專利名稱:乙醇酸的酶促生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，提供了ー種使用具有改善的腈水解酶活性的突變的腈水解酶，由こ醇腈酶促生產(chǎn)こ醇酸的方法。
背景技術(shù)
こ醇酸(H0CH2C00H ；CAS登記號(hào)為79-14-1)是羧酸的a -羥基酸家族的最簡(jiǎn)單成員。其特性使之理想地廣泛用于消費(fèi)和エ業(yè)用途，包括用于水井修復(fù)、皮革エ業(yè)、油氣エ業(yè)、洗衣和紡織エ業(yè)、在聚こ醇酸(PGA)制備中作為單體、以及作為個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品成分。在多個(gè)行業(yè)中，こ醇酸還是的清潔劑的主要成分(乳制品和食品加工設(shè)別清潔劑、家用和機(jī)構(gòu)用清潔劑、エ業(yè)清潔劑[用于運(yùn)輸設(shè)備、磚石建筑、印刷電路板、不銹鋼鍋爐和加工設(shè)備、冷卻塔/熱交換器]、以及金屬加工[用于金屬酸洗、銅拋光、蝕刻、電鍍、電解拋光])。最近，已報(bào)道聚こ醇酸作為阻氣性材料(即顯示高阻氧特性)用于包裝食品及汽水(W02005/106005A1)。然而，こ醇酸的傳統(tǒng)化學(xué)合成產(chǎn)生了大量的雜質(zhì)，在用于制備作為阻氣性材料的聚こ醇酸之前必須除去。商業(yè)化生產(chǎn)こ醇酸的新技術(shù)，特別是ー種以高純度及低成本生產(chǎn)こ醇酸的技術(shù)，將是エ業(yè)上所渴望獲得的。
已知多種使用相應(yīng)的a-羥基腈作為原料以及微生物作為催化劑用于制備a-羥基酸的方法。所產(chǎn)生的a-羥基酸的例子包括こ醇酸、乳酸、2-羥基異丁酸、2-羥基-2-苯丙酸、苦杏仁酸、2-羥基-3，3- ニ甲基-4- 丁內(nèi)酷和4-甲硫丁酸。這些產(chǎn)物是使用微生物合成的，例如屬于諾卡氏菌屬(Nocardia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、金桿菌屬(Aureobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳酪桿菌屬(Caseobacter)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、微球菌屬(Micrococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、枝動(dòng)桿菌屬(Mycoplana)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)、假絲酵母屬(Candida)、無(wú)芽孢桿菌屬(Bacteridium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、錸孢菌屬(Fusarium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、細(xì)桿菌屬(Microbacterium)、Obsumbacterium和戈登氏菌屬(Gordona)的那些微生物(相應(yīng)于 US 5，223，416 的 JP-A-4-99495、JP-A-4-99496 和 JP-A-4-218385 ;相應(yīng)于 US5，234，826 的 JP-A-4-99497 ;相應(yīng)于 US 5，296，373 的 JP-A-5-95795 ； JP-A-5-21987 ；相應(yīng)于 US 5，326，702 的 JP-A-5-192189 ;相應(yīng)于 EP-A-0610048 的 JP-A-6-237789 ;相應(yīng)于EP-A-0610049 的 JP-A-6-284899 ;相應(yīng)于 US 5，508，181 的 JP-A-7-213296)。
然而，大多數(shù)已知的上述由相應(yīng)的a -羥基腈制備a _羥基酸的方法并不產(chǎn)生并以足夠高的濃度積聚產(chǎn)物，以滿足商業(yè)上的需要。經(jīng)常的結(jié)果是在反應(yīng)初期酶就失活。US5，756，306教導(dǎo)了“當(dāng)使用腈水解酶或腈水合酶酶促水解或水合a-羥基腈以產(chǎn)生羥基酸或a-羥基酰胺時(shí)，所出現(xiàn)的問題是在短時(shí)間內(nèi)酶失活。因此，難以以高濃度和高產(chǎn)率獲得a -羥基酸或a -羥基酰胺”(第I欄，第49-54行)。維持反應(yīng)混合物中醛濃度(由a-羥基腈解離為醛和氰化氫所形成的)和/或a-羥基腈濃度在規(guī)定的范圍內(nèi)是ー種避免該問題的方法。
US 5，508，181提出了涉及酶快速失活的更多困難。特別是，U. S. 5，508，181提及根據(jù)解離平衡，a-羥基腈化合物部分解離為相應(yīng)的醛。這些醛通過與蛋白結(jié)合，在短時(shí)間內(nèi)失活酶，因此很難由a-羥基腈以高產(chǎn)率獲得高濃度的a-羥基酸或a-羥基酰胺(第2欄，第16-29行)。阻止由于醛積聚所引起的酶失活的解決方案是將磷酸鹽或次磷酸鹽離子添加到反應(yīng)混合物中。US 5，326，702使用亞硫酸鹽、ニ亞硫酸鹽或連ニ亞硫酸鹽離子來(lái) 螯合醛并阻止酶失活。然而，即使通過使用上述這樣的添加剤，所產(chǎn)生和積聚的a-羥基酸的濃度仍然是不高的。
U. S. 6，037，155教導(dǎo)了 a -羥基酸產(chǎn)物的低積聚與由于解離的醛積聚所引起的短時(shí)間內(nèi)酶失活相關(guān)。這些發(fā)明人提出在水中a-羥基腈部分解離所產(chǎn)生的氰化氫(Agricultural Biological Chemistry, Vol. 46, pages 1165 (1982))以及相應(yīng)的醒或酮(Chemical Reviews, Vol. 42, pages 189 (1948))存在下，酶活性受抑制。本發(fā)明人通過使用微生物解決了醛誘導(dǎo)的酶失活問題，所述微生物酶活性能通過將氰化物添加到反應(yīng)混合物中而得到改善。氰化物的添加限制了 a-羥基腈解離為醛和氰化氫。
具體就こ醇酸生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，已知こ醇腈能可逆解離為氰化氫和甲醛，兩者都可失活酶活性。US 3，940，316描述了ー種由相應(yīng)的腈制備有機(jī)酸的方法，使用了具有“腈水解(nitrilasic) ”活性的細(xì)菌，并列出こ醇腈作為底物。具體來(lái)說(shuō)，該專利描述了對(duì)于該目的使用芽孢桿菌屬、無(wú)芽孢桿菌屬、微球菌屬和短桿菌屬細(xì)菌。雖然被描述具有腈水解活性，但是短桿菌R312 (Brevibacterium R312)是在US 3，940，316所有實(shí)施例中使用的唯一菌株。已知短桿菌R312具有腈水合酶和酰胺酶活性，但沒有腈水解酶活性(Toumeix等，Antonie van Leeuwenhoek, 52 :173-182(1986))。
一種通過利用屬于棒狀桿菌(Corynebacterium spp.)的微生物制備乳酸、こ醇酸和2-羥基異丁酸的方法披露于日本專利公開號(hào)昭61-56086中。JP 09028390披露了ー種通過紅球菌屬或戈登氏菌屬水解酶起作用，由こ醇腈制備こ醇酸的方法。報(bào)道了對(duì)こ醇酸的選擇性幾乎為100%，沒有こ醇酸酰胺生成。US 6，037，155披露了由a -羥基腈產(chǎn)生包括こ醇酸的a-羥基酸的方法的例子。該公開內(nèi)容承認(rèn)由于前述問題之故并非所有的微生物催化劑都能產(chǎn)生高濃度的こ醇酸，并教導(dǎo)應(yīng)當(dāng)進(jìn)行篩選研究以便發(fā)現(xiàn)在エ業(yè)上有益的微生物。US 6, 037, 155具體鑒定了抗a-輕基腈或a -輕基酸抑制效應(yīng)的Variovorax spp.和節(jié)桿菌(Arthrobacter spp.)微生物,具有持久的活性,并能在高濃度下產(chǎn)生期望的產(chǎn)物。
敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis) 72W(ATCC 55746)具有脂族腈水解酶(EC
3.5. 5. 7)活性，以及腈水合酶(EC 4. 2. I. 84)和酰胺酶(EC 3. 5. I. 4)活性組合的特征。US5，814，508披露了于35-70で，在適合的緩沖液中加熱敏捷食酸菌721(ム了0 55746)懸浮液一段短時(shí)間以鈍化全細(xì)胞催化劑不需要的腈水合酶和酰胺酶活性，不產(chǎn)生明顯減少的期望的腈水解酶活性。
已克隆并重組表達(dá)了編碼敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的基因((相應(yīng)于 US 6, 870, 038 的 W 01/75077)和 Chauhan 等，Appl Microbiol Biotechnol,61 118-122(2003))。敏捷食酸菌72W腈水解酶能以高產(chǎn)率將a-羥基腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的a-羥基羧酸(US 6，383，786)，包括こ醇酸(US 6，416，980)。然而，對(duì)于降低エ業(yè)生產(chǎn)成本，用于以高達(dá)100%轉(zhuǎn)化的高產(chǎn)率將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸的具有改善的腈水解酶活性的突變的腈水解酶應(yīng)當(dāng)是十分有用的。
ー種使用酶催化劑經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)こ醇酸的方法需要利用能以高濃度將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸，并具有高催化劑生產(chǎn)率(公斤こ醇酸/公斤酶催化劑)和容積生產(chǎn)率(こ醇酸克數(shù)/升/小時(shí))的催化劑。酶催化劑可用于多步連續(xù)分批反應(yīng)(multiple consecutivebatch reactions)中，或用于恒量添加こ醇腈并移除こ醇酸的連續(xù)反應(yīng)中；在任何ー種操作方式中，催化劑活性和壽命應(yīng)以致于獲得高容積生產(chǎn)率和催化劑生產(chǎn)率，并且在分批反應(yīng)情況下，催化劑應(yīng)當(dāng)在多個(gè)反應(yīng)循環(huán)中得到利用，而不在連續(xù)分批反應(yīng)之間明顯損失酶 活性。具有改善的用于こ醇腈水解的腈水解酶活性的突變的腈水解酶能提供改善的容積生產(chǎn)率。鑒于在こ醇腈反應(yīng)混合物中游離甲醛(以及可能的其他雜質(zhì))的失活效應(yīng)會(huì)不同程度地消極影響所有腈水解酶催化劑的事實(shí)，還需要在用于こ醇腈水解的反應(yīng)條件下穩(wěn)定酶活性的改善(產(chǎn)生相對(duì)增加的催化劑生產(chǎn)率)。
待解決的問題是提供ー種利用具有明顯改善的用于こ醇腈水解的腈水解酶活性的酶催化劑增加こ醇酸體積生產(chǎn)率的方法。待解決的額外問題是提供一種增加用于こ醇酸生產(chǎn)的酶催化劑生產(chǎn)率和穩(wěn)定性，由此降低酶催化劑成本和生產(chǎn)總成本的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了由こ醇腈酶促生產(chǎn)こ醇酸的方法。提供了一種由こ醇腈生產(chǎn)こ醇酸的方法，包括
a)將適合的含水反應(yīng)混合物中的こ醇腈與包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化劑接觸，所述多肽具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少ー個(gè)選自以下的氨基酸取代
(I)在氨基酸殘基第168位用賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸或纈氨酸取代；和
(2)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；
由此產(chǎn)生こ醇酸；和
b)以鹽或酸的形式回收(a)中產(chǎn)生的こ醇酸；其中當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸吋，相對(duì)于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化劑提供了至少I. 5倍腈水解酶活性的増加。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種編碼具有腈水解酶活性的多肽的分離的核酸分子，所述核酸分子編碼具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有至少ー個(gè)選自以下的氨基酸取代
a)在氨基酸殘基第168位用甲硫氨酸或蘇氨酸取代；和[0023]b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；
其中當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸時(shí)，相對(duì)于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少I. 5倍腈水解酶活性的増加。
在又一方面，提供了一種當(dāng)將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸時(shí)，顯示明顯改善的腈水解酶活性的分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少ー個(gè)選自以下的氨基酸取代
a)在氨基酸殘基第168位用甲硫氨酸或蘇氨酸取代；和
b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；其中當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸時(shí)，相對(duì)于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少I. 5倍腈水解酶活性的増加。
序列表和牛物學(xué)保藏簡(jiǎn)沭
以下序列描述和附于此的序列表符合37C. F. R. § I. 821-1. 825所列的指導(dǎo)專利申請(qǐng)中核苷酸和/或氨基酸序列披露的規(guī)定。序列描述包含符合Nucleic Acids Research13 :3021-3030(1985)和 Biochemical Journal 219 (No. 2) :345-373 (1984)(它們?cè)诖瞬⑷胱鳛閰⒖?中所述的IUPAC-IYUB標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的對(duì)于核苷酸序列字符的單字母編碼和對(duì)于氨基酸的三字母編碼。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式符合37C. F. R. § I. 822的規(guī)定。
SEQ ID NO :1是用于擴(kuò)增敏捷食酸菌72W腈水解酶編碼序列的引物165的核苷酸序列。隨后，將所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆入pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA ；GenBank L09137)以創(chuàng)建質(zhì)粒 pSWl38。
SEQ ID NO :2是用于擴(kuò)增敏捷食酸菌72W腈水解酶編碼序列的引物166的核苷酸序列。隨后，將所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆入pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA ；GenBank L09137)以創(chuàng)建質(zhì)粒 Pswi38。
SEQ ID NO :3是用于擴(kuò)增敏捷食酸菌72W腈水解酶的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO 4是用于擴(kuò)增敏捷食酸菌72W腈水解酶的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO :5是敏捷食酸菌72W腈水解酶編碼序列的核苷酸序列，包含由TTG至ATG的起始密碼子改變以利于在大腸桿菌中重組表達(dá)。
SEQ ID NO 6是推斷的由SEQ ID NO 5的核苷酸序列編碼的敏捷食酸菌72W腈水解酶的氨基酸序列，所述核苷酸序列包含由TTG至ATG的起始密碼子改變以利于在大腸桿菌中重組表達(dá)。
SEQ ID NO :7是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(L201Q ；Leu — GIn)。
SEQ ID NO :8是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 7)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個(gè)氨基酸取代(Leu201 — GIn)。
SEQ ID NO :9是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(L201A ；Leu — Ala)。
SEQ ID NO : 10是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 9)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個(gè)氨基酸取代(Leu201 — Ala)。
SEQ ID NO : 11是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(L201C ；Leu — Cys)。
SEQ ID NO: 12是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 11)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個(gè)氨基酸取代(Leu201 — Cys)。
SEQ ID NO : 13是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(L201T ；Leu — Thr)。
SEQ ID NO: 14是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 13)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個(gè)氨基酸取代(Leu201 — Thr)。
SEQ ID NO : 15是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序 列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(L201G ；Leu — Gly)。
SEQ ID NO: 16是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 15)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個(gè)氨基酸取代(Leu201 — Gly)。
SEQ ID NO : 17是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(L201H ；Leu — His)。
SEQ ID NO :18是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 17)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個(gè)氨基酸取代(Leu201 — His)。
SEQ ID NO :19是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(L201K ；Leu — Lys)。
SEQ ID NO :20是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 19)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個(gè)氨基酸取代(Leu201 — Lys)。
SEQ ID NO :21是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(L201N ；Leu — Asn)。
SEQ ID NO :22是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 21)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個(gè)氨基酸取代(Leu201 — Asn)。
SEQ ID NO :23是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(L201S ；Leu — Ser)。
SEQ ID NO :24是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 23)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個(gè)氨基酸取代(Leu201 — Ser)。
SEQ ID NO :25是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(F168K ；Phe — Lys)。
SEQ ID NO :26是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 25)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第168位包含單個(gè)氨基酸取代(Phe 168 — Lys)。
SEQ ID NO :27是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(F168M ；Phe — Met)。
SEQ ID NO :28是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 27)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第168位包含單個(gè)氨基酸取代(Phe 168 — Met)。
SEQ ID NO :29是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(F168T ；Phe — Thr)。[0060]SEQ ID NO :30是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 29)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第168位包含單個(gè)氨基酸取代(Phe 168 — Thr)。
SEQ ID NO :31是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(F168V ；Phe — Val)。
SEQ ID NO :32是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 31)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第168位包含單個(gè)氨基酸取代(Phe 168 — Val)。
SEQ ID NO :33是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(T210A ；Thr — Ala)。
SEQ ID NO :34是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 33)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第210位包含單個(gè)氨基酸取代(Thr210 — Ala)。
SEQ ID NO :35是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序 列，其在殘基第168位產(chǎn)生單個(gè)氨基酸取代(T210C ；Thr — Cys)。
SEQ ID NO :36是推斷的突變的腈水解酶(SEQ ID NO 35)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第210位包含單個(gè)氨基酸取代(Thr210 — Cys)。
SEQ ID NO 37 是在大腸桿菌 SS 1001 (ATCC PTA-1177 ；US6, 870，038，在此并入作為參考)中表達(dá)的敏捷食酸菌72W腈水解酶基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO :38是推斷的在大腸桿菌SS100UATCC PTA-1177)中表達(dá)的敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO 33)的氨基酸序列。
業(yè)已依據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約條款的規(guī)定進(jìn)行了以下生物學(xué)保藏
保藏人識(shí)別參考國(guó)際保藏編號(hào)保藏日
敏捷食酸菌72WATCC 557461996年3月8日
大腸桿菌 SS1001 ATCC PTA-1177 2000 年 I 月 I I 日
如本文所使用的，“ ATCC”指美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，位于ATCC，10801University Blvd. ,Manassas,VA 20110-2209，USA的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)。“國(guó)際保藏編號(hào)”是在ATCC保藏的培養(yǎng)物的保藏號(hào)。
所列的保藏物應(yīng)當(dāng)在所指明的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)保藏至少三十(30)年，并且公眾在得到披露其的專利授權(quán)之后可以獲得。保藏物的可利用性并不構(gòu)成對(duì)實(shí)施本發(fā)明的許可，這種實(shí)施會(huì)破壞通過政府行為授予的專利權(quán)。
具體實(shí)施方式
已通過提供了ー種利用具有改善的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體，以高產(chǎn)率及在高濃度下由相應(yīng)的こ醇腈制備こ醇酸的方法解決了所述問題。該解決所述問題的方法包括1)利用具有改善的腈水解酶活性和/或改善的用于將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸的催化劑生產(chǎn)率的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體，和2)在用于將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸的反應(yīng)條件下，改善催化劑穩(wěn)定性和/或生產(chǎn)率的方法。該在用于將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸的反應(yīng)條件下，改善催化劑穩(wěn)定性/生產(chǎn)率的方法，包括I)利用添加劑來(lái)穩(wěn)定酶催化劑活性，2)在基本上無(wú)氧的條件下運(yùn)行反應(yīng)，和3)控制こ醇腈到反應(yīng)混合物中的進(jìn)料速度，以便保持こ醇腈的目標(biāo)濃度。
定義
在本文中，使用了許多術(shù)語(yǔ)和縮寫。除非另作明確說(shuō)明，否則使用以下定義。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“包含”表示如權(quán)利要求
中所提及的規(guī)定的特征、整體、步驟或組分的存在，但其并不排除ー個(gè)或多個(gè)其他特征、整體、步驟、組分或它們的組的存在或添加。
如本文所使用的，修飾所使用的本發(fā)明成分或反應(yīng)物的數(shù)量的術(shù)語(yǔ)“約”指數(shù)量上的變化，所述變化可例如通過用于在真實(shí)世界中制備濃縮物或使用溶液的標(biāo)準(zhǔn)量度和液體處理工序；通過在這些エ序中的疏忽過失；通過用于制造組合物或執(zhí)行方法的產(chǎn)品、原料或配料純度的差異等產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“約”還包含由于由特定的初始混合物產(chǎn)生的組合物的不 同的平衡條件之故所相異的量。無(wú)論是否為術(shù)語(yǔ)“約”所修飾，權(quán)利要求
包括相等的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“約”表示在所報(bào)告的數(shù)值的10%之內(nèi)，優(yōu)選在所報(bào)告的數(shù)值的5%之內(nèi)。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“回收”表示分離、純化或轉(zhuǎn)移利用本發(fā)明方法所生成的產(chǎn)物。分離和純化來(lái)自反應(yīng)混合物的產(chǎn)物的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，可包括但不限于選擇性沉淀、結(jié)晶、過濾、反應(yīng)性溶劑萃取、離子交換、電滲析、聚合、蒸餾、熱分解、醇解以及它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“回收”還可包括將反應(yīng)混合物(通常在濾除酶催化劑之后)轉(zhuǎn)移到另ー種反應(yīng)中以產(chǎn)生ー種或多種額外的產(chǎn)物。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“酶催化劑”或“微生物細(xì)胞催化劑”指具有用于將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸和氨的腈水解酶活性特性的催化劑(即包含至少ー種具有腈水解酶活性的多肽)。酶催化劑可以完整的微生物細(xì)胞、透化處理的微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞提取物的ー種或多種細(xì)胞成分、部分純化的酶或純化的酶的形式存在。酶催化劑可以是游離的(未固定的)或固定在可溶性或不溶性支持物中或其上。如本文所使用的，“再循環(huán)的酶催化劑”指在分批反應(yīng)中被再生為酶催化劑的酶催化劑。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“催化劑生產(chǎn)率”和“酶催化劑生產(chǎn)率”指每克催化劑產(chǎn)生的產(chǎn)物總量。在本發(fā)明中，所述催化劑是腈水解酶(EC3. 5. 5. 7)，所產(chǎn)生的產(chǎn)物是こ醇酸和/或こ醇酸銨(取決于反應(yīng)的pH)。一般而言，在基本上pH中性的條件下進(jìn)行本發(fā)明方法，以便所產(chǎn)生的こ醇酸主要以こ醇酸相應(yīng)的鹽(即こ醇酸銨)的形式存在。一般來(lái)說(shuō)，在具有催化劑再循環(huán)的分批反應(yīng)中，隨每一次循環(huán)反應(yīng)催化劑活性而降低(酶失活)。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“敏捷食酸菌(Acidovorax facilis) ”和“敏捷食酸菌(A. facilis)”可交換地使用，井指保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(國(guó)際保藏機(jī)構(gòu))，具有保藏號(hào)55746( “ATCC 55746”)的敏捷食酸菌72W。
如本文所使用的,術(shù)語(yǔ)“大腸桿菌(Escherichia coli)”和“大腸桿菌(E. coli) ”可交換地使用。一些適合用于重組表達(dá)的大腸桿菌菌株描述于此，包括但不限于具有國(guó)際保藏編號(hào)ATCC 47076的大腸桿菌MG1655、具有國(guó)際保藏編號(hào)ATCC 53911的大腸桿菌FM5、具有國(guó)際保藏編號(hào)ATCC 27325的大腸桿菌W3110、具有國(guó)際保藏編號(hào)ATCC 35695的大腸桿菌MC4100和具有國(guó)際保藏編號(hào)ATCC 12435的大腸桿菌W1485。在一個(gè)實(shí)施方案中，適合的大腸桿菌菌株包括大腸桿菌FM5 (ATCC53911)和大腸桿菌MG1655 (ATCC 47076)。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“大腸桿菌SS1001”或“SS1001”指表達(dá)敏捷食酸菌72W腈水解酶的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株，具有ATCC登記號(hào)PTA-1177 (US 6，870, 038 ;其全文在此并入作為參考)。與野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NO :6)相比，重組表達(dá)的大腸桿菌SS1001腈水解酶(SEQ ID NO 38)含有2個(gè)小的序列改變。起始密碼子由GTG變?yōu)锳TG以利于重組表達(dá)，并在克隆過程中導(dǎo)入在C-末端附近引起單個(gè)氨基酸改變(Pro367[CCA] — Ser[TCA])的人工序列。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“乙醇腈”縮寫為“GLN”，并且與羥基乙腈、2-羥基乙腈、羥基甲腈以及CAS登記號(hào)107-16-4的所有其他異名同義。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“乙醇酸”縮寫為“GLA”，并且與羥基乙酸(hydroxyaceticacid)、輕基醋酸(hydroxyethanoic acid)以及CAS登記號(hào)79_14_1的所有其他異名同義。經(jīng)本發(fā)明方法產(chǎn)生的乙醇酸可以質(zhì)子化的羧酸和/或相應(yīng)的銨鹽的形式存在。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“乙醇酸銨”縮寫為“NH4GLA”。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“乙交酯”指CAS登記號(hào)502-97-6的化合物。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“適合的含水乙醇腈反應(yīng)混合物”和“適合的含水反應(yīng)混合物，，指其中乙醇腈和酶催化劑得到接觸的物質(zhì)和水。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“腈水解酶催化劑”指具有腈水解酶活性(EC3. 5. 5. 7)特性的酶催化劑。腈水解酶直接將脂族腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸，不形成作為中間體的相應(yīng)的酰胺(方程式I)。
方程式I.


O
腈水解酶 /I HO-CH2—CN -^ HO-CH2—C、+ NH3
H2OOH
如本文所使用的,術(shù)語(yǔ)“改良的腈水解酶”、“腈水解酶突變體”、“敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體”和“蛋白質(zhì)工程的腈水解酶”可交換地使用來(lái)指在相同的反應(yīng)條件下，與敏捷食酸菌72W腈水解酶的活性相比，具有明顯改善的將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸的腈水解酶活性的本發(fā)明的腈水解酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)重組表達(dá)(使用相同的表達(dá)系統(tǒng))并在基本上相同的反應(yīng)條件下測(cè)定時(shí)，可通過比較本發(fā)明突變的腈水解酶催化劑與天然的敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，測(cè)定腈水解酶活性的改善。SDS-PAGE分析顯示本發(fā)明突變體及其相應(yīng)的對(duì)照(SEQ ID N06)之間的蛋白表達(dá)水平是基本上相的敏感的。同樣地，認(rèn)為腈水解酶活性的改善是天然敏捷食酸菌72W腈水解酶結(jié)構(gòu)修飾的結(jié)果。
術(shù)語(yǔ)“腈水解酶活性”指當(dāng)將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸(或相應(yīng)的乙醇酸銨)時(shí)，每單位質(zhì)量(例如毫克)蛋白、細(xì)胞干重或珠子重量(固定的催化劑)的酶活性。比較測(cè)量的腈水解酶活性，與細(xì)胞干重或珠子重量成正比。由于使用SDS-PAGE凝膠的激光光密度分析，在量上難以區(qū)分在敏捷食酸菌72W對(duì)照(SEQ ID NO 6)和改良的突變體之間的腈水解酶表達(dá)水平，因此相對(duì)于細(xì)胞干重(dew)或珠子重量(bw)，比較并測(cè)量報(bào)道的改善的腈水解酶活性。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“一單位酶活性”或“一單位腈水解酶活性”或“U”規(guī)定為在規(guī)定溫度(如25°c )下，每分鐘產(chǎn)生I μ mo I乙醇酸產(chǎn)物需要的酶活性的量(GLA U/g細(xì)胞干重或珠子重量)。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“相對(duì)的腈水解酶活性”、“改善的腈水解酶活性”和“在腈水解酶活性方面相対的改善”指表示為參照(對(duì)照)腈水解酶活性的倍數(shù)(或分?jǐn)?shù))的腈水解酶活性。相對(duì)于使用天然敏捷食酸菌72W腈水解酶所觀察到的腈水解酶活性，本發(fā)明突變的腈水解酶顯示明顯改善的腈水解酶活性。在本發(fā)明中，相對(duì)腈水解酶活性的“明顯改善”是在相同的反應(yīng)條件下，與對(duì)照(敏捷食酸菌72W腈水解酶；SEQ ID N06)的腈水解酶活性相比，至少I. 5倍更高的腈水解酶活性的改善。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，在相同的反應(yīng)條件下，與対照的腈水解酶活性相比，所述改善是至少2倍更高的腈水解酶活性。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，在相同的反應(yīng)條件下，與対照的腈水解 酶活性相比，所述改善是至少4倍更高的腈水解酶活性。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“初始反應(yīng)速率”在規(guī)定的反應(yīng)條件下，こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸的速率的大小，其中剛ー添加乙醇腈到反應(yīng)混合物中，就產(chǎn)生的反應(yīng)速率的大小，其中在反應(yīng)過程中こ醇腈濃度保持在高于約50毫摩(mM)的一段時(shí)間內(nèi)測(cè)定反應(yīng)速率。根據(jù)每單位時(shí)間產(chǎn)生的こ醇酸濃度(如摩爾こ醇酸/升/分鐘或毫摩こ醇酸/小吋)的改變測(cè)定反應(yīng)速率。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“重組生物”、“轉(zhuǎn)化宿主”、“轉(zhuǎn)化體”、“轉(zhuǎn)基因生物”和“轉(zhuǎn)化的微生物宿主”指已用異源或外源DNA轉(zhuǎn)化的宿主生物。本發(fā)明的重組生物表達(dá)編碼活性腈水解酶的外源編碼序列或基因。“轉(zhuǎn)化”指DNA片段轉(zhuǎn)移入宿主生物中。所述轉(zhuǎn)移的DNA片段可在染色體或染色體外摻入(即通過載體)宿主生物中。如本文所使用的，“轉(zhuǎn)化盒”指含有一組便于準(zhǔn)備插入宿主細(xì)胞中的遺傳元件的DNA特定片段，通常作為質(zhì)粒的一部分。如本文所使用的，“表達(dá)盒”指含有一組便于準(zhǔn)備插入宿主細(xì)胞中的遺傳元件的DNA特定片段，通常作為質(zhì)粒的一部分，還供在宿主中增強(qiáng)基因表達(dá)之用。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸片段”和“核酸分子”指可編碼完整基因、編碼序列和/或編碼序列前(5'，上游)或后(3'，下游)的調(diào)節(jié)序列的DNA分子。在一方面，本發(fā)明的核酸分子編碼具有腈水解酶活性的多肽。
如本文所使用的，“基因”指表達(dá)特定蛋白的核酸分子。如本文所使用的，其可以或不必包括編碼序列前的調(diào)節(jié)序列(5'非編碼序列)和編碼序列后的調(diào)節(jié)序列(3'非編碼序列)?！疤烊换颉敝冈谧匀唤缰邪l(fā)現(xiàn)的帶有其自身調(diào)節(jié)序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在自然界中不同時(shí)出現(xiàn)的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。因此，嵌合基因可以包含來(lái)源于不同來(lái)源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或來(lái)源于相同來(lái)源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，但排列方式與天然排列方式不同?！皟?nèi)源基因”指位于生物的基因組中的天然位點(diǎn)上的天然基因。“外源基因”指正常情況下不存在于宿主生物中的基因，但是所述基因是通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入宿主生物中的。外源基因可包含插入非天然生物中的天然基因或嵌合基因。“轉(zhuǎn)基因”是已通過轉(zhuǎn)化操作導(dǎo)入基因組的基因。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“編碼序列”指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。如本文所使用的，“適合的調(diào)節(jié)序列”指影響轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或相關(guān)編碼序列的翻譯并位于編碼序列的上游(5'非編碼序列)、之中或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識(shí)別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)子結(jié)合位點(diǎn)和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。[0101]“啟動(dòng)子”指能控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的DNA序列。一般而言，編碼序列位于啟動(dòng)子序列的3'。啟動(dòng)子可以完全來(lái)源于天然基因、或由來(lái)源于天然存在的不同啟動(dòng)子的不同元件組成，或甚至包含合成的DNA區(qū)段。能使基因在大部分細(xì)胞類型中在大多數(shù)時(shí)間下或在大多數(shù)的環(huán)境條件下表達(dá)的啟動(dòng)子，通常稱為“組成型啟動(dòng)子”。能使基因僅在特定化合物或環(huán)境條件存在下表達(dá)的啟動(dòng)子，通常稱為“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”。由于在大多數(shù)情況下，調(diào)節(jié)序列的確切邊界還未完全確定，因此不同長(zhǎng)度的DNA片段可以具有相同的啟動(dòng)子活性。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指核酸序列在單一核酸分子上的結(jié)合，使得一條序列的功能受另一條影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能影響編碼序列表達(dá)時(shí)，其就是與編碼序列可操作地連接的(即編碼序列受啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制)。編碼序列可沿有義或反義方向可操作地與調(diào)節(jié)序列連接。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“3'非編碼序列”指位于編碼序列下游并包括多腺苷酸化識(shí)別序列(通常限于真核生物)和其他編碼能影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)的序
列的DNA序列。多腺苷酸化信號(hào)(通常限于真核生物)一般特點(diǎn)在于影響多聚腺苷酸束添加到mRNA前體的Y末端上。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)充分意識(shí)到，在使用核苷酸密碼子來(lái)表示所給定的氨基酸中，特定宿主細(xì)胞具有“密碼子偏倚”。因此，當(dāng)合成用于改善在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的基因時(shí)，期望設(shè)計(jì)能使其密碼子使用反映優(yōu)選的宿主細(xì)胞密碼子偏倚的基因。對(duì)其中序列信息可得到的來(lái)源于宿主細(xì)胞的基因的調(diào)查，可以確定其的密碼子偏倚。密碼子優(yōu)化是本領(lǐng)域眾所周知的，且已被描述用于不同的系統(tǒng)，包括但不限于酵母(Outchkourov等，Protein Expr Purif, 24 (I) :18-24(2002))和大腸桿菌(Feng 等,Biochemistry, 39 (50)15399-15409(2000))ο
敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶
敏捷食酸菌72W腈水解酶(EC 3.5.5. I)是一種用于由脂肪族或芳香族腈產(chǎn)生羧酸的穩(wěn)定催化劑(wo 01/75077 ；US 6，870，038和Chauhan等，(同上))。還已顯示能催化α -羥基腈(即乙醇腈)轉(zhuǎn)化為α -羥基羧酸(即乙醇酸)(見US 6，383，786和US6，416，980 ;它們的全文在此并入作為參考)。
所有已知的腈水解酶，包括敏捷食酸菌72W腈水解酶，在酶活性中心中都具有親核的半胱氨酸(Cowan等,Extremophiles，2 :207-216(1998) ；Pace, H.和Brenner, C, GenomeBiology, 2 (I) reviews 1-9(2001);和 Chauhan 等，同上)且都易受硫醇試劑(I. OmM 濃度的氯化銅、硝酸銀、乙酸汞或氯化鐵，每一種都引起敏捷食酸菌72W腈水解酶酶活性大幅降低)影響而失活。半胱氨酸殘基也能被不可逆地氧化為亞磺酸，導(dǎo)致酶活性損失。盡管腈水解酶對(duì)多種失活機(jī)制敏感，但是固定的敏捷食酸菌72W細(xì)胞是穩(wěn)定的，在多次再循環(huán)反應(yīng)后能保持其大部分腈水解酶活性(US 6，870, 038)。
已報(bào)道了敏捷食酸菌72W腈水解酶與其他細(xì)菌腈水解酶的序列比較(US6，870, 038 ；Chauhan等，同上)。該72W腈水解酶具有幾個(gè)保守的特征結(jié)構(gòu)域,包括鄰近氨基末端的16-氨基酸區(qū)(SEQ ID NO 6的氨基酸殘基40-55)和含有必需半胱氨酸殘基的催化區(qū)(SEQ ID NO 6的氨基酸殘基160-173)。該半胱氨酸殘基(SEQ ID NO 6的Cysl64)與保守的谷氨酸(SEQ ID NO 6的Glu48)以及賴氨酸殘基(SEQ ID NO 6的Lys 130) 一起形成見于所有腈水解酶中的催化三聯(lián)體基序(Pace，H.，和Brenner，C，同上)。盡管在所報(bào)道的腈水解酶之中某些結(jié)構(gòu)相似性是保守的，但是底物特異性變化很大(O' Reilly,C.和Turner, P.，J Appl Microbiol,95 :1161-1174(2003))。
突變的腈水解_特性
之前已報(bào)道了ー些來(lái)源于敏捷食酸菌72W腈水解酶的突變的腈水解酶(US10/919182 ;在此并入作為參考)。在US 10/919182中，為了將3-羥基腈(即3-羥基丁腈和3-羥基戊腈)轉(zhuǎn)化為3-羥基酸的腈水解酶活性的相對(duì)改善(相對(duì)于重組表達(dá)的、天然的72W腈水解酶的活性)，選擇并篩選各種突變的腈水解酶。
US 10/919182中所述的腈水解酶突變體使用的表達(dá)系統(tǒng)是基于質(zhì)粒pTrcHis2-TOPO 和大腸桿菌宿主T0P10 (兩者都來(lái)自于 Invitrogen，La JoIIa, CA)的。使用實(shí)施例12所述的方法，在相同的表達(dá)系統(tǒng)中比較腈水解酶突變體F168L(SEQ ID NO 6 中第168位殘基由Phe變?yōu)長(zhǎng)eu)、F168V (第168位殘基由Phe變?yōu)閂aI ；SEQ ID NO :32)、F168K (第168位殘基由Phe變?yōu)長(zhǎng)ys ;SEQ ID NO :26)、T210A(第210位殘基由Thr變?yōu)锳la; SEQ ID NO 34)和 T210C (第 210 位殘基由 Thr 變?yōu)?Cys ;SEQ ID NO :36)與天然的酶(“對(duì)照” ；SEQ ID NO 6)的活性。當(dāng)將GLN轉(zhuǎn)化為GLA時(shí)，突變體F168L、T210A和T210C最初被鑒定可能具有明顯改善的腈水解酶活性，但是隨后發(fā)現(xiàn)它們與72W腈水解酶對(duì)照具有類似的腈水解酶活性。出乎意料地，當(dāng)將こ醇腈(ー種2-羥基腈)轉(zhuǎn)化為こ醇酸吋，US10/919182 中所述的兩種突變的腈水解酶(F168K，Phel68 —Lys ;F168V，Phel68 — VaI)(在此分別由SEQ ID NOs :26和32表示)也顯示明顯改善的腈水解酶活性。然而，當(dāng)將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸吋，US 10/919182中所述的其他突變的腈水解酶(如T210A，SEQ ID NO 34 ；T210C, SEQ ID NO 36)并沒有顯示明顯改善的腈水解酶活性。
如本申請(qǐng)實(shí)施例所述，易錯(cuò)PCR和定向飽和誘變用于隨機(jī)突變天然的72W腈水解酶編碼序列(SEQ ID N0:5)。導(dǎo)致在氨基酸殘基第168位(在野生型序列中為苯丙氨酸)和第201位(在野生型序列中為亮氨酸)的氨基酸取代的突變似乎明顯增加了腈水解酶活性。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸殘基位置”指在相對(duì)于由N-末端甲硫氨酸殘基起算的參照序列(SEQ ID NO 6)的特定位置上所見的氨基酸。進(jìn)行定向飽和誘變以評(píng)估在兩個(gè)殘基位置(168和210)上的所有氨基酸取代。鑒定了ー些具有明顯改善的將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸(如在本發(fā)明的反應(yīng)條件下，以こ醇酸銨鹽的形式存在)的腈水解酶活性的額外的突變體。相對(duì)于敏捷食酸菌72W腈水解酶序列(SEQ ID NO :6)，本發(fā)明突變的腈水解酶包含至少ー個(gè)氨基酸取代。同樣地，每ー個(gè)本發(fā)明突變的腈水解酶的氨基酸序列具有帶有至少ー個(gè)如本文所述的氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO :6(參照序列)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明方法的突變的腈水解酶包含編碼具有SEQ IDNO 6的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列帶有至少ー個(gè)選自以下的氨基酸取代
a)在氨基酸殘基第168位用賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸或纈氨酸取代；和
b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；其中當(dāng)將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸時(shí)，所述多肽提供了至少I. 5倍的腈水解酶活性改善。
在另ー個(gè)實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明方法的突變的腈水解酶具有選自SEQ IDNOs :8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32的氨基酸序列。在又一個(gè)實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明方法的突變的腈水解酶具有選自SEQ ID NOs :7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31的核苷酸序列。
在一方面，本發(fā)明 包括編碼具有腈水解酶活性的多肽的分離的核酸分子，所述多肽具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一個(gè)選自以下的氨基酸取代
a)在氨基酸殘基第168位用甲硫氨酸或蘇氨酸取代；和
b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；其中當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時(shí)，相對(duì)于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少I. 5倍的腈水解酶活性的增加。
在另一方面，本發(fā)明包括編碼具有選自SEQ ID NOs :8、10、12、14、16、18、20、22、24、28和30的氨基酸序列的多肽的分離的核酸分子。在又一方面，本發(fā)明包括具有選自SEQID NOs :7、9、11、13、15、17、19、21、23、27和29的核酸序列的分離的核酸分子。
在一方面，本發(fā)明包括具有腈水解酶活性的分離的多肽，所述多肽具有SEQ IDNO 6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一個(gè)選自以下的氨基酸取代
a)在氨基酸殘基第168位用甲硫氨酸或蘇氨酸取代；和
b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；其中當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時(shí)，相對(duì)于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少I. 5倍的腈水解酶活性的增加。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有腈水解酶活性的多肽，所述多肽具有選自SEQ ID NOs :8、10、12、14、16、18、20、22、24、28 和 30 的氨基酸序列。
通過將所測(cè)定的活性單位(U)除以催化劑重量計(jì)算腈水解酶活性?？筛鶕?jù)純化的蛋白質(zhì)重量、細(xì)胞濕量、細(xì)胞干重或固定的催化劑(即使用角叉菜膠和/或GA/PEI-交聯(lián)的催化劑/藻酸鹽珠子)的重量測(cè)定催化劑重量。在本發(fā)明中，腈水解酶活性記錄為每克細(xì)胞干重的活性單位(U/gDCW)或每克催化劑珠子的活性單位(比較固定的催化劑)。就基于細(xì)胞干重作為單位催化劑重量的腈水解酶活性比較，應(yīng)當(dāng)考慮腈水解酶蛋白產(chǎn)生的水平。測(cè)定不同轉(zhuǎn)化體及它們各自對(duì)照之間的腈水解酶的表達(dá)水平，并觀察到是基本上相同的(即當(dāng)在相同的遺傳背景中比較時(shí))。因此。對(duì)于不同的突變體而言，所報(bào)道的腈水解酶活性的改善歸因于酶結(jié)構(gòu)上的改變。
在相同的載體背景(pTrcHis2-TOPO 或Puci9)和宿主大腸桿T0P10 (Invitrogen)、大腸桿菌 FM5(ATCC 53911)或大腸桿菌 MG1655 (ATCC 47076)中表達(dá)突變的腈水解酶(以及敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶對(duì)照)的編碼序列。相對(duì)的改善是基于與使用相同的載體和宿主背景的適當(dāng)?shù)膶?duì)照比較的。SDS-PAGE分析(如使用激光光密度分析定量)證明了在每種突變體(和對(duì)照)中腈水解酶蛋白表達(dá)水平基本上相同(如由于使用相同的表達(dá)系統(tǒng)和宿主所預(yù)期的)。相對(duì)酶活性被記錄為對(duì)不同突變的催化劑所測(cè)定的腈水解酶活性相對(duì)于在表達(dá)敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID N06)的各自的大腸桿菌對(duì)照轉(zhuǎn)化體中所測(cè)定的腈水解酶活性的倍數(shù)增加。[0127]對(duì)于未固定的催化劑，通過測(cè)定每克細(xì)胞干重在25°C下將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸的轉(zhuǎn)化率(ymol GLA/min)，確定突變的腈水解酶的腈水解酶活性(U/g細(xì)胞干重)。對(duì)于固定的催化劑比較，通過在25°C下測(cè)定こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸的轉(zhuǎn)化率Omol GLA/min)來(lái)確定活性，并記錄為每克固定的細(xì)胞催化劑珠子的腈水解酶活性単位(U/g珠子)。一単位的腈水解酶活性(U)相當(dāng)于在25°C下毎分鐘產(chǎn)生I微摩爾こ醇酸mol GLA/min)。
對(duì)于特定的突變的腈水解酶，使用下列格式之一，關(guān)于敏捷食酸菌72W氨基酸序列(SEQ ID NO :6)，DNA編碼區(qū)中的點(diǎn)取代突變以及所得到的氨基酸改變得到了詳細(xì)說(shuō)明
I.擴(kuò)展格式提供了 SEQ ID NO :6中野生型氨基酸(使用標(biāo)準(zhǔn)的3-字母縮寫)和相應(yīng)的氨基酸殘基位置，之后是在相同的殘基位置處見于突變體中的新氨基酸，例如。“Phel68改變?yōu)長(zhǎng)ys”或“Phel68 — Lys”描述了ー種在SEQ ID NO 6中氨基酸殘基第168位處作為突變的結(jié)果——苯丙氨酸被改變?yōu)橘嚢彼岬耐蛔儭?br>2.簡(jiǎn)寫形式野牛型氨基酸(表示為標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫)之后是SEQ ID N0:6的 氨基酸殘基位置，再后是突變的氨基酸(也表示為標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫)。例如，“ F168K”描述了ー種在SEQ ID NO :6中氨基酸殘基第168位處作為突變的結(jié)果——苯丙氨酸被改變?yōu)橘嚢彼岬耐蛔儭?br>使用腈水解_催化劑將こ醇腈水解為こ醇酸
通過將酶催化劑與包含こ醇腈的含水反應(yīng)混合物接觸進(jìn)行水解反應(yīng)。完整的重組微生物細(xì)胞(表達(dá)本發(fā)明的突變的腈水解酶)可用作為酶催化劑而無(wú)需任何預(yù)處理。微生物細(xì)胞催化劑可直接添加到反應(yīng)混合物中，或使用中空纖維膜柱體或超濾膜保持與主體反應(yīng)混合物分離。或者，微生物細(xì)胞可固定在聚合物基質(zhì)(如角叉菜膠或聚丙烯酰胺(PAG)顆粒)中或固定在不溶性支持物(如硅藻土)上以便于酶催化劑回收和再生(US6，870，038)。純化或部分純化的酶也可分離自全細(xì)胞并直接用作為催化劑，或所述酶可固定在聚合物基質(zhì)中或固定在不溶性支持物上。固定細(xì)胞或分離的酶的方法已得到廣泛地報(bào)道并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(Methods in Biotechnology,Vol. I :Immobilization of Enzymesand Cells ；Gordon F. Bickerstaff,編；Humana Press, Totowa, NJ, USA ；1997)。之前已報(bào)道了敏捷食酸菌72W腈水解酶催化劑的固定(US 6，870，038)。
含水反應(yīng)混合物中酶催化劑的濃度取決于酶催化劑的特定活性，并可選擇以獲得期望的反應(yīng)速率。在水解反應(yīng)中用作為催化劑的微生物細(xì)胞的細(xì)胞濕重通常為0. OOlg-O. 250g濕細(xì)胞/mL總反應(yīng)體積，優(yōu)選0. 002g-0. 050g濕細(xì)胞/mL。
選擇水解反應(yīng)的溫度以控制反應(yīng)速率和酶催化劑活性的穩(wěn)定性。反應(yīng)溫度可在僅僅高于反應(yīng)混合物凝固點(diǎn)(大約0°c )至約65°C的范圍內(nèi)；優(yōu)選反應(yīng)溫度在約5°C至約350C。可通過將細(xì)胞懸浮于蒸餾水中，或懸浮于可保持反應(yīng)初始pH在約5. 0和約10. 0之間、優(yōu)選在約5. 5和約8. 0之間、更優(yōu)選在約5. 5和約7. 7之間以及最優(yōu)選約6. 0至約7. 7的緩沖水溶液中制備微生物細(xì)胞催化劑懸浮液。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行之吋，由于由相應(yīng)的腈官能團(tuán)形成羧酸銨鹽，可改變反應(yīng)混合物的pH。所述反應(yīng)可運(yùn)行直至完全轉(zhuǎn)化こ醇腈，無(wú)需pH控制，或在整個(gè)反應(yīng)過程中可添加適合的酸或堿以保持期望的pH。
發(fā)現(xiàn)在25°C下こ醇腈能與所有比例的水完全混溶。在其中選擇反應(yīng)條件使得水相中底物(即a-輕基腈)的溶解性也取決于溶液溫度和/或鹽濃度(緩沖液或產(chǎn)物こ醇酸銨鹽，也稱為こ醇酸銨)情況下，反應(yīng)混合物起初可由兩相組成含有酶催化劑和溶解的α-羥基腈的水相以及有機(jī)相(不溶解的α-羥基腈)。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，α -羥基腈溶解于水相中，并最終獲得單相產(chǎn)物混合物。還可通過以大約等于酶促水解反應(yīng)速率的速率添加α -羥基腈到反應(yīng)混合物中運(yùn)行反應(yīng)，由此保持單相含水反應(yīng)混合物，并避免在高的起始物料濃度下，潛在的酶底物抑制的問題。
乙醇酸可作為質(zhì)子化的羧酸和/或其相應(yīng)的銨鹽(取決于產(chǎn)物混合物的pH)的混合物存在于產(chǎn)物混合物中，并可額外地作為羧酸鹽與任何能額外地存在于產(chǎn)物混合物中的緩沖液存在于產(chǎn)物混合物中。視所需，乙醇酸產(chǎn)物可作為質(zhì)子化的羧酸或羧酸鹽分離自反應(yīng)混合物。
在乙醇腈完全轉(zhuǎn)化下，產(chǎn)物混合物中的乙醇酸的終濃度可在O. OOlM至乙醇酸產(chǎn)物的溶解度極限。在一個(gè)實(shí)施方案中，乙醇酸的濃度會(huì)約O. IOM至約9. 0M。在另一個(gè)實(shí)施方案中，乙醇酸的濃度在約O. 2M至約4. OM0通過用諸如的濃鹽酸或濃硫酸的適合的無(wú)機(jī)酸調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的PH為約I. O至約3. 0，并用適合的有機(jī)溶劑萃取乙醇酸，可從產(chǎn)物混合物 (在除去催化劑后)中分離乙醇酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述適合的有機(jī)溶劑是Alamine 336( —種三烷基叔胺，其中烷基長(zhǎng)度為C8-Cltl ；Cognis Corp. ,Cincinnati,OH)與一種或多種稀釋劑的混合物，所述稀釋劑選自甲基異丁基酮、I-辛醇、I-癸醇、甲苯、二甲苯(混合的)、煤油、甲基叔丁基醚和二氯甲烷(見共同未決的US臨時(shí)專利申請(qǐng)60/638128 ;在此并入作為參考)?？衫盟畯挠袡C(jī)溶劑中反萃取乙醇酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用氯化鈉飽和有機(jī)溶劑，并將有機(jī)溶劑與適合的干燥劑(如硫酸鎂)接觸，過濾并除去溶劑(如通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))以高產(chǎn)率和高純度(通常98-99%純)產(chǎn)生期望的產(chǎn)物。視所需，可通過重結(jié)晶或蒸餾進(jìn)一步純化產(chǎn)物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可利用直接脫氨和/或其他純化方法從乙醇酸銨中直接分離乙醇酸，所述其他純化方法包括但不限于濃縮、結(jié)晶、反應(yīng)性溶劑萃取、離子交換、電滲析、糖醇解、聚合、蒸餾、熱分解(鹽裂化)、醇解以及它們的組合(見共同未決的US臨時(shí)專利申請(qǐng)60/638148和60/638126 ;每一申請(qǐng)全文在此并入作為參考)。
微牛物表汰
可在異源宿主細(xì)胞中，優(yōu)選在微生物宿主中產(chǎn)生本發(fā)明的腈水解酶突變體。在本發(fā)明中特別有用的是易于適應(yīng)大規(guī)模發(fā)酵法的細(xì)胞。這樣的生物體是工業(yè)生物工藝領(lǐng)域眾所周知的，其例子可見 Recombinant Microbes for Industrial and ARriculturalApplications. Murooka 等，編，Marcel Dekker, Inc. ,New York,NY(1994),并包括發(fā)酵細(xì)菌以及酵母和絲狀真菌。宿主細(xì)胞可包括但不限于叢毛單胞菌(Comamonas sp.)、棒狀桿菌(Corynebacterium sp.)、短桿菌(Brevibacterium sp.)、紅球菌(Rhodococcus sp·)、固氮菌(Azotobacter sp.)、朽1 樣酸桿菌(Citrobacter sp.)、腸桿菌(Enterobacter sp.)、梭狀芽抱桿菌(Clostridium sp.)、克雷白氏桿菌(Klebsiella sp.)、沙門氏菌(Salmonellasp.)、乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、糖酵母(Saccharomycessp.)、接合酵母(Zygosaccharomyces sp.)、畢赤酵母(Pichia sp.)、克魯維酵母(Kluyveromyces sp.)、假絲酵母(Candida sp.)、漢森氏酵母(Hansenula sp.)、杜氏藻(Dunaliella sp·)、德巴利氏酵母(Debaryomyces sp·)、毛霉菌(Mucor sp·)、球擬酵母(Torulopsis sp·)、甲基桿菌(Methylobacteria sp·)、芽抱桿菌(Bacillus sp·)、埃希氏桿菌(Escherichia sp.)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)、根瘤菌(Rhizobium sp.)和鏈霉菌(Streptomyces sp.)。特別優(yōu)選的是大腸桿菌。其中突變的腈水解酶基因可被表達(dá)的適合的大腸桿菌宿主細(xì)胞的例子包括，但不限于在此列舉的宿主細(xì)胞以及MG1655 (ATCC47076)、FM5 (ATCC 53911)、W3110 (ATCC 27325)、MC4100 (ATCC35695)、W1485 (ATCC 12435)及它們的衍生物。在另一方面，優(yōu)選的大腸桿菌宿主菌株是MG1655(ATCC 47076)或FM5 (ATCC53911)。
先前已報(bào)道了敏捷食酸菌72W腈水解酶的異源表達(dá)(Chauhan等，同上和US6，870，038)。Chauhan等報(bào)道了一種表達(dá)活性敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO 38)的大腸桿菌菌株(大腸桿菌SS 1001 (ATCCPTA-1177))。與野生型72W腈水解酶序列(SEQ IDNOs 5和6)相比，該重組表達(dá)的(大腸桿菌SS1001)腈水解酶的編碼序列含有2個(gè)小的序列改變。起始密碼子由GTG改變?yōu)锳TG以利于重組表達(dá)，并且在克隆過程中導(dǎo)入引起鄰近C-末端的單個(gè)氨基酸改變的人工序列(Pro367[CCA] — Ser [TCA])。
在エ業(yè)上適合的宿主中進(jìn)行重組表達(dá)具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，與由大多數(shù)獲得目的 基因的微生物可得到的遺傳工具相比，對(duì)于大多數(shù)常用的生產(chǎn)宿主，其遺傳工具箱通常得到充分的開發(fā)。與在天然宿主中表達(dá)相比，在這些宿主中重組表達(dá)一般更具成本效率。例如，業(yè)已顯示當(dāng)通過發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，敏捷食酸菌72W細(xì)胞得在甘油——ー種相當(dāng)昂貴的碳底物上生長(zhǎng)，而使用便宜的葡萄糖卻無(wú)法成功地生長(zhǎng)。與此相反，與敏捷食酸菌72W細(xì)胞相比，在約一半時(shí)間內(nèi)，大腸桿菌轉(zhuǎn)化體就可在葡萄糖上生長(zhǎng)至相同的細(xì)胞密度，明顯地降低了生物催化劑生產(chǎn)成本(US6，870, 038)。
含有指導(dǎo)高水平外源蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的微生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。這些可用于構(gòu)建用來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明突變的腈水解酶的基因產(chǎn)物的嵌合基因。然后，通過轉(zhuǎn)化可將這些嵌合基因?qū)脒m當(dāng)?shù)奈⑸镏?，以提供高水平的突變的腈水解酶表達(dá)。本發(fā)明的核酸分子被用來(lái)產(chǎn)生具有相對(duì)于天然的敏捷食酸菌72W腈水解酶增加的或改變的腈水解酶活性水平的基因產(chǎn)物。在一方面，本發(fā)明突變的基因所編碼的多肽提供了至少I. 5倍的將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸的腈水解酶活性的改善(與SEQ ID NO 6所示的敏捷食酸菌72W腈水解酶的活性相比)。
在改變宿主細(xì)胞的特性上嵌合基因應(yīng)當(dāng)是有效的。例如，在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下，將至少一個(gè)編碼本發(fā)明的腈水解酶的嵌合基因拷貝導(dǎo)入宿主細(xì)胞，賦予了該宿主細(xì)胞改善的將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸的能力。本發(fā)明的嵌合基因應(yīng)包含適合的用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明突變的腈水解酶序列基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列可包括，但不限于啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。如果這些序列來(lái)源于宿主生物體，則是優(yōu)選的；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到也可以使用異源調(diào)節(jié)序列。
通過將嵌合基因克隆入適合的表達(dá)載體中，其可被導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗髦?。用于轉(zhuǎn)化適合的宿主細(xì)胞的載體或表達(dá)盒是本領(lǐng)域眾所周知的。一般來(lái)說(shuō)，所述載體或表達(dá)盒含有指導(dǎo)有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、可選擇的標(biāo)記以及容許自主復(fù)制或染色體整合的序列。適合的載體包含具有轉(zhuǎn)錄起始控制的編碼序列的5'區(qū)和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段的3'區(qū)。盡管這樣的控制區(qū)無(wú)需來(lái)源于選擇作為生產(chǎn)宿主的特定物種自身的基因，但是當(dāng)這兩個(gè)控制區(qū)都來(lái)源干與宿主細(xì)胞同源的基因吋，則是最優(yōu)選的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)序列應(yīng)包括啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是組成型或誘導(dǎo)型的。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子一般響應(yīng)于特定的刺激(如IPTG或乳糖誘導(dǎo)的Iac啟動(dòng)子)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以響應(yīng)于多種刺激，包括化學(xué)藥品、生長(zhǎng)周期、溫度改變、PH改變和摩爾滲透壓濃度改變，不一一例舉。
用于在期望的宿主細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)本發(fā)明突變的腈水解酶表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動(dòng)子為數(shù)眾多，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉，包括但不限于CYC1、HIS3、GALU GALlO, ADHUPGK、PH05、GAPDH、ADCl、TRPl、URA3、LEU2、EN0、TPI (用于在糖酵母屬中表達(dá));A0X1 (用于在畢赤酵母中表達(dá));以及l(fā)ac、trp、lPL、lPK、T7、tac、Pbad> npr和trc (用于在大腸桿菌中表達(dá))。特別適用于在大腸桿菌中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子的額外的例子包括，但不限于大腸桿菌的色氨酸操縱子啟動(dòng)子Ptrp、大腸桿菌的乳糖操縱子啟動(dòng)子Plac、大腸桿菌的Ptac啟動(dòng)子、λ噬菌體右翼啟動(dòng)子Ρκ、λ噬菌體左翼啟動(dòng)子Ι/、Τ7啟動(dòng)子以及來(lái)自甲醇酵母(Pichiapastoris)的GAP基因，或是至少一種分離自微生物組的啟動(dòng)子，所述微生物選自由叢毛單胞菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、紅球菌屬、固氮菌屬、朽1檬酸細(xì)菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷白氏桿菌屬、沙門氏菌屬、乳酸桿菌屬、曲霉屬、糖酵母屬、畢赤酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢森氏酵母屬、杜氏藻屬、德巴利酵母屬、毛霉菌屬、球擬酵母屬、甲基桿菌屬、芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬和鏈霉菌屬組成的組。
終止控制區(qū)還可來(lái)源于不同的基因，優(yōu)選宿主自身的基因。任選地，終止位點(diǎn)可以是不必需的；然而，如果包括的話，則是最優(yōu)選的。
此外，所插入的遺傳物質(zhì)可包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)。所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)可來(lái)自λ噬菌體CII基因或選自從毛單胞菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、紅球菌屬、固氮菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷白氏桿菌屬、沙門氏菌屬、乳酸桿菌屬、曲霉屬、糖酵母屬、畢赤酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢森氏酵母屬、杜氏藻屬、德巴利酵母屬、毛霉菌屬、球擬酵母屬、甲基桿菌屬、芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬和鏈霉菌屬基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
任選地，所述基因產(chǎn)物可優(yōu)選為轉(zhuǎn)化的宿主的分泌產(chǎn)物。期望的蛋白分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中簡(jiǎn)化了純化步驟并降低了成本。分泌信號(hào)序列通常用于促進(jìn)可表達(dá)的蛋白主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜?？赏ㄟ^將編碼分泌信號(hào)的DNA序列摻入宿主中創(chuàng)建能分泌的轉(zhuǎn)化宿主。用于選擇適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(見例如EP 546049 ；W0 9324631)。所述分泌信號(hào)DNA可位于表達(dá)控制DNA和本發(fā)明的編碼序列或編碼序列片段之間，以及位于 帶有后者的讀框中。
蛋白質(zhì)工程
通過誘變生產(chǎn)本發(fā)明突變的腈水解酶。預(yù)期本發(fā)明的核苷酸可用于生產(chǎn)具有進(jìn)一步增強(qiáng)的或改變的活性的基因產(chǎn)物。用于突變天然基因序列以產(chǎn)生具有改變的或增強(qiáng)的活性的基因產(chǎn)物的多種方法是公知的，包括但不限于I)隨機(jī)誘變，2)結(jié)構(gòu)域交換(使用鋅指結(jié)構(gòu)域或限制性內(nèi)切酶)，3)易錯(cuò) PCR (Melnikov 等，Nucleic Acids Research, 27 (4)1056-1062(1999)) ；4)位點(diǎn)定向誘變(Coombs 等，Proteins (1998), pp 259-311，lplate.Angeletti, Ruth Hogue,編，Academic :San Diego, CA);和 5) “基因改組”(US 5, 605, 793 ；US 5，811，238 ；US 5，830，721 ;和 US 5，837，458，在此并入作為參考)。
通過錯(cuò)誤摻入核苷酸，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可用于擴(kuò)增帶有伴隨多個(gè)突變產(chǎn)生的DNA片段。這可通過改變PCR條件例如改變dNTPs比率或在反應(yīng)中添加不同數(shù)量的氯化猛而得以實(shí)現(xiàn)(Fromant 等，Anal Biochem, 224 (I) :347-53(1995) ;Lin_Goerke 等，Biotechniques, 23 (3) :409-12 (1997))。然后，可克隆突變的DNA片段庫(kù)以產(chǎn)生突變質(zhì)粒文庫(kù)，在諸如大腸桿菌的宿主中表達(dá)后，接著可對(duì)所述文庫(kù)進(jìn)行篩選。
由于基因改組的方法容易實(shí)施且誘變率高并易于篩選，因此其是特別具有吸引力的?；蚋慕M的方法包括在具有與目的基因相似性和/或差異的額外幾群DNA區(qū)存在下，用限制性內(nèi)切核酸酶將目的基因切割為特定大小的片段。然后，該片段庫(kù)應(yīng)變性并重退火以產(chǎn)生突變的基因。接著篩選改變活性的所述突變的基因。
可通過該方法突變本發(fā)明的微生物序列，并篩選改變或增強(qiáng)的活性。該序列應(yīng)當(dāng)是雙鏈的且可以具有從50bp到IOkB不同的長(zhǎng)度。使用本領(lǐng)域眾所周知的限制性內(nèi)切核酸酶，該序列可以被隨機(jī)消化為約IObp到IOOObp的片段(Sambrook, J. , Fritsch, E. F.和Maniatis, T.，Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3 2 fe, Cold Spring Harbor Laboratory : Co Id Spring Harbor, NY (1989);在下文中“ Maniatis”)。除本發(fā)明的微生物序列之外，可以添加與微生物序列全部或部分能雜交的片段群。同樣地，也可以添加不能與本發(fā)明序列雜交的片段群。一般來(lái)說(shuō)，與總的核酸相比，這些附加的片段群以約10至約20倍過量添加。一般地，如果執(zhí)行該方法，則混合物中不同的特定核酸片段的數(shù)目會(huì)在約100至約1000。對(duì)混合的隨機(jī)核酸片段群變性以形成單鏈酸片段，然后重退火。只有那些具有與其他單鏈核酸片段同源的區(qū)域的單鏈核酸片段會(huì)重退火?？赏ㄟ^加熱變性隨機(jī)核酸片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定完全變性雙鏈核酸所必需的條件。優(yōu)選溫度為約80°C _100°C?？赏ㄟ^冷區(qū)重退火核酸片段。優(yōu)選溫度為約20°C至約75°C。可通過添加聚こニ醇(“PEG”)或鹽加速?gòu)?fù)性。適合的鹽濃度可在OmM至約200mM。然后在核酸聚合酶和dNTPs (即dATP、dCTP、dGTP和dTTP)存在下溫育退火的核酸片段。所述核酸聚合酶可以是Klenow片段、Taq聚合酶或任何其他本領(lǐng)域公知的DNA聚合酶?？稍谕嘶鹣惹啊⑼嘶鹜瑫r(shí)或退火后，添加所述聚合酶到隨機(jī)核酸片段。在聚合酶存在下，變性、復(fù)性和溫育循環(huán)重復(fù)期望的次數(shù)。優(yōu)選所述循環(huán)重復(fù)約2至約50次，更優(yōu)選所述次序重復(fù)10至約40次。所得到的核酸是ー種約50bp至約IOOkB的較大的雙鏈多核苷酸，且通過標(biāo)準(zhǔn)的克隆和表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)于表達(dá)和改變的活性可進(jìn)行篩選(Maniatis，同上)。
此外，可通過使用基因改組(外顯子改組)方法融合功能域裝配雜合蛋白質(zhì)(Nixon等，PNAS，94 1069-1073 (1997))。本發(fā)明基因的功能域可與其他基因的功能域相結(jié)合以產(chǎn)生具有期望催化功能的新酶?？墒褂肞CR重疊延伸方法構(gòu)建雜合酶并使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)將其克隆入不同的表達(dá)載體中。
當(dāng)將こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸吋，穩(wěn)定劑改善了腈水解酶穩(wěn)定性和生產(chǎn)率
可通過讓甲醛與氰化氫反應(yīng)合成こ醇腈(US 2，175,805，US2，890，238，US5，187，301和共同未決的US臨時(shí)專利申請(qǐng)60/638127)。取決于反應(yīng)物的純度和用于制備こ醇腈的反應(yīng)條件，多種雜質(zhì)可存在于最終產(chǎn)物中。這些雜質(zhì)能干擾こ醇腈轉(zhuǎn)化為こ醇酸的效率。在一個(gè)實(shí)施方案中，在進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化為こ醇酸之前，可處理こ醇腈水溶液以除去不需要的雜質(zhì)。
另ー種增加酶催化劑穩(wěn)定性/生產(chǎn)率的方法是添加一種或多種會(huì)與こ醇腈溶液中不需要的化合物反應(yīng)的化合物，所述不需要的化合物可干擾催化劑穩(wěn)定性和/或生產(chǎn)率。不需要的化合物包括，但不限于甲醛、甲醛衍生的雜質(zhì)、甲醛衍生的低聚物以及聚合物、2-羥こ酰胺、2-羥こ酰胺衍生的雜質(zhì)、氰化氫衍生的雜質(zhì)、氰化氫衍生的低聚物和聚合物、乙醇腈衍生的雜質(zhì)、乙醇腈衍生的低聚物和聚合物、乙交酯、線型乙醇酸低聚物以及可能的氧(反應(yīng)在改善催化劑穩(wěn)定性的基本上無(wú)氧的條件下進(jìn)行)。不需要的化合物還可包括那些I)與腈水解酶催化劑反應(yīng)并失活其的，2)在反應(yīng)中與乙醇腈競(jìng)爭(zhēng)的，3)與乙醇腈或乙醇酸反應(yīng)以形成不需要的副產(chǎn)物的，或4)對(duì)重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生不利影響的(即促進(jìn)細(xì)胞溶解)。能添加到乙醇腈反應(yīng)混 合物中的適合的化合物的例子可包括，但不限于硫代硫酸鹽(如硫代硫酸鉀，K2S2O3)，連二亞硫酸鹽(如連二亞硫酸鈉，Na2S2O4)以及氰化物(如HCN、NaCN,KCN等)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物在酶催化劑添加之前、過程中或之后添加到乙醇腈反應(yīng)混合物中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，添加所述化合物到反應(yīng)混合物中使得在反應(yīng)混合物中的終濃度為至少約O. OOlM至小于約5￥丨％的反應(yīng)混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，添加所述化合物到反應(yīng)混合物中使得終濃度為至少約O. OlM0在還一個(gè)實(shí)施方案中，添加所述化合物到反應(yīng)混合物中使得化合物的終濃度為約O. OlM至約1M。
在本發(fā)明的另一方面，在基本上無(wú)氧的條件下進(jìn)行本發(fā)明方法。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“無(wú)氧的條件”、“無(wú)氧的氣氛”和“基本上無(wú)氧的條件”指其中不起反應(yīng)的氣體例如氮?dú)獗挥糜谇逑春?或覆蓋反應(yīng)釜使得分子氧(O2)不存在于本發(fā)明方法過程中的反應(yīng)條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)承認(rèn)在基本上無(wú)氧的條件下可存在痕量的分子氧。在一方面，術(shù)語(yǔ)“基本上無(wú)氧的”表示其中分子氧濃度低于約5%，優(yōu)選低于2%，更優(yōu)選低于1%以及最優(yōu)選低于O. I %的反應(yīng)釜中氣體的反應(yīng)條件。在另一方面，本發(fā)明方法在基本上無(wú)氧的條件下進(jìn)行，其中氮?dú)?N2)用于覆蓋反應(yīng)釜中含水反應(yīng)混合物。
_2] 控制乙醇腈濃度以改善催化劑穩(wěn)定性和生產(chǎn)率
另一種增加腈水解酶穩(wěn)定性的方法是控制含水反應(yīng)混合物中乙醇腈的最大濃度。如前所述，乙醇腈在極性溶劑中離解以釋放甲醛和氰化氫。反應(yīng)混合物中的甲醛可與酶催化劑反應(yīng)，導(dǎo)致過早的失活并降低了催化劑生產(chǎn)率?？刂迫芤褐幸掖茧娴臐舛饶茉黾哟呋瘎┓€(wěn)定性和催化劑生產(chǎn)率(每克催化劑產(chǎn)生的乙醇酸克數(shù))。如實(shí)施例12-15(表9)所示，在含有3M乙醇腈的反應(yīng)中，僅3次循環(huán)反應(yīng)后來(lái)源于敏捷食酸菌72W的腈水解酶催化劑就迅速喪失其活性，濃度降至IM和/或以IM增量逐步添加3M乙醇腈(在之前添加的乙醇腈已轉(zhuǎn)化為乙醇酸銨之后添加)明顯增加了催化劑生產(chǎn)率(表9)。在一個(gè)實(shí)施方案中，逐步添加(等分物)乙醇腈到含水反應(yīng)混合物中增加了催化劑生產(chǎn)率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以逐步方式添加乙醇腈到含水反應(yīng)混合物中，使得反應(yīng)過程中乙醇腈的總濃度保持在約IM或更低。
如實(shí)施例15所示，在幾次再循環(huán)反應(yīng)后連續(xù)添加乙醇腈也增加了催化劑生產(chǎn)率。在一個(gè)實(shí)施方案中，由乙醇腈產(chǎn)生乙醇酸銨的方法使用了連續(xù)添加乙醇腈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，乙醇腈添加的速率為至少5倍的催化劑Km。本發(fā)明的催化劑通常具有約ImM(野生型敏捷食酸菌72W ；SEQ ID NO 6)至約2. 7mM的對(duì)乙醇腈的Km。如本領(lǐng)域已知的，約5倍Km值的底物濃度(即5X2. 7mM = 13. 5mM)產(chǎn)生約97%的最大反應(yīng)速率(Vmax)的反應(yīng)速率。在又一個(gè)實(shí)施方案中，控制乙醇腈進(jìn)料速度以保持反應(yīng)混合物中乙醇腈濃度為約5mM至約1M，優(yōu)選約IOOmM至約1M，更優(yōu)選約IOOmM至約500mM。
控制DH
利用本發(fā)明的腈水解酶催化劑的反應(yīng)通常在約5至約10，優(yōu)選5. 5至約8，更優(yōu)選約5. 5至約7. 7以及最優(yōu)選約6至約7. 7的pH下運(yùn)行。[0167]こ醇酸和こ醇腈的分析
適合于分析こ醇酸產(chǎn)生的分析法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括但不限于HPLC、CE、GC和MS。例如，HPLC分析用于測(cè)定こ醇酸產(chǎn)生量，使用了折光率檢測(cè)器和Bio-Rad HPX-87H柱(30cm X 7. 8mm直徑)以及在50°C下以I. OmL/min (等度洗脫)的0. OlN硫酸作為流動(dòng)相。HPLC方法適合于定量底物(こ醇腈)和產(chǎn)物(こ醇酸)。
微牛物催化劑的エ業(yè)牛產(chǎn)
在期望使用本發(fā)明突變的腈水解酶基因エ業(yè)生產(chǎn)本發(fā)明的腈水解酶的情況下，可使用多種培養(yǎng)方法。發(fā)酵可以分批、補(bǔ)料分批或連續(xù)方式進(jìn) 行，方法是本領(lǐng)域眾所周知的(Thomas D. Brock in Biotechnology A Textbook of Industrial Microbiology, W 2 版(1989)Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, MA, (1989) ；Deshpande, Mukund V. , Appl.Biochem.Biotechnol. 36(3) :227-234(1992))。
經(jīng)典的分批培養(yǎng)方法是ー種封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基組合物在培養(yǎng)開始時(shí)就設(shè)定好的，在培養(yǎng)過程中不進(jìn)行人工改變。因此，在培養(yǎng)過程開始時(shí)，就將期望的生物體接種培養(yǎng)基，并且在不添加任何物質(zhì)到該系統(tǒng)中的情況下，讓其生長(zhǎng)或進(jìn)行代謝活動(dòng)。然而，一般來(lái)說(shuō)，“分批”培養(yǎng)是針對(duì)碳源的添加而言的分批，并且通常試圖控制諸如PH和氧濃度的因素。在分批系統(tǒng)中，該系統(tǒng)的代謝物和生物量組成穩(wěn)定地改變著，直到培養(yǎng)結(jié)束。在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞通過靜止停滯期到高速生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期并最終到達(dá)穩(wěn)定期，其中在穩(wěn)定期生長(zhǎng)速度降低或停止。如果不進(jìn)行處理。處在靜止期的細(xì)胞最終會(huì)死亡。對(duì)數(shù)期的細(xì)胞通常決定最終產(chǎn)物或在某些系統(tǒng)中的中間產(chǎn)物的產(chǎn)量。靜止期或指數(shù)期后生產(chǎn)可以在其他系統(tǒng)中獲得。
標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的變化形式是補(bǔ)料分批系統(tǒng)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法同樣適用于本發(fā)明，并且包括典型的分批系統(tǒng)，所不同的是，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，以增量形式添加底物。當(dāng)降解物阻遏傾向于抑制細(xì)胞的代謝以及當(dāng)培養(yǎng)基中需要具有有限量的底物時(shí)，可以使用補(bǔ)料分批系統(tǒng)。要測(cè)定補(bǔ)料分批系統(tǒng)的實(shí)際底物濃度是困難的，因此，根據(jù)可測(cè)定因素如PH，溶解氧，以及諸如CO2的廢氣的分壓的變化進(jìn)行估算。分批和補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法是常用的并且為本領(lǐng)域眾所周知，其例子可見于Brock (同上)和Deshpande (同上)。
本發(fā)明腈水解酶催化劑的エ業(yè)生產(chǎn)還可以通過連續(xù)培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。連續(xù)培養(yǎng)是ー種開放系統(tǒng)，其中將規(guī)定的培養(yǎng)基連續(xù)地添加到生物反應(yīng)器中，并同時(shí)將等量的條件培養(yǎng)基取出進(jìn)行加工。連續(xù)培養(yǎng)通常將細(xì)胞保持在恒定的高液相密度下，其中細(xì)胞主要是在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)?；蛘?，可用固定的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，其中連續(xù)添加碳和養(yǎng)分以及不斷地從細(xì)胞團(tuán)塊中將有價(jià)值的產(chǎn)物、副產(chǎn)物或廢棄產(chǎn)物取出?？墒褂枚喾N由天然和/或合成材料組成的支持物進(jìn)行細(xì)胞固定。
連續(xù)或半連續(xù)培養(yǎng)可以調(diào)節(jié)能夠影響細(xì)胞生長(zhǎng)或最終產(chǎn)物濃度的一種因素或任意數(shù)目的因素。例如，ー種方法能保持限制養(yǎng)分，例如讓碳源或氮含量處在固定比例上，并且允許所有其他參數(shù)處在適當(dāng)水平上。在其他系統(tǒng)中，可以連續(xù)地改變影響生長(zhǎng)的多種因素，同時(shí)保持通過培養(yǎng)基濁度測(cè)量的細(xì)胞濃度恒定。連續(xù)系統(tǒng)試圖保持穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)條件，因此，通過取出培養(yǎng)基所導(dǎo)致的細(xì)胞減少，必須與培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長(zhǎng)速度平衡。調(diào)節(jié)連續(xù)培養(yǎng)方法的養(yǎng)分和生長(zhǎng)因子的方法，以及用于使產(chǎn)物形成速度最大化的方法在エ業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域中是眾所周知的，并且由Brock(同上)詳細(xì)披露了多種方法。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有適合的碳底物。適合的碳底物可包括，但不限于諸如葡萄糖和果糖的單糖、諸如乳糖或蔗糖的二糖、諸如淀粉或纖維素或它們的混合物的多糖、以及來(lái)自諸如干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖漿和大麥芽的可再生原料的未純化的混合物。因此，預(yù)計(jì)用于本發(fā)明的碳源可包括多種含碳底物，僅受受限于所選擇的生物體。
從乙醇酸銨回收乙醇酸的方法
從相應(yīng)的銨鹽回收和/或獲得有機(jī)酸的方法是本領(lǐng)域已知的。從包含乙醇酸銨的水溶液回收和/或獲得乙醇酸的方法可包括，但不限于離子交換(陰離子和/或陽(yáng)離子交換)、電滲析、反應(yīng)性溶劑萃取、熱分解、醇解(酯化后將乙醇酸酯水解為乙醇酸)以及它們的組合。
離子交換(陽(yáng)離子交換)
陽(yáng)離子交換是一種可逆過程，其中溶解的離子物種以化學(xué)計(jì)量的方式為支持物所吸收。陽(yáng)離子交換是本領(lǐng)域眾所周知的。在本發(fā)明方法中，將乙醇酸銨注入陽(yáng)離子交換樹脂中，其中銨離子與質(zhì)子交換，形成乙醇酸(見實(shí)施例28)。乙醇酸穿過柱子并得到收集。
一旦樹脂為銨離子所飽和，就用酸例如硫酸再生，會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物硫酸銨鹽。使用模擬移動(dòng)床或圓盤傳送帶(carrousel),可分批進(jìn)行陽(yáng)離子交換(R11 Perry1 s ChemicalEngineers' Handbook,第 7 版，Perry, Robert H. , Green, Dow ff.和 Maloney, James 0.,編；McGraw Hill Companies, Inc. , New York, NY, 1997 ;在下文中稱為 “Perry' s，，)。樹脂的選擇可影響進(jìn)料濃度，其可為約0. 02wt%鹽至約50wt%Z醇酸銨,優(yōu)選約0. 02 1:%至約40wt%。通常所用的再生酸為約0. 5wt%至約20wt%。
離子交換(陰離子交換)
陰離子交換也是本領(lǐng)域眾所周知的。除使用弱陰離子交換樹脂之外，陰離子交換類似于陽(yáng)離子交換(見Perry' S，同上)。樹脂的選擇能影響再次進(jìn)料濃度，其可為約0. 02wt%至約90wt%乙醇酸銨,優(yōu)選約0. 02wt%至約40wt%。通常應(yīng)使用弱酸進(jìn)行樹脂再生。
溶劑萃取(反應(yīng)性)
一種已用于分離羧酸的方法是反應(yīng)性萃取。已報(bào)道該方法能用于從乳酸銨中萃取乳酸(Wasewar等，J. Biotechnol. ,97 :59_68 (2002))。反應(yīng)性萃取包括使用反應(yīng)性有機(jī)溶劑(即胺)絡(luò)合水相中的酸。該過程中的第一步通常包括酸化含有期望的酸的鹽的水溶液。然后，將酸化的水溶液與通常包含反應(yīng)性叔胺和一種或多種稀釋劑的有機(jī)溶劑接觸。反應(yīng)性胺(通常為 C8-C10 三烷基叔胺例如Alamine 336，Cognis Corp, Cincinnati, OH)與羧酸反應(yīng)形成優(yōu)先溶于有機(jī)相中的酸/胺絡(luò)合物(Tamada等，Ind. Eng. Chem. Res. 29 1319-1326(1990) ;Tamada 等，Ind. Eng. Chem. Res. 29 :1327-1333 (1990))。與使用常規(guī)的溶劑萃取所能獲得的結(jié)果相比，使用叔烷基胺通常提供了更高的分配系數(shù)。然后，使用反萃取從有機(jī)相中回收酸。
Inci, I. (Chem. Biochem. Eng. Q. , 16 (2) 81~85 (2002) ； Inci, I.和 UsIu, H·，J. Chem. Eng. Data, 50 :536-540(2005))報(bào)道了使用反應(yīng)性胺溶劑萃取乙醇酸。然而，這些試驗(yàn)報(bào)道的是溶解于純水中的純乙醇酸的萃取系數(shù)。Inci沒有舉例說(shuō)明或教導(dǎo)一種由復(fù)雜的含水基質(zhì)(如包含大量天然鹽和其他雜質(zhì)的乙醇酸水溶液)例如濃縮的乙醇酸銨水溶液獲得乙醇酸的方法。
反應(yīng)性溶劑萃取還可用于由乙醇酸銨水溶液獲得乙醇酸(見共同未決的US臨時(shí)專利申請(qǐng)60/638128 ;在此并入作為參考)。更具體地說(shuō)，提供了ー種由包含こ醇酸銨的水溶液分離こ醇酸的方法，包括
a)提供第一相，其中所述第一相是水不混溶的有機(jī)溶劑混合物，包含
i)約30體積百分比至約99體積百分比的所述第一相是至少ー種具有以下分子式
的叔烷基胺
權(quán)利要求
1.一種由乙醇腈生產(chǎn)乙醇酸的方法，包括 a)將適合的含水反應(yīng)混合物中的乙醇腈與包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化劑接觸，由此產(chǎn)生乙醇酸，所述多肽如SEQ ID NO: 22所示；和 b)以鹽或酸的形式回收(a)中產(chǎn)生的乙醇酸；其中當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時(shí)，相對(duì)于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化劑提供了至少I. 5倍腈水解酶活性增加。
2.權(quán)利要求
I的方法，其中酶催化劑是當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時(shí)，相對(duì)于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性提供了至少約2倍腈水解酶活性改善的改良的腈水解酶催化劑。
3.權(quán)利要求
I的方法，其中酶催化劑是當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時(shí)，相對(duì)于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性提供了至少約4倍腈水解酶活性改善的改良的腈水解酶催化劑。
4.權(quán)利要求
I的方法，其中酶催化劑以完整的微生物細(xì)胞、透化處理的微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞提取物的一種或多種成分、部分純化的酶或純化的酶的形式存在。
5.權(quán)利要求
4的方法，其中所述完整的微生物細(xì)胞是重組表達(dá)所述多肽的轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求
4的方法，其中轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞選自叢毛單胞菌、棒狀桿菌、短桿菌、紅球菌、固氮菌、檸檬酸桿菌、腸桿菌、梭狀芽孢桿菌、克雷白氏桿菌、沙門氏菌、乳酸桿菌、曲霉、糖酵母、接合酵母、畢赤酵母、克魯維酵母、假絲酵母、漢森氏酵母、杜氏藻、德巴利氏酵母、毛霉菌、球擬酵母、甲基桿菌、芽孢桿菌、埃希氏桿菌、假單胞菌、根瘤菌和鏈霉菌。
7.權(quán)利要求
6的方法，其中轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
8.權(quán)利要求
7的方法，其中轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞是選自大腸桿菌MG1655和大腸桿菌FM5的大腸桿菌菌株。
9.權(quán)利要求
1-8任一項(xiàng)的方法，其中酶催化劑固定在可溶性或不溶性的支持物中或支持物上。
10.權(quán)利要求
I的方法，其中在含水反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的乙醇酸銨的濃度為約0.02wt% 至約 90 wt %。
11.權(quán)利要求
10的方法，其中在含水反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的乙醇酸銨的濃度為約0.02wt % 至約 40 wt %。
12.權(quán)利要求
9的方法，其中含水反應(yīng)混合物中乙醇腈的濃度為約5mM至約I M。
13.權(quán)利要求
12的方法，其中通過連續(xù)或等分物添加保持含水反應(yīng)混合物中的乙醇腈濃度。
14.權(quán)利要求
I的方法，其中含水反應(yīng)混合物中pH保持在約5.5至約7. 7。
15.權(quán)利要求
I的方法，其中在基本上無(wú)氧的條件下進(jìn)行乙醇腈酶促轉(zhuǎn)化為乙醇酸。
16.權(quán)利要求
I的方法，其中含水反應(yīng)混合物進(jìn)一步包含小于5wt %濃度的選自硫代硫酸鉀和連二亞硫酸鈉的穩(wěn)定劑。
17.權(quán)利要求
I的方法，其中酶催化劑是再循環(huán)的酶催化劑。
18.權(quán)利要求
I的方法，其中酶催化劑提供了每克酶催化劑細(xì)胞干重產(chǎn)生至少300克乙醇酸的催化劑生產(chǎn)率。
19.權(quán)利要求
18的方法，其中酶催化劑提供了每克酶催化劑細(xì)胞干重產(chǎn)生至少450克乙醇酸的催化劑生產(chǎn)率。
20.權(quán)利要求
19的方法，其中酶催化劑提供了每克酶催化劑細(xì)胞干重產(chǎn)生至少1000克乙醇酸的催化劑生產(chǎn)率。
專利摘要
本發(fā)明涉及乙醇酸的酶促生產(chǎn)。具體地，提供了由乙醇腈酶促生產(chǎn)乙醇酸的多種方法。這些方法包括1)利用具有改善的用于將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體，和2)改善催化劑穩(wěn)定性和/或生產(chǎn)率的方法。該改善催化劑穩(wěn)定性和/或生產(chǎn)率的方法包括利用反應(yīng)穩(wěn)定劑，在基本上無(wú)氧的條件下運(yùn)行反應(yīng)以及控制反應(yīng)混合物中底物的濃度。
文檔編號(hào)C12P7/42GKCN102796772SQ201210291353
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2005年12月21日
發(fā)明者R.迪科西莫, M.S.佩恩, A.帕諾瓦, D.P.奧基夫, J.S.湯普森 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan