專利名稱:一種降解mc-lr的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的方法
—種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的方法技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及生物工程中原生質(zhì)體制備與再生的方法技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是降解MC-LR 的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備與再生。
背景技術(shù)：
[0002]近年來，隨著水體富營養(yǎng)化程度的加劇，夏秋季節(jié)藍(lán)藻大面積快速繁殖，藍(lán)藻水華頻繁暴發(fā)，大量的藍(lán)藻覆蓋在水體表面，嚴(yán)重阻礙了水體的流動(dòng)，水體的自凈能力降低，復(fù)氧率減小，透明度下降，水質(zhì)惡臭，水體內(nèi)的魚、蝦等浮游生物因生活環(huán)境發(fā)生惡化而死亡。 目前控制藍(lán)藻最常用的依然是傳統(tǒng)的機(jī)械打撈，然而，畢竟人力、物力有限，僅能打撈小部分的藍(lán)藻，大部分的藍(lán)藻在水體內(nèi)因腐爛而消失，而藍(lán)藻危害并沒有隨著其消失而減弱，腐爛的藍(lán)藻細(xì)胞破碎后就會(huì)向水體釋放各種藻類毒素，其中屬于藍(lán)藻門的微囊藻在世界藍(lán)藻水華水體中占有相當(dāng)大的比例，我國的太湖流域就以微囊藻為主，它在繁殖的過程中產(chǎn)生大量的毒性較大的MCs，并儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)，隨著微囊藻的死亡及藻細(xì)胞的破碎，MCs被釋放到水體中，且以溶解性狀態(tài)存在，嚴(yán)重威脅流域附近居民的健康。在現(xiàn)有的物理、化學(xué)及生物等傳統(tǒng)方法達(dá)不到理想控制效果的情況下，利用溶藻細(xì)菌和MCs降解菌聯(lián)合處理藍(lán)藻， 構(gòu)建兼具溶藻和MCs降解功能的雙效工程菌即成為一個(gè)新的研究方向。[0003]原生質(zhì)體融合重組可使兩親本菌株的優(yōu)良性狀同時(shí)表達(dá)出來，也可能使隱性基因因重組而暴露表達(dá)或隨機(jī)產(chǎn)生新的基因表達(dá)出新的性狀，從而成為微生物育種的一種途徑。應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建高效降解菌株用以處理污水的研究已經(jīng)有報(bào)道?！妒称放c生物技術(shù)學(xué)報(bào)》2005年第24卷第2期34-37頁報(bào)道了廖勁松等以單重抗藥性的突變菌株 (S27和K215)為親本菌株，通過原生質(zhì)體融合獲得高效PVA降解菌F-4。《河南科學(xué)》2009 年第27卷第7期809-812頁報(bào)道了張琪等利用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得兼具兩個(gè)親本優(yōu)良性狀的紅霉素高產(chǎn)菌株，對(duì)提高紅霉素產(chǎn)量及化學(xué)藥價(jià)具有較大的應(yīng)用價(jià)值。[0004]微生物溶藻、降解MCs是一個(gè)很有效的方法，國內(nèi)外不少學(xué)者已篩選出多種溶藻菌、MCs降解菌，溶藻菌在溶藻過程·中，破壞藍(lán)藻細(xì)胞，釋放出胞內(nèi)MCs，而在正常藍(lán)藻細(xì)胞環(huán)境中單獨(dú)的MCs降解菌只能降解胞外MCs，這就要求溶藻細(xì)菌與MCs降解菌聯(lián)合使用，從而在溶藻的同時(shí)降解毒性較大的MCs，真正做到治標(biāo)且治本。但是多種菌的優(yōu)化組合來溶藻并降解MCs是一個(gè)很復(fù)雜的課題。利用原生質(zhì)體融合技術(shù)可能將兩株分別具有溶藻、MCs 降解能力的細(xì)菌構(gòu)建成兼具兩個(gè)親本菌株優(yōu)良性狀的高效降解工程菌。目前，原生質(zhì)體融合技術(shù)在MCs降解工程菌構(gòu)建上的應(yīng)用，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。[0005]通過分離篩選分別獲得溶藻細(xì)菌F8、TL，其對(duì)銅綠微囊藻FACHB-905均有較好的溶藻效果。然而已發(fā)現(xiàn)的溶藻細(xì)菌在溶解藻細(xì)胞的同時(shí)使胞內(nèi)藻毒素釋放到水體中，加劇了藍(lán)藻水華帶來的藻毒素污染，其中以MC的危害最為嚴(yán)重。為從根本上解決藍(lán)藻水華帶來的MC污染問題，即去除藍(lán)藻的同時(shí)降解MC，可從以下兩個(gè)思路出發(fā)一是制備溶藻細(xì)菌、 MC降解菌復(fù)合菌劑；二是構(gòu)建兼具溶藻和MC降解功能的轉(zhuǎn)基因工程菌。本方法以原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建工程菌為基礎(chǔ)，主要研究實(shí)驗(yàn)室已分離的MC-LR高效降解菌Tl {Bacillus 的原生質(zhì)體制備,該菌是本實(shí)驗(yàn)室從太湖河浜底泥中篩選出的I株降解MC-LR 的球形芽孢桿菌，已申請(qǐng)發(fā)明專利，公開號(hào)為CN102154170，保藏號(hào)為CGMCC NO. 4498。鑒于親本菌株的抗性標(biāo)記工作量大，天然抗性難以確定，抗性突變亦可能使優(yōu)良性狀發(fā)生不定向改變，為確保親本菌株保持其各自的優(yōu)良生物學(xué)特性，本研究選用滅活原生質(zhì)體融合法， 既減少了工作量，又保證了后續(xù)研究中融合子的質(zhì)量。
