專利名稱:一種早期預(yù)判不同品種煙草成熟期葉片生物堿相對(duì)含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種煙草生物堿含量的檢測(cè)方法，尤其涉及一種早期預(yù)判不同品種煙草成熟期葉片生物堿相對(duì)含量的方法 。
背景技術(shù)：
生物堿是廣泛存在于植物體內(nèi)的一類由小分子含氮化合物組成的次生代謝產(chǎn)物，目前世界上已有超過(guò)12000種的生物堿類物質(zhì)被分離鑒定。生物堿在煙草及其制品中有特殊的地位，它不僅是煙草重要的品質(zhì)要素，而且規(guī)定了煙草作為一種商品的特質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，煙草中含有多種生物堿，在栽培煙草中主要有四種，分別是煙堿、降煙堿、假木賊堿和新煙堿，其中尤以煙堿含量最高，一般占到總生物堿的90 95%。
研究表明，不同類型煙草，其生物堿組分與含量差異顯著，同樣，不同品種之間生物堿的組分與含量也不盡相同。此外，栽培條件(如種植地點(diǎn)、天氣、光照和水分等)的不同也對(duì)生物堿有較大影響。由于消費(fèi)者的偏好，我國(guó)種植的煙草類型多為烤煙，占到總栽培面積的95%以上。另一方面，在栽培品種的煙株群體中，由于基因突變，會(huì)出現(xiàn)煙堿轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，即煙堿在去甲基化酶的作用下大量轉(zhuǎn)化為降煙堿。而降煙堿含量的升高會(huì)直接影響煙葉的香吃味品質(zhì)，導(dǎo)致烤煙調(diào)制后出現(xiàn)“櫻紅”現(xiàn)象且香味不佳。
近年來(lái)，我國(guó)煙葉生產(chǎn)中一直存在煙堿等生物堿含量過(guò)高的問(wèn)題，煙堿含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致煙葉品質(zhì)變差，可用性明顯下降，而目前檢測(cè)煙葉生物堿的方法主要是氣相色譜法(GC)，雖然該方法穩(wěn)定性、可操作性都比較好，但該方法僅能分析采收后的成熟煙葉或烘烤后的煙葉，無(wú)法在早期了解不同品種煙葉及同一品種的不同群體內(nèi)生物堿含量的差異，進(jìn)而無(wú)法在早期將不良煙株及時(shí)淘汰。
公開(kāi)號(hào)為“CN102401816A”的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種煙草中生物堿的檢測(cè)方法，包括如下步驟步驟一，取煙草樣品，加入堿溶液，超聲處理，之后加入含有喹啉的有機(jī)溶劑，震蕩萃取，將有機(jī)層濃縮，得進(jìn)樣溶液；步驟二，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器檢測(cè)進(jìn)樣溶液，對(duì)煙草生物堿進(jìn)行定性和定量測(cè)定。
公開(kāi)號(hào)為“CN102004132A”的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種煙草制品中生物堿的測(cè)定方法，它利用氫氧化鈉溶液將煙草或煙草制品中的生物堿游離出來(lái)，采用三乙胺/三氯甲烷溶液萃取試樣中的生物堿，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)定量分析檢測(cè)其中5種生物堿的含量。
上述專利公開(kāi)的檢測(cè)方法均是通過(guò)萃取獲得煙葉樣品中的生物堿，然后利用氣相色譜進(jìn)行檢測(cè)，但所使用的樣品均是成熟煙葉或煙葉制品，無(wú)法在煙葉早期對(duì)生物堿含量進(jìn)行預(yù)測(cè)判斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了一種早期預(yù)判不同品種煙草成熟期葉片生物堿相對(duì)含量的方法，解決了傳統(tǒng)方法只能對(duì)成熟期葉生物堿含量片進(jìn)行定量檢測(cè)，缺乏早期預(yù)判能力，不能及時(shí)剔除不良煙株的問(wèn)題。
一種早期預(yù)判不同品種煙草成熟期葉片生物堿相對(duì)含量的方法，包括
(I)收集至少兩個(gè)煙草品種的處于旺長(zhǎng)期植株的葉片，分別提取各葉片的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；
(2)針對(duì)煙草中任一與生物堿合成相關(guān)的基因設(shè)計(jì)特異性引物，利用該特異性引物，以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算得到各煙草品種所述與生物堿合成相關(guān)的基因的相對(duì)表達(dá)量；(3)預(yù)判各煙草品種成熟期葉片的生物堿相對(duì)含量；
所述煙草中與生物堿合成相關(guān)的基因?yàn)轼B(niǎo)氨酸脫羧酶基因(GenBank:AF321138. I)、腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(GenBank :D28506. I)、甲基腐胺氧化酶基因(GenBank AB289456. I)或喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(GenBank AB038494. I)。
經(jīng)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因(ODC)、腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(PMT)、甲基腐胺氧化酶基因(MPO)和喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(QPT)早期的表達(dá)水平與煙草成熟期葉片生物含量存在正相關(guān)關(guān)系。根據(jù)如下公式可以計(jì)算出多種煙草品種某基因的相對(duì)表達(dá)量t
t = 2-“ct
其中，Λ ACt= ACtl_ACt2，ACt =目標(biāo)基因的Ct值-內(nèi)參基因的Ct值，其中Λ Ctl，Λ Ct2表示兩種進(jìn)行比較的煙草品種葉片中基因表達(dá)水平Ct差值，ACt2作為對(duì)照值。
步驟⑴中葉片取自植株的中部，中部葉片能較好地反映煙株的各項(xiàng)指標(biāo)。
所述旺長(zhǎng)期為煙株經(jīng)過(guò)漂浮育苗后，移栽至大田中55-65天時(shí)。
取到的鮮葉樣品，應(yīng)立即放入裝有液氮的冰盒中短暫保存并提取總RNA，若不立即提取總RNA應(yīng)將樣品保存在_80°C超低溫冰箱中待用。提取總RNA后應(yīng)立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存在_20°C條件下，若不立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA應(yīng)將總RNA樣品保存在_80°C超低溫冰箱中待用。
鮮葉樣品在-80 V條件下保存期為I年，總RNA樣品在-80 V條件下和cDNA樣品在-20°C條件下保存期為6個(gè)月。
步驟(I)中，總RNA提取采用植物RNA試劑盒(如Qiagen公司的RNeasy PlantMini kit等)法或Trizol法進(jìn)行；mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶或MMLV反轉(zhuǎn)錄酶；在步驟(2)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法為SYBR Green I熒光嵌合法。
qRT-PCR反應(yīng)體系采用SYBR Green I熒光嵌合法進(jìn)行qRT-PCR，PCR反應(yīng)液總體積為 20μ 1，包含 Takara 2 X SYBR Premix EX Taq 10 μ 1，正向引物(10 μ Μ) O. 5 μ 1，反向引物(10 μ Μ) O. 5 μ I, cDNA模板2 μ I,滅菌蒸懼水7 μ I。
反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ;95°C變性10s，55°C退火10s，72°C延伸10s，共60個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min ;55_95°C緩慢升溫，產(chǎn)生溶解曲線。
內(nèi)參基因一般選用生物體或細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的基因，本發(fā)明選用內(nèi)參基因?yàn)?6S-RNA(GenBank X68710. I)。針對(duì)內(nèi)參基因的特異性引物如下
正向引物GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC[0026]反向引物TCTCCCTTTAACACCAACGG。
實(shí)時(shí)定量PCR的目的是為了檢測(cè)某基因的相對(duì)表達(dá)量，因?yàn)樵跀U(kuò)增時(shí)不需全序列擴(kuò)增，但選用引物應(yīng)具有較好的特異性，本發(fā)明針對(duì)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因(ODC)、腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(PMT)、甲基腐胺氧化酶基因(MPO)和喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(QPT)的特異性引物以及擴(kuò)增的序列長(zhǎng)度如下表I所示
表I特異性引物及擴(kuò)增序列長(zhǎng)度表
權(quán)利要求
1.一種早期預(yù)判不同品種煙草成熟期葉片生物堿相對(duì)含量的方法，包括 (1)收集至少兩個(gè)煙草品種的處于旺長(zhǎng)期植株的葉片，分別提取各葉片的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ； (2)針對(duì)煙草中任一與生物堿合成相關(guān)的基因設(shè)計(jì)特異性引物，利用該特異性引物，以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算得到各煙草品種所述與生物堿合成相關(guān)的基因的相對(duì)表達(dá)量； (3)預(yù)判各煙草品種成熟期葉片的生物堿相對(duì)含量； 所述煙草中與生物堿合成相關(guān)的基因?yàn)轼B(niǎo)氨酸脫羧酶基因、腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、甲基腐胺氧化酶基因或喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因。
2.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR選用的內(nèi)參基因?yàn)?6S-RNA。
3.如權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于，針對(duì)內(nèi)參基因的特異性引物為 正向引物5 ’ -GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3， 反向引物5 ’ -TCTCCCTTTAACACCAACGG-3，。
4.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，針對(duì)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因、腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、甲基腐胺氧化酶基因和喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的特異性引物如下表所示1 名稱 I正向/反向(5’-3’) —鳥(niǎo)氨酸脫羧酶正向引物iCTGTGTTTGGGCCCACTTG: 基因反向引物CCATATTAGGAAAAACCAGC 腐胺N-甲基轉(zhuǎn)正向引物^ ATTGGACCAAGATCGAGTC^移酶基因反向引物ATTACTGCAGAATTCTCCTAC甲基腐胺氧化正向引物CAGTGATGTTACTGAAACTA酶基因反向引物ATAGGCGAGGAGGACTCATG喹啉酸磷酸核正向引物GACGCATTCCGTGAAAGCAC糖轉(zhuǎn)移酶基因反向引物_ AAGTAATGGCGCTCATGCTC
5.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中葉片取自植株的中部。
6.如權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于，步驟⑴中，葉片重量為O.I lg。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種早期預(yù)判不同品種煙草成熟期葉片生物堿相對(duì)含量的方法，包括(1)收集至少兩個(gè)煙草品種的處于旺長(zhǎng)期植株的葉片，分別提取各葉片的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；(2)針對(duì)煙草中任一與生物堿合成相關(guān)的基因設(shè)計(jì)特異性引物，利用該特異性引物，以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算得到各煙草品種所述與生物堿合成相關(guān)的基因的相對(duì)表達(dá)量；(3)預(yù)判各煙草品種成熟期葉片的生物堿相對(duì)含量；本發(fā)明方法克服了現(xiàn)有檢測(cè)方法只能在煙葉采收后才能對(duì)其定量分析的缺陷，避免了現(xiàn)有方法檢測(cè)的條件限制，為及早判定煙葉生物堿含量開(kāi)辟新的途徑。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN102816852SQ201210314949
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月30日
發(fā)明者儲(chǔ)國(guó)海, 周國(guó)俊, 孫勃, 黃芳芳, 林福呈, 楊軍, 張芬, 金立鋒 申請(qǐng)人:浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司, 中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan