專利名稱：巴斯德畢赤酵母醇氧化酶ii調(diào)節(jié)區(qū)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組DNA生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的一個方面涉及調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA順序。本發(fā)明的另一方面涉及插入上述DNA順序的載體。本發(fā)明的再一個方面涉及用上述載體轉(zhuǎn)化的新的細胞。
本發(fā)明一般地涉及遺傳物質(zhì)的操作，特別是從DNA轉(zhuǎn)錄RNA之頻率的調(diào)節(jié)。本發(fā)明特別涉及巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)醇氧化酶Ⅱ基因的調(diào)節(jié)區(qū)。
隨著近年來重組DNA生物技術(shù)的發(fā)展，已有可能由細胞控制性地產(chǎn)生許多種有用的多肽。已由各種微生物產(chǎn)生了許多真核細胞多肽，如人生長激素、白細胞干擾素、人胰島素和人胰島素原。繼續(xù)應(yīng)用這些已掌握的技術(shù)可望在將來以重組法產(chǎn)生各種其他有用的多肽產(chǎn)物。
在重組技術(shù)領(lǐng)域中使用的基本技術(shù)是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的。
為完成重組DNA生物技術(shù)所需的組成要素包括，但不只限于(1)編碼一條或多條所需多肽的基因，其中所說的基因是與適當(dāng)?shù)目刂祈樞蚩刹僮鞯剡B接以便在宿主細胞中表達該基因(可操作地連接是指各成份構(gòu)成相鄰的位置，能夠執(zhí)行其正常功能);
(2)一種載體，通常是可向其中插入一核苷酸順序的質(zhì)粒;載體可以是任何能轉(zhuǎn)化某宿主的含核苷酸順序之構(gòu)建物;
(3)可將所需之核苷酸順序轉(zhuǎn)化到其中的一種適當(dāng)?shù)乃拗鳎拗饕簿哂惺雇鈦淼暮塑账犴樞蚓幋a的信號得以表達的細胞器。
用于重組技術(shù)的基本要素是質(zhì)粒，其為最初見于微生物內(nèi)的染色體外的環(huán)形雙股DNA。已知每個細胞內(nèi)可出現(xiàn)多個質(zhì)粒拷貝。除天然存在的質(zhì)粒外，也已制備了各種人工質(zhì)粒。質(zhì)粒中包含質(zhì)粒復(fù)制所需要的信息，即自主復(fù)制順序和/或復(fù)制原點。質(zhì)粒中編碼的信息還可包括在轉(zhuǎn)化的細胞內(nèi)進行表型選擇的一種或多種標志。表型或標志選擇特征，如對抗生素的抗性，可使含目的質(zhì)粒的宿主細胞克隆被識別并可根據(jù)細胞在篩選培養(yǎng)基中生長優(yōu)勢而篩選之。載體或質(zhì)粒能被一種或多種限制性核酸內(nèi)切酶特異地切斷，這些種酶均可識別一特定的核苷酸順序。因此，與一個異源基因(即天然狀態(tài)下該調(diào)節(jié)基因不與之組合的)可操作地連接的調(diào)節(jié)區(qū)，或者是與其它的核苷的順序可操作地連接的調(diào)節(jié)區(qū)，能夠與所要求的遺傳物質(zhì)可操作地于切割位點或切割位點處構(gòu)建的末端連接。
然后將載體導(dǎo)入宿主細胞，此時其核苷酸順序可指導(dǎo)宿主完成各種過程或功能。一些例子包括表達異源多肽。一般將核苷酸引入宿主細胞的過程稱為轉(zhuǎn)化?？蓪⑤d體導(dǎo)入適當(dāng)宿主內(nèi)增加拷貝數(shù)得到大量載體。常用于增加載體拷貝數(shù)的宿主細胞是大腸桿菌。然后從第一種宿主中分離載體并引入第二種宿主，以在其中出現(xiàn)預(yù)期的載體指導(dǎo)的活動，如多肽的產(chǎn)生。以這種方式由DNA產(chǎn)生終產(chǎn)物稱為表達。當(dāng)將其基因適當(dāng)?shù)夭迦胼d體同時考慮到載體控制編碼之核苷酸順序的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯時，即可用所得載體指導(dǎo)由插入之基因編碼的多肽肽鏈的生產(chǎn)。
表達是由一調(diào)節(jié)區(qū)控制的。調(diào)節(jié)區(qū)是對各種刺激起反應(yīng)并影響RNA轉(zhuǎn)錄頻率的異源核苷酸順序。對刺激作出反應(yīng)而打開或關(guān)閉表達過程。對刺激作出反應(yīng)而開始表達通常稱為去阻遏或誘導(dǎo)?？烧T導(dǎo)之表達系統(tǒng)的一些例子有巴斯德畢赤酵母中的APXI系統(tǒng)、有爪蟾蜍(Xenopuslaevis)中的雌激素體系，以及猴、人、倉鼠、小鼠和大鼠中的金屬巰基體系。誘導(dǎo)表達體系比組成體系通常處于更強烈的控制之下。誘導(dǎo)表達體系非常適于基因工程目的。
實踐中，可使用重組DNA生物技術(shù)產(chǎn)生能表達異源核苷酸順序的細胞。異源核苷酸順序為并非天然存在于宿主內(nèi)的核苷酸順序。其可以是天然存在于宿主內(nèi)之調(diào)節(jié)區(qū)與同該調(diào)節(jié)區(qū)無天然關(guān)聯(lián)之結(jié)構(gòu)基因形成的新的重組。另一個例子是某調(diào)節(jié)區(qū)與并非天然存在于宿主內(nèi)之某一個基因的重組。異源多肽可作為一種融合多肽而產(chǎn)生，即同同源或異源多肽氨基酸順序的一部分融合的異源多肽。最初得到的融合多肽產(chǎn)物有時是以無活性形式產(chǎn)生的，只有當(dāng)在細胞內(nèi)某種環(huán)境下被裂解后才有活性。
如先前在歐洲專利申請86114700.7號(已列為參考文獻)所述，巴斯德畢赤酵母基因組編碼兩個醇氧化酶功能基因AOX1和AOX2。
我們已發(fā)現(xiàn)了與AOX2結(jié)構(gòu)基因有關(guān)的5′調(diào)節(jié)區(qū)。該調(diào)節(jié)區(qū)可被甲醇或碳源饑餓所誘導(dǎo)。但自AOX2調(diào)節(jié)區(qū)表達的最高水平只是AOX1調(diào)節(jié)區(qū)的5-11%左右(AOX1是在列為本文參考文獻之歐洲專利申請85201235.0號中公開的)。
可利用AOX2調(diào)節(jié)區(qū)表達異源基因，并特別適用于那些高水平表達蛋白質(zhì)不利的情況下。
根據(jù)本發(fā)明，我們已發(fā)現(xiàn)、分離并鑒定了一個調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄之頻率的DNA順序。本發(fā)明的新的DNA順序用于由甲基營養(yǎng)性酵母如巴斯德畢赤酵母產(chǎn)生多肽。


圖1顯示了AOX1(a)和AOX2(b)基因的限制圖譜。
圖2顯示了pBR322的限制圖譜。
圖3顯示了pYJ8的限制圖譜。
圖4顯示了質(zhì)粒pYM5的限制圖譜。
圖5顯示了質(zhì)粒pMR4的限制圖譜。
圖6顯示了構(gòu)建pMR4的流程圖。
圖7顯示了質(zhì)粒pBPf1的限制圖譜。
圖8顯示了質(zhì)粒pYJ55的限制圖譜。
圖9顯示了構(gòu)建質(zhì)粒pYJ55的流程圖。
圖10顯示了質(zhì)粒pSAOH5的限制圖譜。
根據(jù)本發(fā)明，其提供一含有至少對下述的一個條件起反應(yīng)之調(diào)節(jié)區(qū)的新DNA順序在宿主環(huán)境中存在甲醇或當(dāng)宿主細胞生長于非甲醇底物上時發(fā)生碳源饑餓。本發(fā)明的調(diào)節(jié)區(qū)當(dāng)可操作地連接在編碼mRNA的DNA順序5′端時，能夠控制RNA轉(zhuǎn)錄的頻率。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，其提供了含上述DNA順序的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化的生物體以及產(chǎn)生這些質(zhì)粒和生物體的方法。
從本文提供的詳細描述和權(quán)利要求將會更清楚地了解本發(fā)明的這些和其他目的。
Ⅰ.醇氧化酶調(diào)節(jié)區(qū)的特征圖1(b)中提供的限制圖譜內(nèi)顯示完整的AOX2基因。如圖1(b)的限制圖譜所示，AOX2調(diào)節(jié)區(qū)處于5′端的第一個EcoRⅠ位點和AOX2結(jié)構(gòu)基因的起始密碼子之間。編碼醇氧化酶Ⅱ蛋白質(zhì)之該部分DNA順序是由限制圖譜下粗線標示的。圖1(a)為比較兩個基因而提供了醇氧化酶Ⅰ基因的限制圖譜。在基因的編碼蛋白質(zhì)的順序以外沒有觀察到明顯的順序同源性。
已通過lacZ融合構(gòu)建物進一步確定了AOX2調(diào)節(jié)區(qū)的特征，要求不少于約從堿基對-1500至堿基對-1的順序來滿足調(diào)節(jié)活性(如表1所示)。
表1中提供了含AOX2調(diào)節(jié)區(qū)之DNA片段的核苷酸順序。
表1AOX2調(diào)節(jié)區(qū)和5′非轉(zhuǎn)譯區(qū)-1750-1730-1710GGATCTCAAAAACCTAAGTACTTCATTTGAATATAACTCTGCACCTAAATTTACACCTAA-1690-1670-1650CTCTCTATCTAGGCTCTAGATTTGATAGATTCTATAGCCTTTGGTTTGTTATAGTGTTCA-1630-1610-1590CCAACTGGATGTCCTAACGAAATGGTTCTGTGGTCTAGTTGGTTATGGCATATGCTTAAC-1570-1550-1530ACGCATAACGTCCCCAGTTCGATCCTGGGCAGAATCATTATTTTTTGACCGAATTCTTTT-1510-1490-1470TTTCAGACCATATGACCGGTCCATCTTCTACGGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTAT-1450-1430-1410CTTGATTCTTTTATGATTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACT-1390-1370-1350TAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACA-1330-1310-1290GATTGTGATCAAGAAGCAGAGACAATCACCACTAAGGTTGCACATTTGAGCCAGTAGGCT-1270-1250-1230CCTAATAGAGGTTCGATACTTATTTTGATAATACGACATATTGTCTTACCTCTGAATGTG-1210-1190-1170TCAATACTCTCTCGTTCTTCGTCTCGTCAGCTAAAAATATAACACTTCGAGTAAGATACG-1150-1130-1110CCCAATTGAAGGCTACGAGATACCAGACTATCACTAGTAGAACTTTGACATCTGCTAAAG-1090-1070-1050CAGATCAAATATCCATTTATCCAGAATCAATTACCTTCCTTTAGCTTGTCGAAGGCATGA-1030-1010-990AAAAGCTACATGAAAATCCCCATCCTTGAAGTTTTGTCAGCTTAAAGGACTCCATTTCCT-970-950-930AAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTT-910-890-870CATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAA
-850-830-810CCCCTCAATTTTCCATCCAAGGGCGATCCTTACAAAGTTAATATCGAACAGCAGAGACTA-790-770-750AGCGAGTCATCATCACCACCCAACGATGGTGAAAAACTTTAAGCATAGATTGATGGAGGG-730-710-690TGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGAGTTTGAAACTATGGGGTAATACATCACATCCGG-670-650-630AACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCAAAGCACGTGATGTACCCCGTAAACTGCTCGGA-610-590-570TTATCGTTGCAATTCATCGTCTTAAACAGTACAAGAAACTTTATTCATGGGTCATTGGAC-550-530-510TCTGATGAGGGGCACATTTCCCCAATGATTTTTTGGGAAAGAAAGCCGTAAGAGGACAGT-490-470-450TAAGCGAAAGAGACAAGACAACGAACAGCAAAAGTGACAGCTGTCAGCTACCTAGTGGAC-430-410-390AGTTGGGAGTTTCCAATTGGTTGGTTTTGAATTTTTACCCATGTTGAGTTGTCCTTGCTT-370-350-330CTCCTTGCAAACAATGCAAGTTGATAAGACATCACCTTCCAAGATAGGCTATTTTTGTCG-310-290-270CATAAATTTTTGTCTCGGAGTGAAAACCCCTTTTATGTGAACAGATTACAGAAGCGTCCT-250-230-210ACCCTTCACCGGTTGAGATGGGGAGAAAATTAAGCGATGAGGAGACGATTATTGGTATAA-190-170-150AAGAAGCAACCAAAATCCCTTATTGTCCTTTTCTGATCAGCATCAAAGAATATTGTCTTA-130-110-90AAACGGGCTTTTAACTACATTGTTCTTACACATTGCAAACCTCTTCCTTCTATTTCGGAT-70-50-30CAACTGTATTGACTACATTGATCTTTTTTAACGAAGTTTACGACTTACTAAATCCCCACA-10AACAAATCAACTGAGAAAA
AOX2調(diào)節(jié)區(qū)至少對下述條件之一起反應(yīng)以甲醇作為甲基營養(yǎng)性酵母宿主如巴斯德畢赤酵母的唯一碳源，或所說宿主細胞的碳源饑餓。此外AOX2調(diào)節(jié)區(qū)刺激β半乳糖苷酶的蛋白質(zhì)產(chǎn)量約為AOX1調(diào)節(jié)區(qū)的5-11%。
Ⅱ.由巴斯德畢赤酵母中分離醇氧化酶調(diào)節(jié)區(qū)經(jīng)轉(zhuǎn)化畢赤酵母(pichia)菌株MC100-3(arg 4 his 4 aox 1△;;SARG4 aox 2 △;;phis4)分離AOX2調(diào)節(jié)區(qū)。用p YM5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含已插入AOX2基因MC100-3之畢赤酵母HIS4基因突變拷貝的該菌株，其中所說的質(zhì)粒由含有在p BR322之BamHⅠ位點插入之畢赤酵母HIS4基因的2.7kb BglⅡ階段組成的。用Southern濾膜雜交法篩選幾個MC100-3(p YM5)His+轉(zhuǎn)化體的DNA，以得到含有與位于MC100-3之AOX位點之HIS4片段整合的p YM5的轉(zhuǎn)化體。然后用Hind Ⅲ消化這些轉(zhuǎn)化體之一的DNA，導(dǎo)致含AOX2 KpnⅠ位點之5′端5.3kb的順序、2.7kb之畢赤酵母HIS4基因和4.0kbp BR322的一共約12kb基因組片段的釋放。連接Hind Ⅲ切斷的DNA并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。根據(jù)抗氨芐青霉素抗性選擇轉(zhuǎn)化株。回收質(zhì)粒pMR4，該質(zhì)粒的限制圖譜示于圖5。
Ⅲ.AOX2調(diào)節(jié)區(qū)的性質(zhì)為比較AOX2和AOX1調(diào)節(jié)區(qū)的表達水平，按與pSAOH5(如圖10所示，為-AOX1-lacZ融合載體)盡可能相似的方法構(gòu)建一個AOX2-lacZ表達載體。圖9中顯示了AOX2-1acZ載體即pYJ55的構(gòu)建流程。根據(jù)AOX25′端的初步DNA順序資料揭示，AOX2在結(jié)構(gòu)基因位置上含有兩個BamHⅠ位點，與AOX1結(jié)構(gòu)基因所見相同。因此，構(gòu)建pYJ55的第一步是將含有AOX2調(diào)節(jié)區(qū)和45個堿基對之氨基末端蛋白編碼順序的1.8kbBglⅡ-BamHⅠ片段插入pBPf1的BamHⅠ位點，構(gòu)成pYJ38。第二步是用BamHⅠ切割pYJ38，并插入與構(gòu)建AOX1-1acZ載體而插入的同一接頭寡核苷酸(5′-GATCACCCGGGT-3′)。該接頭的插入破壞了pYJ38的BamHⅠ位點，并在插入點產(chǎn)生了一個新的SmaⅠ位點。用SmaⅠ消化該質(zhì)粒pYJ45，并將含有修飾過的AOX2啟動子的1.8kbSmaⅠ片段插入pBPf1構(gòu)成質(zhì)粒pYJ46。用EcoRⅠ消化質(zhì)粒pJY46以由pYJ46中AOX2片段的5端除去-0.3kb片段。再連接質(zhì)粒構(gòu)成質(zhì)粒pYJ55。圖8中提供了質(zhì)粒pYJ55的限制性酶切圖譜。
將質(zhì)粒p YJ55轉(zhuǎn)化到GS115(his 4)中，并根據(jù)表明存在整合之質(zhì)粒的穩(wěn)定的His+表型篩選His+轉(zhuǎn)化株。用Southern濾膜雜交法分析幾個穩(wěn)定的His菌株中的基因組DNA，以證實質(zhì)粒的存在并確定其定位。
為估計AOX1和AOX2的相對強度，通過將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到GS115中來比較由pYJ55和pSAOH5產(chǎn)生的β半乳糖苷酶。轉(zhuǎn)化的GS115菌株分別被定各為GS115(pYJ55)和GS115(pSAOH5)。各菌株均含有在HIS4位點整合的質(zhì)粒。使各菌株的細胞生長在甘油培養(yǎng)基中，移入沒有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，然后再移入含甲醇的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)50小時。在各生長期終了時取出各培養(yǎng)物的樣品，制備抽提物并檢測β半乳糖苷酶。分析結(jié)果如表2中所示。
表2比較AOX1-和AOX2-lacZ融合體的β-半乳糖苷酶表達在碳源中的β-半乳糖苷酶活性(U/μg)菌株啟動子甘油無碳源1甲醇GS115(pSAOH5)AOX1＜109566，205GS115(pYJ55)AOX2＜101097391YNB培養(yǎng)基生長于含甘油培養(yǎng)基中的AOX1-lacZ或AOX2-lacZ菌株細胞均未見到顯著水平的β半乳糖苷酶。在沒有碳源的培養(yǎng)基中，AOX2-1acZ菌株內(nèi)的酶活性水平約為AOX1-1acZ菌株中觀察到的1/10。向含AOX2-1acZ的細胞中加入甲醇，使β半乳糖苷酶的水平約達到AOX2-1acZ細胞的1/9。因此AOX1和AOX2基因是以相似方式被調(diào)節(jié)的。一個突出的特征是AOX2調(diào)節(jié)區(qū)對甲醇和碳源饑餓的反應(yīng)弱得多。
雖然本文描述了將融合的AOX2調(diào)節(jié)區(qū)-β半乳糖苷酶基因?qū)胨拗鹘湍讣毎姆椒?，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，不必為實施本發(fā)明而利用環(huán)形質(zhì)?；颚掳肴樘擒彰附Y(jié)構(gòu)基因。因此，可在利用這一連有其它異源基因的調(diào)節(jié)區(qū)時，使用能被保留于酵母中的其他載體。另外，可使用整合載體，將這一可操作地連接到其他異源基因上的調(diào)節(jié)區(qū)整合到宿主酵母細胞的染色體內(nèi)。還可使用本文描述之由5′端較短DNA順序組成的，AOX2調(diào)節(jié)區(qū)的功能性突變順序調(diào)節(jié)異源基因的表達。
實施例與實施例有關(guān)的一般性資料菌株巴斯德畢赤酵母NRNLY-11430巴斯德畢赤酵母GS115(his4)NRRLY-15851巴斯德畢赤酵母PPF1(arg4his4)NRRLY-18017巴斯德畢赤酵母KM7121(arg4his4aox14;;aox2△;;PHIS4)NRRLY-18019大腸桿菌MC10611FaraD139△(araABDIC-leu)7679△lacX74galugalkrpsLhsdR]培養(yǎng)基、緩沖液和溶液IMTris緩沖液121.1gTris堿溶于800ml水中，用濃鹽酸(35%)調(diào)節(jié)到所需pH值;調(diào)整pH前將溶液冷卻至室溫，最后稀釋到終體積1升TE緩沖液1.0mMEDTA溶于0.01M(pH7.4)Tris緩沖液
SSC0.15MNacl15mM檸檬酸鈉用NaOH調(diào)到pH7.0TAE40mM乙酸5mMEDTA溶于0.02M(pH8.3)Tris緩沖液Denhardt′溶液(50X)5gFicoll5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血清白蛋白(BSA;
PentaxFrectionV)加水至總體積500ml20×SSPE20mMEDTA0.16MNaOH0.2M NaH2PO4·H2O3.6MNaCl用NaOH調(diào)至pH7.0
LB(Luria-Bertain)培養(yǎng)基5gBacto-trypton5g酵母提取物2.5gNaCl溶于1升水，并用NaOH調(diào)至pH7.5YPD培養(yǎng)基1%酵母提取物2%Bacto-trypton2%右旋糖YNB培養(yǎng)基6.75g無氨基酸酵母氮源(DIFCO)溶于1升水中SED1M山梨醇25mMEDTA50mMDTT
SCE緩沖液9.1g山梨醇1.47g檸檬酸鈉0.168gEDTA50ml H2O用HCl調(diào)到pH5.8CaS1M山梨醇10mM CaCl2過濾除菌PEG溶液20%聚乙二醇-335010mM CaCl210mMTris·HCl(pH7.4)過濾除菌SOS1M山梨醇0.3×YPD培養(yǎng)基10mM CaCl2甲酰胺染料0.1%XylenecylenolFF混合物0.2%溴酚蘭10mMEDTA95%去離子甲酰胺頂層凝膠76.8g尿素24ml丙烯酰胺貯備液8ml10×TBE加至終體積160ml丙烯酰胺38g丙烯酰胺儲備液2g雙-(N，N′-亞甲雙丙烯酰胺)加水至終體積為100ml底層凝膠14.4g尿素3.0g蔗糖7.5ml10×TBE4.5ml丙烯酰胺儲備液0.3ml溴酚蘭溶液(0.01g/ml)加水至總體積為30ml二脫氧ddATP0.125mMddCTP0.10mMddTTP0.80mM
DNTP儲備液0.5mMdGTP0.5mMdCTP0.5mMTTP0.5mMdATP10XKlenow稀釋緩沖液70mMTris·HCl，pH7.5200mMNaCl70mM MgCl21mMEDTA10XTMD，pH7.50.1MTris·HCl，pH7.50.05M MgCl20.075MDTT除另外具體說明者外，上述溶液均指所使用的基本(Ⅸ)濃度。各實施例中所用的不同濃度是指用基本(Ⅸ)濃度之不同倍數(shù)表示的溶液。
再生瓊脂(1)瓊脂-KCl9g Bacto-瓊脂、13.4g氯化鉀，240mlH2O、高壓滅菌。
(2)10X葡萄糖20g右旋糖、100mlH2O，高壓滅菌。
(3)10X YNB6.75g無氨基酸酵母氮源，100mlH2O、高壓滅菌。(高壓滅菌前或后，加入濃度達200μg/ml任何所需的氨基酸或核酸)。
(4)向240ml熔溶的瓊脂-KCl溶液內(nèi)加入30ml10X葡萄糖和30ml10XYNB。加入0.6ml生物素(0.2mg/ml)和濃度達20μg/ml的任何其他所需氨基酸或核酸。于55°-60℃保持已熔溶的再生瓊脂。
巴斯德畢赤酵母的生長使巴斯德畢赤酵母生長于YPD(富集)或YNB(基本)培養(yǎng)基。必要時可向YNB培養(yǎng)基內(nèi)添加碳源(2%右旋糖、1%甘油或0.5%甲醇)和50μg/ml氨基酸。
順序測定用Sanger等人[PNAS74，5463，(1977)]的雙脫氧核苷酸鏈終止方法進行DNA順序分析。
實施例中使用了下列縮寫符號EDTA乙二胺四乙酸TEMEDN，N，N′，N′-四甲基乙二胺DTT二硫蘇糖醇BSA牛血清白蛋白EtBr溴乙錠Ci居里dATP脫氧腺苷三磷酸dGTP脫氧鳥苷三磷酸TTP胸苷三磷酸dCTP脫氧胞苷三磷酸dXTP“通用”脫氧三磷酸核苷酸寡(dT)12-18購于CollaborativeResearch有限公司Zymolyase60，000購于Miles實驗室公司醇氧化酶Ⅱ調(diào)節(jié)區(qū)的分離實施例ⅠPPFIXKM7121的接合和MC100-3的獲得將得自新鮮YPD平皿的巴斯德畢赤酵母PPF1(arg4his4)(NRRLY-18017)和KM7121(arg4his4aox 1△;;SARG4 aox 2△;;PHIS4)(NRRL Y-18019)分別接種到含無菌水的試管中。混合各菌株的約5×107個細胞，用超聲波簡短地破碎細胞團塊，并散布于GNAP瓊脂平皿(5%右旋糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物、0.5%瓊脂、2.3%蛋白胨、1%酵母提取物、0.5%瓊脂、2.3%營養(yǎng)瓊脂)上。以同樣方法處理各菌株(約1×108個細胞)的未混合的對照樣品。將GNAP平皿于30℃下保溫約24小時，然后復(fù)制在孢子形成培養(yǎng)基瓊脂平皿(0.5%乙酸鈉、1%KCl、2%瓊脂)上。將這些平皿于30℃于保溫約20小時，然后再復(fù)制在不含碳源的基本培養(yǎng)基瓊脂平皿上。以蒸汽相的基本平皿上的細胞提供甲醇。
5天后，在接受了混合細胞的基本平皿上出現(xiàn)了約200個菌落。在未混合的對照平皿上沒有長出菌落，這一結(jié)果提示混合的平皿上的Arg+His+Mut+菌落由PPF1與KM7121細胞(Mut+＝甲醇利用)接合所形成的二倍體。用Southern濾膜雜交法檢驗其中四個菌株的AOX位點，以證實這些Arg+His+Mut+菌株的二倍體性質(zhì)。所使用的特異性探針是p PG3.0(NRRL B-18022)，AOX2的一個特異性探針;p YJ30 pYJ30(NRRL B-15890)，HIS4的一個特異性探針;和p PG4.0(NRRL B-15868)，AOX1的一個特異性探針。
為形成pPF1 X KM7121二倍體孢子，首先從甲醇培養(yǎng)基二倍體選擇平皿中回收一菌落(MC100)。將大約1×106個細胞散布于GNAP平皿上并按上述接合方法處理之，不同的是將孢子形成平皿于30℃下保溫4天，以使細胞完全形成孢子。用5ml無菌水沖洗各平皿以由平皿中回收孢子。將懸浮液用3ml磷酸鹽緩沖液(0.1M Na3PO4、pH7.5)洗兩次。加入終體積分別達2%(v/v)、0.5mg/ml和0.1%的酵母溶胞酶Glusulase(Endo Laboratories，NY)、Zymolyase(60，000單位/克;Miles Laboratories)和β-巰基乙醇的混合物，以破壞營養(yǎng)細胞。混合物于30℃保溫5小時。
然后將孢子制劑在含有0.2%吐溫80(Tween80)(v/v)的無菌水中洗兩次并懸浮于磷酸鹽緩沖液中。再將制劑用超聲波處理三次(每次20秒鐘)以打碎孢子團塊。然后稀釋孢子制劑的樣品，并散布在含2.0%葡萄糖和各50μg/ml精氨酸及組氨酸之基本培養(yǎng)基的無選擇性原始皿上。于30℃下保溫48小時。然后將各原始皿內(nèi)容物復(fù)制輔敷在下述一系列基本平皿上;1)葡萄糖，-arg，-his;2)葡萄糖，-arg，+his;3)葡萄糖，+arg，-his及4)葡萄糖，+arg，+his。
于30℃保溫24小時后，檢查菌落的Arg和His表型。然后劃線接種在YNB甲醇瓊脂平皿上以分析Arg+His-的菌落在甲醇上生長情況。室溫培養(yǎng)約一周后，檢驗平皿上呈現(xiàn)的Mut表型。將一個Arg+His-Mut-菌株定各為MC100-3。
實施例Ⅱ巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化將酵母細胞接種到約10mlYPD培養(yǎng)基中并于30℃下振蕩培養(yǎng)12-20小時。然后將細胞懸浮液稀釋到A600約0.01至0.1，在YPD培養(yǎng)基中30℃保持對數(shù)生長6-8小時。取0.5mlA600約為0.1的種子菌接種在100mlYPD培養(yǎng)基中并于30℃下振蕩培養(yǎng)約12-20小時。當(dāng)A600約為0.2-0.3時(約16-20小時后)，使用DAMONIECDPR-6000型離心機于1500g離心5分鐘，以收獲培養(yǎng)物。
為制備原生質(zhì)球，將細胞在10ml無菌水、10ml新制備的SED及10ml無菌的1M山梨醇中各洗一次(每次洗后均按上述方法離心)，然后重新懸浮于5mlSCE緩沖液中。加入5μl濃度為4mg/ml的Zymolyase60，000(MilesLaboratories)并于30℃下保溫約30分鐘。
按下述方法監(jiān)測原生質(zhì)球的形成。在加入Zymolyase之前或剛剛加入之后以及在保溫期的不同時間，向900μl5%SDS或900μl1M山梨醇內(nèi)分別加入100μl等份的細胞。當(dāng)細胞在SDS中溶胞但不在山梨醇的溶液中溶胞時終止保溫。一旦形成了原生質(zhì)球，即用離心方法(1，000g，5-10分鐘)將其在10ml無菌的1M山梨醇中洗一次，在10ml無菌CaS中洗一次，然后再新懸浮于0.6mlCaS中。
為使轉(zhuǎn)化能真正進行，將溶于水或TE緩沖液內(nèi)的DNA樣品(約體積達20μl)加入12×75mm無菌聚丙烯試管內(nèi)(對于小量DNA，為獲得最大轉(zhuǎn)化率，可在各樣品中使用1μg(濃度為5mg/ml)超聲處理的大腸桿菌DNA)。各DNA樣品內(nèi)加入100μl原生質(zhì)粒，并于室溫下保溫約20分鐘。向各樣品內(nèi)加入1mlPEG溶液并于室溫下保溫約15分鐘。將樣品于1，000g離心5-10分鐘并棄去上清。將細胞沉淀物再懸浮于150μlSOS中并于室溫下保溫30分鐘。各加入850μl無菌的1M山梨醇并按下述方法鋪板。
在轉(zhuǎn)化樣品準備好之前至少30分鐘向各平皿倒入10ml再生瓊脂。在轉(zhuǎn)化樣品處于SOS內(nèi)時，同時向45-50℃水浴中的試管內(nèi)分加10ml等分的再生瓊脂。然后將樣品加入試管內(nèi)，傾注到含有固態(tài)底層瓊脂的平皿上，并于30℃下保溫3-5天。
按下述方法檢測各不同時間原生質(zhì)球的質(zhì)量。取10μl樣品并加入990μl 1M山梨醇將其稀釋100倍。取10μl稀釋液，再加990μl等分的1M山梨醇。各取100μl稀釋液鋪布于YPD瓊脂培養(yǎng)基上，以檢測保留于制制中未形成原生質(zhì)球的完整細胞數(shù)。將各100μl稀釋液加至已添加了40μg/ml宿主所需之所有氨基酸的10ml再生瓊脂中，以檢測總的可再生原生質(zhì)球。用于轉(zhuǎn)化實驗的最佳值是1-3×107個可再生原生質(zhì)球/ml和大約1×103個完整細胞/ml。
實施例ⅢMC100-3(pYM5)的構(gòu)建用BamHⅠ消化約10μg p BR322并使之去磷酸化。用Bg1Ⅱ消化約50μg含有畢赤酵母屬HIS4基因的p YJ8(NRRL B-15889)。自0.8%制備性瓊脂糖凝膠中分離-2.7kbBglⅡ片段。在含有66mM Tris·Cl(pH7.4)、6.6mMMg Cl2、10mM DTT和0.4mM ATP的10μl總體積中使用0.5單體T4DNA連接酶使300ng BglⅡ片段與300ngBamHⅠ消化的p BR322于4℃下連接24小時。
按實施例Ⅴ中所述方法用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061使之成為氨芐青霉素抗性菌株。用限制性酶切方法鑒定轉(zhuǎn)化株，并用瓊脂糖凝膠電泳法鑒別有正確插入片段長度和正確插入方向的轉(zhuǎn)化株。將該質(zhì)粒定名為pYM5，并使用Maniatis等人(Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambroox，J.(1982)，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)所述的堿溶解質(zhì)粒制備技術(shù)由大腸桿菌中回收之。
轉(zhuǎn)化MC100-3之前用StuⅠ消化約10μgpYM5。該步驟在于使質(zhì)粒在MC100-3中一個HIS4基團順序處，即天然HIS4位點或修飾的AOX2位點上進行整合。按實施例Ⅱ中簡述的方法完成轉(zhuǎn)化過程。
按實施例Ⅳ的方法分離幾個MC100-3(p YM5)His+轉(zhuǎn)化株內(nèi)的DNA，并用Southern濾膜雜交法篩選含有在位于AOX2上HIS4片段處整合之p YM5的轉(zhuǎn)化體。所用的特異性探針是pPG3.0(NRRLB-18022)，為AOX2的一個特異性探針;pYJ30(NRRLB-15890)，為HIS4的一個特異性探針。
醇氧化酶Ⅱ調(diào)節(jié)區(qū)的性質(zhì)實施例.Ⅳ酵母DNA制備在加有2%右旋糖的100mlYNB培養(yǎng)基中于30℃下培養(yǎng)酵母細胞，直到A600等于1-2，然后用DamonIECDPR-6000離心機以2，000g離心5分鐘，以沉淀細胞。將細胞團塊在蒸餾水中、SED中、1M山梨醇中相繼各洗一次，然后再懸浮于5ml含0.1MTris·Cl(pH7.0)和1M山梨醇的溶液中。將細胞與50-100μl濃度為4mg/ml的Zymolyase60，000(MilesLaboratories)溶液混合于30℃下保溫1小時。然后將所得原生質(zhì)球以1，000g離心5-10分鐘并懸浮在5ml溶胞緩沖液
中。加入各100μg/ml蛋白酶K(BoehringerMannheim)和RNaseA(Sigma)并將溶液于37℃下保溫30分鐘。該制劑與等體積含有異戊醇的氯仿(1∶24，v/v)輕輕混合，并以12，000g離心20分鐘以分離各相以除去DNA中的蛋白。將上層水相吸入干凈的試管內(nèi)，并用等體積酚/氯仿/異戊醇提取之。按上述方法分離兩相并將上層水相加入含2-3倍體積100%冷乙醇的試管內(nèi)。輕輕混合樣品，并經(jīng)卷繞在塑料棒上以收集DNA。將DNA直接溶解于1mlTE緩沖液中并對100倍體積TE緩沖液透析過夜。
實施例ⅤpMR4的構(gòu)建按實施例Ⅳ的方法自實施例Ⅲ中制得的MC100-3(pYM5)His+轉(zhuǎn)化株分離DNA。用HindⅢ消化10μg該基因組DNA并連接之。使連接反應(yīng)在含66mM Tris·Cl(pH7.4)、6.6mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM ATP和0.5單位T4 DNA連接酶的反應(yīng)混合物中于4℃下進行24小時。
直接用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已按Maniatis人(1982)所述方法制成轉(zhuǎn)化作用感受態(tài)的大腸桿菌MC1061細胞。在添加了50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基(0.2%(NH4)3PO4，1.2%Na2HPO4，0.013%MgSO4·7H2O，0.074%CaCl2·2H2O、1μg/ml硫胺素，0.4%右旋糖)中培養(yǎng)細胞以選擇氨芐青霉素抗性菌株。
按Miniatis等人(1982)所述的方法回收一定名為pMR4的12.0kb質(zhì)粒。該質(zhì)粒含有AOX2KpnⅠ位點的5′端5.3kbDNA、畢赤酵母屬HIS4基因的2.7kb部分和pBR322的4.0kb部分。
實施例ⅥpYJ55的構(gòu)建為檢驗AOX2啟動子的調(diào)節(jié)和表達作用，構(gòu)建-含有與大腸桿菌lac Z基因融合之AOX2 5′順序的載體。按制造者推薦的方法用BglⅡ和BamHⅠ消化50μg p MR4(實施例Ⅴ)。自0.8%制備性瓊脂糖凝膠中分離含有AOX2啟動子的1.8kb BglⅡ-BamHⅠ片段。用BamHⅠ消化10μg p BPf1(NRRL B-15892)并在50μl反應(yīng)體積中使用堿性磷酸酶使之去磷酸化(在50mM Tris·Cl，pH9.0、1mM MgCl2、100μM ZnCl2、1mM亞精胺中于37℃用1單位酶處理1小時)。按下述方法用T4連接酶連接300ng 1.8kb片段和300ng pBPf1。連接反應(yīng)在含有66mM Tris·Cl(pH7.6)、5mMMgCl2、5mM二硫蘇糖醇、1mM ATP和1 Weiss單位T4連接酶的10μl反應(yīng)體積中于23℃下進行1小時，所得載體被定名為p YJ38。
按下述方法在pYJ38中產(chǎn)生一新的SmaⅠ限制性位點。使用AppliedBiosystemsDNA合成儀(380A型)，通過氰乙基氨基磷酸酯化學(xué)合成接頭寡核苷酸;
5′-GATCACCCGGGT-3′用BamHⅠ消化10μg p YJ38并按上述方法用堿性磷酸酶處理之。按上述方法用T4連接酶連接1μg上述接頭和0.1μg BamHⅠ消化的p YJ38。此種經(jīng)修飾的載體被稱為p YJ45。用SmaⅠ消化50μg p YJ45得到含有經(jīng)修飾之AOX2啟動子的1.8kb SmaⅠ片段。由0.8%制備性瓊脂糖凝膠中分離該片段。按上述方法連接0.3μg片段和0.3μg SmaⅠ消化的p BPf1以構(gòu)成載體p YJ46。按上述方法由p YJ46中AOX2片段的5′端刪除-0.3kb EcoRⅠ片段。用EcoRⅠ消化10μg p YJ46并按上述方法用堿性磷酸酶處理之。同時用EcoRⅠ消化另一份50μg p YJ46并由0.8%制備性瓊脂糖凝膠中分離1.5kb片段。連接約各0.3μg磷酸酶處理的p YJ46和分離的1.5kb片段并按上述方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)。分離一具有正確結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒并定名為p YJ55。
實施例Ⅶ菌株GS115(pYJ55)的建立按實施例Ⅱ中所述方法用質(zhì)粒pYJ55(實施例Ⅱ)轉(zhuǎn)化組氨酸營養(yǎng)缺陷型巴斯德畢赤酵母GS115(NRRLY-15851;his 4)。用Southern濾膜雜交法分析得自穩(wěn)定的His+菌株的基因組DNA以確定質(zhì)粒在基因組DNA中的位點。一個含有在HIS4位點整合之p YJ55的轉(zhuǎn)化體被稱為GS115(pYJ55)。
實施例ⅧAOX1和AOX2啟動子的比較經(jīng)檢測菌株GS115(pSAOH5)和GS115(pYJ55)的β半乳糖苷酶活性比較了AOX1和AOX2啟動子調(diào)節(jié)和表達作用。使各菌株的100ml培養(yǎng)物在加有1%甘油的YNB培養(yǎng)基中30℃下生長24小時，然后移入沒有碳源的YNB培養(yǎng)基中于30℃下生長24小時，再移入加有0.5%甲醇的YNB培養(yǎng)基中于30℃生長50小時。于下述不同時間收集各培養(yǎng)物的樣品;1)在甘油培養(yǎng)內(nèi)生長24小時后，2)在無碳源培養(yǎng)基內(nèi)生長24小時后，3)在甲醇培養(yǎng)基內(nèi)生長24和50小時后。分別制備提取物并按下述方法分析β-半乳糖苷酶活性。分析結(jié)果如表2所示。
β-半乳糖苷酶活性分析1)所需溶液Z-緩沖液終濃度
Na2HPO4·7H2O 16.1g 0.06MNaH2PO45.5g 0.04MKCl0.75g0.01MMgSO4·7H2O 0.246g 0.001M2-巰基乙醇2.7ml0.05M加至1升;pH應(yīng)為7鄰-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)將400mgONPG(SigmaN-1127)溶于100ml蒸餾水中，制成4mg/mlONPG溶液2)無細胞蛋白提取物制備各樣品在蒸餾水中洗一次，在溶胞緩沖液中洗一次，并重新懸浮于溶胞緩沖液中(濃度為150A600/ml。向350μl等分樣品內(nèi)加入0.5g玻璃珠，并將混合物在攪拌器上攪拌4次，每次60秒鐘后，置于冰浴間隔一分鐘。從玻璃中分離細胞漿，并在微量管中將懸浮液離心5分鐘。將上清液移入聚丙烯小管中繼續(xù)分析。用Bradford測定法(Bio-Rad)檢測各提取物中的總蛋白量。用BSA作為蛋白質(zhì)標準品。
3)檢測方法
1-50μl無細胞蛋白提取物加入1mlZ緩沖液中。然后攪拌混合物并于30℃下保溫5分鐘。加入0.2μlONPG(4mg/ml)以起始反應(yīng)。適當(dāng)時間后(A420＜1)再加入0.5ml1MNaCO溶液終止反應(yīng)。然后讀出420nm吸光率。
4)β-半乳糖苷酶活性單位的計算1單位＝于30℃和pH7條件下每分鐘形成的1nM鄰位硝酸苯酚(ONP)。1nMONP于420nm處的吸光值(A420)為0.0045(光程長度為1cm)。因此，420nm處吸光值1代表222nMONP/ml，或378nMONP/1.7ml(分析的上清液總體積為1.7ml)。表2中給出的單位數(shù)是按下列公式計算的U＝ (A420)/(t(分鐘)) ×378
權(quán)利要求
1.編碼甲基營養(yǎng)酵母醇氧化酶Ⅱ調(diào)節(jié)區(qū)的DNA順序，所說的調(diào)節(jié)區(qū)對作為宿主唯一碳源之甲醇的存在起反應(yīng)，且其中所說的順序是包含于如圖1(b)限制性酶切圖譜所示的5′端第一個EcoRI位點與AOX2結(jié)構(gòu)基因起始密碼子之間的順序和其功能性突變順序。
2.編碼酵母醇氧化酶Ⅱ調(diào)節(jié)區(qū)的DNA順序，其中所說的DNA順序是-1490-1470TCCATCTTCTACGGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTAT-1450-1430-1410CTTGATTCTTTTATGATTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACT-1390-1370-1350TAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACA-1330-1310-1290GATTGTGATCAAGAAGCAGAGACAATCACCACTAAGGTTGCACATTTGAGCCAGTAGGCT-1270-1250-1230CCTAATAGAGGTTCGATACTTATTTTGATAATACGACATATTGTCTTACCTCTGAATGTG-1210-1190-1170TCAATACTCTCTCGTTCTTCGTCTCGTCAGCTAAAAATATAACACTTCGAGTAAGATACG-1150-1130-1110CCCAATTGAAGGCTACGAGATATCAGACTATCACTAGTAGAACTTTGACATCTGCTAAAG-1090-1070-1050CAGATCAAATATCCATTTATCCAGAATCAATTACCTTCCTTTAGCTTGTCGAAGGCATGA-1030-1010-990AAAAGCTACATGAAAATCCCCATCCTTGAAGTTTTGTCAGCTTAAAGGACTCCATTTCCT-970-950-930AAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTT-910-890-870CATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAA-850-830-810CCCCTCAATTTTCCATCCAAGGGCGATCCTTACAAAGTTAATATCGAACAGCAGAGACTA-790-770-750AGCGAGTCATCATCACCACCCAACGATGGTGAAAAACTTTAAGCATAGATTGATGGAGGG-730-710-690TGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGAGTTTGAAACTATGGGGTAATACATCACATCCGG-670-650-630AACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCAAAGCACGTGATGTACCCCGTAAACTGCTCGGA-610-590-570TTATCGTTGCAATTCATCGTCTTAAACAGTACAAGAAACTTTATTCATGGGTCATTGGAC-550-530-510TCTGATGAGGGGCACATTTCCCCAATGATTTTTTGGGAAAGAAAGCCGTAAGAGGACAGT-490-470-450TAAGCGAAAGAGACAAGACAACGAACAGCAAAAGTGACAGCTGTCAGCTACCTAGTGGAC-430-410-390AGTTGGGAGTTTCCAATTGGTTGGTTTTGAATTTTTACCCATGTTGAGTTGTCCTTGCTT-370-350-330CTCCTTGCAAACAATGCAAGTTGATAAGACATCACCTTCCAAGATAGGCTATTTTTGTCG-310-290-270CATAAATTTTTGTCTCGGAGTGAAAACCCCTTTTATGTGAACAGATTACAGAAGCGTCCT-250-230-210ACCCTTCACCGGTTGAGATGGGGAGAAAATTAAGCGATGAGGAGACGATTATTGGTATAA-190-170-150AAGAAGCAACCAAAATCCCTTATTGTCCTTTTCTGATCAGCATCAAAGAATATTGTCTTA-130-110-90AAACGGGCTTTTAACTACATTGTTCTTACACATTGCAAACCTCTTCCTTCTATTTCGGAT-70-50-30CAACTGTATTGACTACATTGATCTTTTTTAACGAAGTTTACGACTTACTAAATCCCCACA-10AACAAATCAACTGAGAAAA和其功能性突變順序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA順序，其中所說的順序被可操作地連接于異源基因上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA順序，其中所說的順序被可操作地連接到異源基因上。
5.基本上純的巴斯德畢赤酵母菌株，其為精氨酸原養(yǎng)型、組氨酸營養(yǎng)缺陷型的，并且不能利用甲醇作為碳源。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的菌株，其中所說的菌株是MC100-3。
全文摘要
一個含有來源于巴斯德畢赤酵母第二醇氧化酶基因調(diào)節(jié)區(qū)(Pichia Pastoris)的新的DNA順序，以及含有可操作地連接于異源DNA結(jié)構(gòu)基因上之所說調(diào)節(jié)區(qū)的新的DNA構(gòu)建物。
文檔編號C12N15/00GK1039616SQ8910425
公開日1990年2月14日 申請日期1989年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1988年6月24日
發(fā)明者詹姆斯·邁克爾·克里格 申請人:菲利浦石油公司