發(fā)明內(nèi)容
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的方法，使得其制備率與再生率都達(dá)到較高范圍。[0007]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，按照下述步驟進(jìn)行·(1)菌種活化培養(yǎng)將保藏的菌株Tl {Bacillus重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次,挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為IO8-1O9個(gè)/mL ；(2)原生質(zhì)體的破壁酶解取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min，收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次，用1. 2-1. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入O. 1-1 mg/mL的溶菌酶O. 2-0. 8mL和2 mL加熱至酶解溫度的EDTA溶液，在水浴溫度35°C條件下酶解O. 5-1. 5 h ;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4 mL O. 55 mo I/L NaCl 溶液懸浮即可制備得到原生質(zhì)體；(3)原生質(zhì)體的再生取上述步驟的原生質(zhì)體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的三個(gè)梯度，分別吸取 200 μ I涂布于高滲固體培養(yǎng)基,每個(gè)梯度做三個(gè)平行，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,使得原生質(zhì)體再生。[0008]其中所述的菌株Tl {Bacillus是從太湖河浜底泥中篩選出的I株降解MC-LR的球形芽孢桿菌，保藏號(hào)為CGMCC NO. 4498。其保藏于位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC4498，建議的分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp.。[0009]其中步驟(I)中所述的菌種活化培養(yǎng)用的培養(yǎng)基組成如下(I)細(xì)菌培養(yǎng)基牛肉膏3 g;蛋白胨10 g ；NaCl 5 g ;蒸餾水1000 mL ；pH 7. 0-7. 2 ;若為固體培養(yǎng)基則添加瓊脂粉2. 4% ;上述培養(yǎng)基根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。[0010]其中步驟(3)中所述的原生質(zhì)體的再生用的高滲液體培養(yǎng)基組成如下蛋白胨 10 g,酵母浸出汁5 g,牛肉膏5 g,鹿糖170 g (O. 5 mol/L),蒸懼水定容至1000 mL, pH 7. 2 ;若為高滲固體培養(yǎng)基則加入瓊脂粉20-24 g ;上述培養(yǎng)基根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于 121°C條件下滅菌20 min。[0011]其中所述的溶液配制如下(1)高滲NaCl溶液NaCl O. 55 mol/L。(2) SMM緩沖液蔗糖 O. 55 mol/L，順丁希二酸 20 mmol/L, MgCl2 · 6H20 20 mmol/L, pH 6.8。(3) EDTA溶液EDTA 0.8 g/L，SMM緩沖液配制。(4)溶菌酶0.1 mg/mL，SMM緩沖液配制。上述溶液根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。[0012]上述原生質(zhì)體制備與再生方法優(yōu)選加入溶菌酶使得體系中酶濃度為O. 05 mg/ mL，在溫度為30°C時(shí)酶解lh，該賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備率與再生率最佳，有利于后續(xù)融合子的制備與再生。[0013]本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明的原生質(zhì)體制備與再生方法，工藝簡單，便于操作，可重復(fù)性強(qiáng)；所獲得的原生質(zhì)體制備率最高可達(dá)96. 64%，且再生率可達(dá)83. 95%，原生質(zhì)體制備率高且原生質(zhì)體活性保持較好，有利于后續(xù)融合子的制備與再生。
具體實(shí)施方式
[0014]一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的方法提供了適合該菌原生質(zhì)體制備及高效再生的方法。[0015]以下提供本發(fā)明利用上述方法的5個(gè)實(shí)施例實(shí)施例1將保藏的菌株Tl重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為IO8-1O9 個(gè)/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次， 用1. 2mL的SMM緩沖液重懸；加入O.1 mg/mL的溶菌酶O. 8mL和2 mL加熱至酶解溫度的 EDTA溶液，在水浴溫度35°C條件下酶解I h ;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體， 用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過程所獲得的原生質(zhì)體制備 率為94. 64%，再生率為79. 87%。[0016]其中原生質(zhì)體制備率測定方法如下將溶菌酶處理前的細(xì)胞和酶解后的原生質(zhì)體懸液均用無菌蒸餾水稀釋，放置約10 min，使原生質(zhì)體吸水脹破，分別吸取100 μ I涂布在細(xì)菌固體平板培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度做三個(gè)平行，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，分別計(jì)菌落數(shù)A和B，根據(jù)下述公式計(jì)算原生質(zhì)體制備率，以檢驗(yàn)制備效果。原生質(zhì)體制備率< %)=么土 XlOO %A[0017]其中A為總菌落數(shù)，即未經(jīng)溶菌酶處理的菌液涂布于細(xì)菌平板上生長的菌落數(shù)；B 為未原生質(zhì)體化的細(xì)菌菌落數(shù)，即原生質(zhì)體懸液經(jīng)無菌蒸餾水稀釋后涂布于細(xì)菌平板上生長的菌落數(shù)。[0018]其中原生質(zhì)體的再生率的計(jì)算方法如下取上述步驟的原生質(zhì)體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的三個(gè)梯度，分別吸取 200 μ I涂布于高滲固體培養(yǎng)基，每個(gè)梯度做三個(gè)平行，置于30°c恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計(jì)再生菌落數(shù)C，根據(jù)下述公式計(jì)算原生質(zhì)體再生率，以檢驗(yàn)再生效果。原生質(zhì)體再生率(％) = XlOO %A-B[0019]其中A為總菌落數(shù)，即未經(jīng)溶菌酶處理的菌液涂布于細(xì)菌平板上生長的菌落數(shù)；B為未原生質(zhì)體化的細(xì)菌菌落數(shù)，即原生質(zhì)體懸液經(jīng)無菌蒸餾水稀釋后涂布于細(xì)菌平板上生長的菌落數(shù)；C為再生菌落數(shù)，即原生質(zhì)體懸液，經(jīng)高滲NaCl溶液稀釋后在高滲平板上長出來的菌落數(shù)。[0020]實(shí)施例2將保藏的菌株Tl重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為IO8-1O9個(gè) /mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次，用1. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入I mg/mL的溶菌酶O. 2mL和2 mL加熱至酶解溫度的EDTA溶液，在水浴溫度35°C條件下酶解I h ;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過程所獲得的原生質(zhì)體制備率為96. 43%，再生率為83. 95%。[0021]實(shí)施例3將保藏的菌株Tl重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為IO8-1O9個(gè) /mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次，用1. 6mL的SMM緩沖液重懸；加入I mg/mL的溶菌酶O. 4mL和2 mL加熱至酶解溫度的EDTA溶液，在水浴溫度35°C條件下酶解I h ;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過程所獲得的原生 質(zhì)體制備率為97. 38%，再生率為79. 22%。[0022]實(shí)施例4將保藏的菌株Tl重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為IO8-1O9個(gè) /mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次，用1. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入I mg/mL的溶菌酶O. 2mL和2 mL加熱至酶解溫度的EDTA 溶液，在水浴溫度35°C條件下酶解O. 5 h ;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4 mL 0. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用， 該過程所獲得的原生質(zhì)體制備率為89. 53%，再生率49. 43%。[0023]實(shí)施例5將保藏的菌株Tl重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為IO8-1O9個(gè) /mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次，用1.8mL的SMM緩沖液重懸；加入I mg/mL的溶菌酶0. 2mL和2 mL加熱至酶解溫度的EDTA 溶液，在水浴溫度35°C條件下酶解1. 5 h ;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用 0. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4 mL 0. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用， 該過程所獲得的原生質(zhì)體制備率為96. 22%，再生率19. 24%。
權(quán)利要求
1.一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行 (1)菌種活化培養(yǎng) 將保藏的菌株Tl {Bacillus重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次,挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，為IO8-1O9個(gè)/mL ； (2)原生質(zhì)體的破壁酶解 取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min，收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次，用1.2-1. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入O. 1-1 mg/mL的溶菌酶O. 2-.0. 8mL和2 mL加熱至酶解溫度的EDTA溶液，在水浴溫度35°C條件下酶解O. 5-1. 5 h ;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4 mL O. 55 mo I/L NaCl溶液懸浮即可制備得到原生質(zhì)體； (3)原生質(zhì)體的再生 取上述步驟的原生質(zhì)體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的三個(gè)梯度，分別吸取200 μ I涂布于高滲固體培養(yǎng)基,每個(gè)梯度做三個(gè)平行，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,使得原生質(zhì)體再生。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于其中所述的菌株Tl {Bacillus保藏號(hào)為CGMCC NO. 4498。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于其中步驟(I)中所述的菌種活化培養(yǎng)用的培養(yǎng)基組成如下(I)細(xì)菌培養(yǎng)基牛肉膏3 g ;蛋白胨10 g ；NaCl 5 g ;蒸餾水1000 mL ；pH 7. 0-7. 2 ;若為固體培養(yǎng)基則添加瓊脂粉2. 4% ;上述培養(yǎng)基根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于其中步驟(3)中所述的原生質(zhì)體的再生用的高滲液體培養(yǎng)基組成如下蛋白胨10 g，酵母浸出汁5 g，牛肉膏5 g，蔗糖170 g，蒸餾水定容至1000 mL, pH 7. 2 ;若為高滲固體培養(yǎng)基則加入瓊脂粉20-24 g ;上述培養(yǎng)基根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于其中所述的溶液配制如下:(I)高滲NaCl溶液NaCl O. 55 mol/L; (2)SMM緩沖液鹿糖 O. 55 mol/L,順丁希二酸 20 mmol/L, MgCl2 · 6H20 20 mmol/L, pH 6. 8; (3)EDTA溶液EDTA 0. 8 g/L，SMM緩沖液配制;(4)溶菌酶0. 1-1 mg/mL, SMM緩沖液配制;上述溶液根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
專利摘要
本發(fā)明一種降解MC-LR的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的方法，涉及生物工程中原生質(zhì)體制備與再生的方法技術(shù)領(lǐng)域：
。本方法以原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建工程菌為基礎(chǔ)，從已分離的MC-LR高效降解菌T1(Bacillussphaericus)的原生質(zhì)體制備。本研究選用滅活原生質(zhì)體融合法，既減少了工作量，又保證了后續(xù)研究中融合子的質(zhì)量。采用本發(fā)明的原生質(zhì)體制備與再生方法，工藝簡單，便于操作，可重復(fù)性強(qiáng)；所獲得的原生質(zhì)體制備率最高可達(dá)96.64%，且再生率可達(dá)83.95%，原生質(zhì)體制備率高且原生質(zhì)體活性保持較好，有利于后續(xù)融合子的制備與再生。
文檔編號(hào)C12N1/20GKCN103013848SQ201210342202
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年9月17日
發(fā)明者張文藝, 陳雪珍, 李仁霞, 李秋艷 申請(qǐng)人:常州大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan