌株16F針對模擬污染土壤(芘的初始濃度為100mg/L)的降解曲線。
圖8為本發(fā)明實施例5中菌株16F針對老化土中16種多環(huán)芳烴的去除率。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
實施例I同時具有降解多種多環(huán)芳烴和單環(huán)苯系有機物的分枝桿菌(Mycobacterium sp. ) 16F 的分離純化
具體步驟如下
(I)采集北京焦化廠重度污染的土壤樣品，將其通過8目網(wǎng)篩后立即放置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?
(2)向體積為500mL的開口玻璃瓶中加入2001^濃度為5(^/1芘的丙酮混合溶液，超凈臺中放置4小時除去丙酮，或?qū)⒉Ａ块_口放置24小時自然風(fēng)干。
(3)向步驟(2)中開口玻璃瓶中加入200-300mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為120r/min的條件下攪拌30min,然后加入步驟(I)中的土壤50g ;然后置于溫度為25_30°C轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床中攪拌富集馴化培養(yǎng)14天,然后搖勻后均勻吸取10毫升富集液轉(zhuǎn)入新的玻璃瓶中，以上操作連續(xù)轉(zhuǎn)接5次。玻璃瓶中同樣加有同等濃度的芘和200-300mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，其中基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的組成為硫酸銨2. 5g，硫酸亞鐵O. 28mg，磷酸氫二鈉I. 5g，磷酸二氫鉀I. 36g，硫酸鎂O. 25g，氯化鈣10. 7mg,氯化鈉O. 5g，氯化鐵O. 004g, I. OmL微量金屬液，ImL維生素復(fù)合溶液，加水至IOOOmL并將pH控制在7. 2-7. 4，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用。其中微量金屬液的組成為=CoCl2 · 6H2035mg, CuCl2O. 20mg, Η3Β036· Omg, MnCl2 · 4H2025mg, Na2MoO4 · 2H20 3. Omg, NiCl2 · 2H20 2. Omg, ZnCl22. 5mg，加水至 IOOOmL ;維生素復(fù)合溶液的組成為:維生素B61. Omg,維生素H O. 5mg,維生素C I. 5mg,加水至IOOOmL0
(4)向體積為IOOOmL的錐形瓶內(nèi)加入600mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基、O. 6mL微量金屬液、
O.6mL維生素復(fù)合溶液，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用。
(5)向體積為150mL的錐形瓶內(nèi)加入50mL按步驟(4)配制的液體培養(yǎng)基和O. 9g瓊脂，然后在溫度為121 °C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至65-70 °C時，在超凈工作臺中將其倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺中半開蓋放置6小時，以除去培養(yǎng)基表面多余的水分。
(6)在超凈工作臺中向步驟(5)中的培養(yǎng)皿中加入O. 04mL濃度為50g/L芘的丙酮溶液，來回傾斜轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，同時用玻璃棒均勻涂布，使芘的丙酮溶液能夠均勻分布在培養(yǎng)基表面上，該培養(yǎng)皿在超凈工作臺中半開蓋放置12小時，以除去培養(yǎng)基表面的丙酮。
(7)在超凈工作臺中吸取ImL步驟(3)得到的多環(huán)芳烴富集液，用無菌水依次稀釋至IOmUlOOmL和IOOOmL,然后從中分別吸取LOmL加入步驟(6)制備好的培養(yǎng)皿中，用無菌玻璃棒涂布培養(yǎng)皿使接種有混合菌群的培養(yǎng)基稀釋溶液均勻分布。將培養(yǎng)皿放入溫度為30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，7-15天后便可發(fā)現(xiàn)有明顯的菌落出現(xiàn)。
(8)在超凈工作臺中挑取步驟(7)培養(yǎng)皿中的菌落，進行重復(fù)分離，初步分離純化得到可能降解多環(huán)芳烴的純菌種。
(9)多環(huán)芳烴降解菌的復(fù)篩將初步分離純化的各菌株接種于Luria-Bertani培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D_約為O. 6，離心去上清，用基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基洗滌并懸浮菌體；Luria-Bertani培養(yǎng)基(以下簡稱為LB培養(yǎng)基)的組成為胰蛋白胨IOg,酵母抽提物5g,氯化鈉5g，加蒸餾水至lOOOmL，pH 7. 2-7. 4，121 °C濕熱滅菌20min?；A(chǔ)鹽培養(yǎng)基組成與步驟(3)中成分相同。
(10)吸取步驟(9)中的菌懸液I. OmL接入裝有以芘為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中，以芘為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基組成如下在滅菌三角瓶中加入50g/L芘的丙酮溶液，超凈工作臺內(nèi)使丙酮溶液揮發(fā)完全，再加入無機鹽液體培養(yǎng)基，使多環(huán)芳烴終濃度為終濃度為100mg/L ;30°C，150rpm避光搖床培養(yǎng)10天，設(shè)置不加菌懸液的作為對照，采用GC-MS測定菌株的降解效果，從而復(fù)篩出能降解多環(huán)芳烴的降解菌。該菌經(jīng)Biolog和16S rDNA雙重鑒定為分枝桿菌屬(Mycobacterium sp. ), 16S rDNA的GenBank的登錄號為JN966739，菌株命名為16F。
實施例2分枝桿菌16F的降解實驗(I)在滅菌三角瓶中加入50g/L芘的丙酮溶液，超凈工作臺內(nèi)使丙酮溶液揮發(fā)完全，再加入無機鹽液體培養(yǎng)基，使多環(huán)芳烴終濃度為終濃度為100mg/L，接入1%體積含量的Mycobacterium sp. 16F菌懸液,對照為不接菌體的空白對照,30°C, 150rpm避光搖床培養(yǎng)，分別在I天、2天、3天、4天和5天經(jīng)紫外分光光度計和氣相-質(zhì)譜聯(lián)機檢測，紫外掃描圖見圖1，菌株16F可以在48h內(nèi)降解75%的初始濃度為100mg/L的花，5天可以降解92%以上。
菌懸液制備方法挑取菌株Mycobacterium sp. 16F的單菌落接種于裝有LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于30°C，120rpm搖床振蕩培養(yǎng)72-96小時；然后用無菌水調(diào)節(jié)至每mL的Mycobacterium sp. 16F 菌懸液中含有 4. I X 108CFU/mL 的 Mycobacterium sp. 16F 菌體,以下實施例中所提及的菌懸液如無特殊說明均按照此方法制備。
(2)在滅菌三角瓶中加入50g/L芘的丙酮溶液，超凈工作臺內(nèi)使丙酮溶液揮發(fā)完全，再加入無機鹽液體培養(yǎng)基，使多環(huán)芳烴終濃度為50mg/L，接入1%體積含量的Mycobacterium sp. 16F菌懸液,對照為不接菌體的空白對照,30°C, 150rpm避光搖床培養(yǎng)，分別在O天-7天經(jīng)紫外分光光度計和氣相-質(zhì)譜聯(lián)機檢測，降解曲線見圖2。從圖2中可以看出，而對于初始濃度為50ppm的芘，5天時可降解94%以上，可以在7天內(nèi)降解完全。
(3)在滅菌三角瓶中加入50g/L芘的丙酮溶液，超凈工作臺內(nèi)使丙酮溶液揮發(fā)完全，再加入無機鹽液體培養(yǎng)基，使多環(huán)芳烴終濃度為200mg/L，接入2%體積含量的Mycobacterium sp. 16F菌懸液,對照為不接菌體的空白對照,30°C, 150rpm避光搖床培養(yǎng)，分別在I天、2天、3天、4天、5天、6天和7天經(jīng)紫外分光光度計和氣相-質(zhì)譜聯(lián)機檢測，降解曲線詳見圖3。在24h至48h內(nèi)降解較快，平均降解速率達3. lppm/h,然后降解速度變慢，直至7天時降解率達到99%以上，結(jié)果如圖3所示。
(4)為研究各種金屬離子對于菌株的多環(huán)芳烴降解能力是否存在影響，設(shè)計液體搖瓶實驗，實驗初始條件為含50ppm芘的基礎(chǔ)鹽溶液中添加ImM各類重金屬離子，150rpm,30°C避光搖床培養(yǎng)36h，然后分別檢測降解效果(圖4)。從圖4可以看出，菌株16F在三氯化鐵和氯化亞鐵存在時降解率較不含金屬離子(加菌)的降解率提高了 19. 8%和8. 2%，而其他諸如鋅、銅、錳及微量元素混合液都對菌株16F降解存在抑制作用。
(5)在滅菌三角瓶中加入50g/L芴的丙酮溶液，超凈工作臺內(nèi)使丙酮溶液揮發(fā)完全，再加入無機鹽液體培養(yǎng)基，使多環(huán)芳烴終濃度為5 O m g / L，接入2 %體積含量的Mycobacterium sp. 16F菌懸液,對照為不接菌體的空白對照,30°C, 150rpm避光搖床培養(yǎng)，分別在O天、I天、2天、3天、4天、5天、6天和7天經(jīng)紫外分光光度計和氣相-質(zhì)譜聯(lián)機檢測，降解曲線見圖5。從圖5中可以看出，菌株16F在前48h內(nèi)對50ppm荷的降解慢于同濃度的芘，在48h至96h內(nèi)降解較快，平均降解速率達O. 63ppm/h,然后降解速度變慢，直至168h時降解率達到91. 3%。
(6)在滅菌三角瓶中加入5g/L苯并芘的丙酮溶液，超凈工作臺內(nèi)使丙酮溶液揮發(fā)完全，再加入無機鹽液體培養(yǎng)基，使多環(huán)芳烴終濃 度為12. 5mg/L，接入2%體積含量的Mycobacterium sp. 16F菌懸液,對照為不接菌體的空白對照,30°C 150rpm避光搖床培養(yǎng)，分別在10天、15天、20天、25天、30天、35天用氣相-質(zhì)譜聯(lián)機檢測，降解曲線見圖6。菌株16F對初始濃度為12. 5ppm的苯并芘，在10天左右降解即可達到48. 34%，但是此后降解基本處于停滯狀態(tài)，至30天時降解率達到53. 29%，說明菌株對苯并芘可以較快降解，但是不能將其完全降解。
實施例3分枝桿菌16F降解底物實驗
將Mycobacterium sp. 16F接種至不同濃度(50-500mg/L,見表I)的水楊酸、鄰苯二酚、苯酚、苯、二甲苯、甲苯等底物的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，同時設(shè)底物空白對照(只加底物不加菌)，在150r/min，30°C搖床中避光振蕩培養(yǎng)2天、4天和6天后測定生物量和檢測底物的降解情況。Mycobacterium sp. 16F的生長和降解情況見表I,結(jié)果表明Mycobacteriumsp. 16F均能利用一定濃度的實驗底物進行生長繁殖并且降解，其中，培養(yǎng)4天后觀察到初始時以固體或油狀漂浮在培養(yǎng)液中的苯、二甲苯、甲苯消失，經(jīng)GC-MS檢測均已100%降解，而對于高濃度底物的耐受性而言，苯系有機物中苯 > 甲苯〉二甲苯；而水溶性較好的水楊酸、鄰苯二酚、苯酚則通過紫外分光光度計檢測培養(yǎng)液中其存在，初始濃度為50mg/L的水楊酸、初始濃度為100mg/L苯酚、初始濃度為200mg/L鄰苯二酚，分別培養(yǎng)4天、6天和2天后經(jīng)檢測均已100%降解。這表明菌株Mycobacterium sp. 16F降解底物的范圍很廣。
表I菌株16F對不同底物的降解多樣性
權(quán)利要求
1.一株高效降解多環(huán)芳烴和苯系有機物的分枝桿菌(Mycobacterium sp. )16F,保藏號為 CGMCC No. 6367。
2.含有權(quán)利要求
I所述分枝桿菌16F的菌劑。
3.權(quán)利要求
I所述分枝桿菌16F或權(quán)利要求
2所述菌劑在降解多環(huán)芳烴和/或單環(huán)苯系有機物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述多環(huán)芳烴為芴、萘、蒽、苊、苊烯、硫芴、咔唑、屈、菲、芘、熒蒽、苯并熒蒽、苯并蒽或苯并芘中的一種或多種，所述單環(huán)苯系有機物為苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、苯酚、水楊酸或鄰苯二酚中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的應(yīng)用，其特征在于，其是將分枝桿菌16F的菌懸液加入到含有多環(huán)芳烴和/或單環(huán)苯系有機物的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，在30°C，150rpm避光條件下?lián)u床培養(yǎng)，進行底物降解。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的應(yīng)用，其特征在于，分枝桿菌16F的菌懸液濃度為3. 5 X IO8 4. 5X108CFU/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基配方為硫酸銨2.5g、硫酸亞鐵O. 28mg、磷酸氫二鈉I. 5g、磷酸二氫鉀I. 36g、硫酸鎂O. 25g、氯化I丐10. 7mg、氯化鈉O. 5g、氯化鐵O. 004g、微量金屬液ImL和維生素復(fù)合溶液lmL，加水至IOOOmL,pH 值 7. 2-7. 4 ;其中微量金屬液的組成為=CoCl2 · 6H2035mg、CuCl2O. 20mg,、Η3Β036· Omg、MnCl2 · 4H20 25mg、Na2MoO4 · 2Η20 3. Omg、NiCl2 · 2Η202· Omg 和 ZnCl22. 5mg，加水至 IOOOmL ；維生素復(fù)合溶液的組成為維生素B61.0mg、維生素H 0. 5mg和維生素C 1.5mg，加水至IOOOmL0
8.用于擴增權(quán)利要求
I所述分枝桿菌16F16S rDNA的引物對，包括上游引物5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和下游引物 5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
專利摘要
本發(fā)明提供一株高效降解多環(huán)芳烴和苯系有機物的分枝桿菌(Mycobacterium sp.)16F，保藏號為CGMCC No.6367。該分枝桿菌16F可以高效、安全、快速地降解多環(huán)芳烴和單環(huán)苯系化合物，可以在好氧條件下以芴、萘、蒽、苊、菲、芘和苯并芘為唯一碳源和能源生長并降解，并且還能利用苯、間二甲苯、甲苯、水楊酸、鄰苯二酚等其他多種芳香有機物。對鏈霉素、利福平、四環(huán)素、卡那霉素等抗生素敏感，對老化土壤中的混合多環(huán)芳烴和水體中的單環(huán)苯系有機物降解效果較好，可以用于芳香烴類有機復(fù)合污染的水土環(huán)境的修復(fù)與凈化，對于促進可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/11GKCN102899271SQ201210380304
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月29日
發(fā)明者郭鵬, 金京華, 程言君, 宋云, 羅霂, 高振 申請人:輕工業(yè)環(huán)境保護研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan