專利名稱：類固醇生物化學(xué)氧化的方法和用于此方法中的遺傳工程方法產(chǎn)生的細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備藥學(xué)上有用的類固醇的生物化學(xué)氧化方法。
11β，17α，21-三羥基-4-孕甾-3，20-二酮(氧化可的松)是一種重要的藥用類固醇，由于它的藥理性質(zhì)，可將其作為皮質(zhì)甾類使用和作為制備許多有用類固醇(特別是其它皮質(zhì)甾類)的起始化合物。氫化可的松由脊椎動物的腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生，通過繁雜的提取方法從腎上腺皮質(zhì)組織中只能原始地得到很少的量，只有在闡明結(jié)構(gòu)后，才發(fā)展出一些新的生產(chǎn)途徑，這些途徑的特點是化學(xué)合成步驟與微生物轉(zhuǎn)變相結(jié)合。只是因為所采用的初始化合物如甾醇、膽汁酸和皂草配基豐富而且便宜，目前的這些方法提供了不太昂貴的產(chǎn)品，但是這些方法仍然相當(dāng)復(fù)雜。設(shè)想了幾種改進(jìn)現(xiàn)行方法的可能性，生物化學(xué)的方法也已進(jìn)行過嘗試。
有一種嘗試是使用分離的腎上腺皮質(zhì)蛋白(這些蛋白已知是與類固醇在體內(nèi)的酶學(xué)轉(zhuǎn)化有關(guān))的一個體外生物化學(xué)系統(tǒng)，將一合適的初始類固醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松。然而，分離這些重要蛋白的困難性和必需的輔助因子的昂貴價格看來使有經(jīng)濟(jì)吸引力的大規(guī)模生產(chǎn)不能實現(xiàn)。另一種方法是將催化酶保留在其天然環(huán)境中并在細(xì)胞培養(yǎng)中使腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生所需的氫化可的松。但是，由于在實踐中這些細(xì)胞的繁殖率低，要使得這樣一種生化方法在經(jīng)濟(jì)上具有吸引力看來也是不可能的。
哺乳動物和其它脊椎動物腎上腺皮質(zhì)中的體內(nèi)過程構(gòu)成了一種生化途徑，它是以膽甾醇開始的，經(jīng)由各種中間產(chǎn)物最終得到氫化可的松(見

圖1)。這種途徑中涉及8種蛋白質(zhì)，其中有5種是酶，而4種是細(xì)胞色素P450酶，其它3種是電子轉(zhuǎn)移蛋白。
第一步是膽甾醇向3β-羥基-5-孕甾-20-酮(孕烯醇酮)的轉(zhuǎn)化。在這種轉(zhuǎn)化中(即一種單氧化酶反應(yīng))，涉及三種蛋白質(zhì)側(cè)鏈裂解酶(P450SCC，一種含亞鐵原卟啉-鐵的蛋白)，腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白(ADX，一種含F(xiàn)e2S2的蛋白)和腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(ADR，一種含F(xiàn)AD的蛋白)。此外，以膽甾醇作為底物的反應(yīng)進(jìn)一步需要分子氧和NADpH。
接著是通過脫氫作用/異構(gòu)作用將孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為4-孕甾-3，20-二酮(孕酮)。該反應(yīng)由蛋白質(zhì)3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶(3β-HSD)催化，它需要孕烯醇酮和NAD+。
為了得到氫化可的松，再在孕酮的三個位置進(jìn)行羥化，這種轉(zhuǎn)化由單氧化酶催化。在孕酮轉(zhuǎn)化為17α-羥基孕甾酮時涉及兩種蛋白質(zhì)類固醇17α-羥化酶(P45017α，一種含亞鐵原卟啉-鐵的蛋白)和NADPH細(xì)胞色素P450還原酶(RED，一種含F(xiàn)AD-和FMN的蛋白質(zhì))。該反應(yīng)消耗孕酮，分子氧和NADPH。17α-羥基孕酮轉(zhuǎn)化為17α-21-二羥基-4-孕甾-3，20-二酮(去氧可的松)時也需要兩種蛋白質(zhì)類固醇-21-羥化酶(P450C21，一種含亞鐵原卟啉-Fe的蛋白質(zhì))和前面提及的蛋白質(zhì)RED。該反應(yīng)消耗17α-羥基孕酮，分子氧和NADPH。去氧可的松轉(zhuǎn)變?yōu)闅浠傻乃缮婕叭N蛋白質(zhì)類固醇11β-羥化酶(P45011β，一種含亞鐵原卟啉-Fe的蛋白質(zhì))和上面提及的蛋白質(zhì)ADX和ADR。
如上所述細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)是膽甾醇向氫化可的松進(jìn)行生化轉(zhuǎn)化所必須的酶。這些酶隸屬于細(xì)胞色素P450蛋白類(或簡稱P450蛋白質(zhì))的一個更大的組群，它們已經(jīng)在原核生物(各種細(xì)菌)和真核生物(酵母、霉菌、植物和動物)中遇見過，發(fā)現(xiàn)在哺乳動物的腎上腺皮質(zhì)、卵巢、精巢和肝中，P450蛋白質(zhì)含量較高。許多P450蛋白已進(jìn)行了純化及對其特性進(jìn)行了很好的描述，它們的特異活性已被測定，最近已經(jīng)發(fā)表了許多有關(guān)這方面的評述，如K.Ruckpaul和H.Rein(編)，“細(xì)胞色素P450”和P.R.Ortiz de Montellano(編)“細(xì)胞色素P450、結(jié)構(gòu)、機(jī)制和生物化學(xué)”。細(xì)胞色素P450蛋白的特征在于用一氧化碳還原后，在450nm處的特異性最大吸收。在原核生物中，P450蛋白質(zhì)既可和膜結(jié)合也可存在于細(xì)胞質(zhì)中，就目前已經(jīng)對細(xì)菌P450蛋白的詳細(xì)研究(如P450meg和P450cam)表明，在其羥化活性中涉及到一種鐵氧還蛋白和一種鐵氧還蛋白還原酶。對真核生物的兩類P450蛋白質(zhì)，Ⅰ和Ⅱ型已經(jīng)進(jìn)行了描述，兩者的不同點在于1.亞細(xì)胞定位Ⅰ型位于微粒體部分而Ⅱ型位于線粒體內(nèi)膜上。2.將電子轉(zhuǎn)遞給P450蛋白的途徑Ⅰ型通過NADPH由P450還原酶還原，而Ⅱ型則通過NADPH由鐵氧還蛋白還原酶(如腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶)和鐵氧還蛋白(如腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白)還原。
根據(jù)EP-A-0281245，細(xì)胞色素P450酶可從鏈霉菌屬菌種制備并用于化合物的羥化作用。
該酶以分離形式使用，它是一個相當(dāng)麻煩和昂貴的方法。
JP-A-62236485(德溫特87-331234)中指出可以將肝細(xì)胞色素P450酶的基因?qū)肫【平湍妇胁⒈磉_(dá)這些基因，以此提供可利用它們的氧化活性的酶。
然而，在上述文獻(xiàn)中沒有說明用細(xì)胞色素P450酶來制備類固醇化合物。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)蛋白質(zhì)的多重表達(dá)基因盒，這些基因盒是構(gòu)建一步就能將不貴的類固醇起始物轉(zhuǎn)化為更稀有和昂貴的最終產(chǎn)物的多基因系統(tǒng)必須的，在其中，這種轉(zhuǎn)化是在一些天然系統(tǒng)中通過多酶催化和輔助因子中介的轉(zhuǎn)化完成的，如從膽甾醇生產(chǎn)氫化可的松。本發(fā)明的表達(dá)基因盒在最終產(chǎn)生進(jìn)行這些多步轉(zhuǎn)化的多基因系統(tǒng)中是有用的。
因此，一方面，本發(fā)明與在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)異源編碼DNA序列起作用的表達(dá)基因盒有關(guān)。這里所說的編碼序列編碼了一種酶，該酶能單獨地或與另外的蛋白質(zhì)一起，催化膽甾醇轉(zhuǎn)化成氫化可的松的生物途徑中的氫化步驟。因此，本發(fā)明的表達(dá)基因盒包括了在重組宿主中能產(chǎn)生下列蛋白質(zhì)的基因盒，這些蛋白質(zhì)是側(cè)鏈裂解酶(P450SCC);腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白(ADX);腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(ADR);3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶(3β-HSD);類固醇17α-羥化酶(P45017α);NADpH細(xì)胞色素P450還原酶(RED);類固醇-21-羥化酶(P450C21);和類固醇11β-羥化酶(P45011β)。
另一方面，本發(fā)明涉及用本發(fā)明表達(dá)基因盒轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞、生產(chǎn)上述酶和用它們進(jìn)行氧化作用的方法、在培養(yǎng)肉湯中使用所述宿主細(xì)胞進(jìn)行特異氧化的方法和含有用所述方法制備的化合物的藥物組合物。
附圖中所用的縮寫R1，EcoRⅠ;H，HindⅢ;Sc，ScaⅠ;P，PstⅠ;K，KpnⅠ;St，StuⅠ;Sp，SphⅠ;X，XbaⅠ;N，NdeⅠ;S，SmaⅠ;Ss，SstⅠ;Rv，EcoRⅤ;SI，SacⅠ;B，BamHⅠ;SⅡ，SacⅡ;Sal，SalⅠ;Xh，XhoⅠ;Pv，PvuⅡ;Bg，BglⅡ和M，MluⅠ。
圖1表示的是在哺乳動物的腎上腺皮質(zhì)中膽甾醇向氫化可的松轉(zhuǎn)化中各接連步驟所涉及的蛋白質(zhì)的圖解。
圖2表示質(zhì)粒PGBSCC-1的構(gòu)建，P450SCC序列用方框(
)表示。
圖3表示將含有5′-P450SCC-序列的合成衍生的PstⅠ/HindⅢ片段插入質(zhì)粒PTZ18R得到質(zhì)粒PTZsynlead。
圖4表示將合成的P450SCCcDNA全長(
)和用cDNA克隆(
)衍生的P450SCC序列構(gòu)建到PTZ18R中得到PGBSCC-2。
圖5表示質(zhì)粒PBHA-1的完整的核苷酸序列。
圖6是PGBSCC-3構(gòu)建的圖解描述。將來自質(zhì)粒PGBSCC-2的P450SCCcDNA序列導(dǎo)入桿菌屬/大腸桿菌的往返復(fù)粒PBHA-1。方框中充填的如圖4圖解中指出的一樣。
圖7表示將一個NdeⅠ限制性位點與P450SCC成熟位點前的一個ATG起始密碼子一起導(dǎo)入到PGBSCC-3中得到PGBSCC-4。
圖8表示PGBSCC-5的物理圖，該質(zhì)粒通過從質(zhì)粒PGBSCC-4去除E.Coli序列而得到。
圖9表示用抗體對P450SCC進(jìn)行探針Western印跡分析，分析證明了導(dǎo)入到枯草桿菌(行C)和地衣型芽胞桿菌(行f)中的質(zhì)粒PGBSCC-5的P450SCC表達(dá)。從枯草桿菌和地衣型芽胞桿菌得到的對照提取物分別表示在行a和d中。作為對照，純化的腎上腺皮質(zhì)P450SCC(30ng)也加入到這些對照提取物中(分別為行b和e)。
圖10是PGBSCC-17構(gòu)建的圖解描述。將來自質(zhì)粒PGBSCC-4的編碼P450SCC-DNA的序列導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)載體PTZ18RN。方框(
)中表示P450SCC序列。
圖11表示大腸桿菌JM101中PGBSCC-17的P450SCC的表達(dá)。
(a)對從大腸桿菌對照菌株(行3)和大腸桿菌轉(zhuǎn)化株SCC-301和302(分別為行1和2)制備的細(xì)胞蛋白部分(20μl)的SDS/PAGE和考馬斯亮蘭染色。400ng純化的牛P450SCC(行4)在圖中作為對照。
(b)用抗體對由對照菌株大腸桿菌JM101(行2)和由大腸桿菌轉(zhuǎn)化株SCC-301(行3)和SCC-302(行4)制備的細(xì)胞蛋白部分(5μl)的P450SCC進(jìn)行探針Western印跡分析。100ng純化牛P450SCC(行1)作為對照。
圖12表示質(zhì)粒PUCG418的構(gòu)建。
圖13表示通過將帶有乳糖酶多克隆位點(
)的啟動子和終止區(qū)插入PUCG418構(gòu)建酵母表達(dá)載體PGB950。為了得到PGBSCC-6，將含有ATG起始密碼子的合成SalⅠ/XhoⅠ片段和P450SCC的前8個氨基酸的密碼子插入PGB950。
圖14是一個圖解描述，表示酵母P450SCC表達(dá)基因盒PGBSCC-7的構(gòu)建。
圖15表示用蛋白P450SCC的特異性抗體探針得到的Western印跡分析。
印跡A含有的提取物來自用PGBSCC-10轉(zhuǎn)化的啤酒酵母273-10B(行1);來自作為對照的啤酒酵母273-10B(行2)，來自用PGBSCC-7轉(zhuǎn)化的KluyveromyceslactisCBS2360(行3)和來自作為對照的K.lactisCBS2360(行4)。印跡B包含的提取物來自作為對照的K.lactisCBS2360(行1)和用PGBSCC-15(行2)、PGBSCC-12(行3)或PGBSCC-7(行4)轉(zhuǎn)化的K.lactisCBS2360。印跡C包含的提取物來自作為對照的啤酒酵母273-10B(行1)，來自用PGBSCC-16(行2)或PGBSCC-13(行3)轉(zhuǎn)化的啤酒酵母273-10B。
圖16是構(gòu)建含有來自啤酒酵母等細(xì)胞色素CI(cyc-1)啟動子的酵母表達(dá)載體PGBSCC-9的圖解表示。
圖17表示含有啤酒酵母表達(dá)載體PGBSCC-10的P450SCCcDNA的構(gòu)建圖。
圖18表示P450SCC表達(dá)載體PGBSCC-12的構(gòu)建，其中合成獲得的編碼前-P450SCC序列(
)的DNA-片段是在成熟P450SCC的編碼序的5′端插入的。
圖19表示PGBSCC-13的構(gòu)建。這個用于啤酒酵母的P450SCC表達(dá)基因盒在啤酒酵母cyc-1啟動子的3′端有前-P450SCCcDNA序列。
圖20是質(zhì)粒PGBSCC-14和PGBSCC-15構(gòu)建的圖解表示，后者含有在框內(nèi)的P450SCC編碼序列和細(xì)胞色素氧化酶Ⅵ前序列(
)。
圖21表示質(zhì)粒PGBSCC-16的構(gòu)建，在該質(zhì)粒中，啤酒酵母的細(xì)胞色素氧化酶Ⅵ前序列
在cyc-1啟動子的3′端與編碼P450SCC序列融合。
圖22表示質(zhì)粒PGB17α-1(A)和PGB17α-2(B)的物理圖，該兩質(zhì)粒分別含有P45017αcDNA的3′端1.4Kb片段和5′端345bp片段
。在含有P45017αcDNA序列完整長度的PGB17α-3(C)中，表示出了ATG起始密碼子的位置。
圖23表示通過離體誘變得到的PGB17α-3的突變。得到的質(zhì)粒PGB17α-4含有SalⅠ限制性位點，其后是合適的酵母翻譯信號，它正好在ATG起始密碼的上游。
圖24是酵母P45017α表達(dá)基因盒PGB17α-5的構(gòu)建圖解。
圖25表示通過離體誘變得到的PGB17α-3的突變。獲得的質(zhì)粒PGB17α-6在ATG起始密碼子處有一個NdeⅠ限制性位點。
圖26是PGB17α-7構(gòu)建的圖解說明，將來自質(zhì)粒PGB17α-6的P45017αcDNA序列導(dǎo)入桿菌屬/大腸桿菌往返質(zhì)粒PBHA-1中。
圖27表示PGB17α-8的物理圖，這種質(zhì)粒是從質(zhì)粒PGB17α-7中除去大腸桿菌序列而獲得的。
圖28表示PGBC21-1和-2的物理圖，此兩質(zhì)粒在克隆載體PTZ18R的EcoRⅠ位上分別含有1.53Kb的3′-P450C21cDNA和540bp的5′-P450C21cDNAEcoRⅠ片段。
圖29表示通過PGBC21-2的多聚酶的鏈反應(yīng)(PCR)。將EcoRⅤ和NdeⅠ限制性位點導(dǎo)入P450C21ATG起始密碼子的上游進(jìn)行離體突變。再用分子克隆克隆到克隆載體PSP73中得到PGBC21-3。
圖30是含有全長P450C21cDNA序列的PGBC21-4構(gòu)建圖。
圖31是構(gòu)建PGBC21-5的圖解描述，將來自質(zhì)粒PGBC21-4的P450C21cDNA序列導(dǎo)入桿菌屬/大腸桿菌往返質(zhì)粒(Shuttle Plasma)PBHA-1。
圖32表示PGBC21-6的物理圖，它是從質(zhì)粒PGBC21-5除去大腸桿菌序列得到的。
圖33表示通過離體誘變得到的PGBC21-2的突變，所獲得的質(zhì)粒PGB21-7含有一個SalⅠ限制性位點，其后為合適的酵母翻譯信號，它正好在ATG起始密碼的上游。
圖34表示PGBC21-8的構(gòu)建，該質(zhì)粒含有適合于克隆到酵母表達(dá)載體上的具有修飾的側(cè)面限制性位點的全長度P450C21cDNA。
圖35是構(gòu)建酵母P450C21表達(dá)基因盒PGBC21-9的圖解描述。
圖36表示的是離體誘變，即通過PGB11β-1的聚合酶的鏈反應(yīng)，將合適的側(cè)面限制性位點和ATG起始密碼導(dǎo)入全長的P45011βcDNA序列中，再分子克隆到桿菌/大腸桿菌往返載體PBHA-1中，得到質(zhì)粒PGB11β-2。
圖37表示通過PGB11β-1的聚合酶的鏈反應(yīng)，將合適的側(cè)面限制性位點和ATG起始密碼導(dǎo)入整長的P45011βcDNA序列中進(jìn)行離體誘變，再分子克隆到酵母表達(dá)載體PGB950中，得到質(zhì)粒PGB11β-4。
圖38是通過聚合酶鏈反應(yīng)，從牛腎上腺皮質(zhì)多聚A+RNA/cDNA混合物得到的ADXcDNA進(jìn)行分子克隆的圖解說明。將編碼成熟ADX蛋白的cDNA序列插入酵母表達(dá)載體PGB950合適的位點，得到質(zhì)粒PGBADX-1。
圖39表明了用ADX的抗體探針得到的Western印跡分析，證明了在K.lactsCBS2360轉(zhuǎn)化株ADX-101和102(分別為行4和5)中質(zhì)粒PGBADX-1的ADX表達(dá)，對照菌株K.latisCBS2360的提取物在行3中表示，為了比較，在行1中對凝膠還提供了純化的腎上腺皮質(zhì)ADX(100ng)。
圖40表示了通過PGBADR-1的聚合酶的鏈反應(yīng)，將合適的側(cè)面限制性位點和ATG起始密碼子導(dǎo)入全長的ADRcDNA序列中進(jìn)行離體誘變，再分子克隆到酵母表達(dá)載體PGB950中，產(chǎn)生質(zhì)粒PGBADR-2。
本發(fā)明包括制備和培養(yǎng)適合于在大規(guī)模生化生產(chǎn)反應(yīng)器中采用的細(xì)胞，以及使用這些細(xì)胞進(jìn)行化合物的氧化作用，尤其是用于如圖1所示的類固醇的生產(chǎn)，圖示的每個反應(yīng)可分別進(jìn)行，本發(fā)明也包括了在一個多步反應(yīng)中一些步驟的相互交換。優(yōu)選的宿主是微生物，但是也可利用其他細(xì)胞，如可以是在細(xì)菌培養(yǎng)中或活的轉(zhuǎn)移基因動植物或動物組織中的植物或動物細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞是通過用載體對合適的受體細(xì)胞(最好是合適的微生物細(xì)胞)的遺傳學(xué)轉(zhuǎn)化作用獲得，這種含有編碼了與膽甾醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松有關(guān)的蛋白質(zhì)的DNA序列，這些蛋白包括側(cè)鏈裂解酶(P450SCC)、腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白(ADX)、腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(ADR)、3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶(3β-HSD)、類固醇-17α-羥化酶(P45017α)，NADPH細(xì)胞色素P450還原酶(RED)。類固醇-21-羥化酶(P450C21)和類固醇-11β-羥化酶(P45011β)。有些宿主細(xì)胞它們本身已經(jīng)可以以足夠的水平產(chǎn)生一種或多種必須蛋白質(zhì)，因此，只需用補充的DNA序列轉(zhuǎn)化它們。這種自身可產(chǎn)生的蛋白質(zhì)為鐵氧還蛋白，鐵氧還蛋白還原酶、P450還原酶、和3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶。
已經(jīng)選擇了一些合適的DNA源來補償編碼子與膽甾醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松有關(guān)的蛋白的序列。補充編碼了與膽甾醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松有關(guān)的所有蛋白的DNA的合適源是脊椎動物的腎上腺皮質(zhì)組織，如牛腎上腺皮質(zhì)組織。各種微生物的有關(guān)的DNA也能補充，如來自睪丸素假單胞菌(Pseudomas Testosteroni)，灰色肉性鏈霉菌(Streptomyces griseocarneus)或類固醇短頸細(xì)菌(Brevibacterium sterolicum)的DNA用于編碼3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶和來自Curvularia lunata或布累克氏瘦克銀漢霉菌(Cunninghamella blakesleeana)的DNA用于編碼與11β-脫氧皮甾醇的11β-羥化作用有關(guān)的蛋白質(zhì)。分離編碼了牛P450SCC、牛P45011β蛋白或微生物相當(dāng)?shù)牡鞍?、牛腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白、牛腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶、3β-羥基類固醇脫氧酶/異構(gòu)酶(牛的或微生物的)、牛P45017α、牛P450C21和牛的或微生物的NADPH細(xì)胞色素、P450還氧酶的DNA序列的步驟如下1.真核序列(cDNA′s)
a.由合適的組織制備全部RNAb.將含RNA的多聚A+轉(zhuǎn)錄成雙股cDNA，連接到噬菌體載體中。
c.得到的cDNA庫用32P標(biāo)記的、對所需cDNA特異的寡聚物進(jìn)行篩選，選出所需的cDNA或用一種特異性(125I標(biāo)記了的)抗體對異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖(IPTG)誘導(dǎo)的λ-gtllcDNA庫進(jìn)行篩選。
d.根據(jù)形成的陽性噬菌斑數(shù)(Pfu′s)來證明cDNA插入部分插入合適載體-用核菌酶定序法得到的cDNA的整長2.原核基因a.由一個合適的微生物制備基因組DNA。
b.為了得到DNA庫，將DNA片段克隆到合適載體中，并對一種合適的大腸桿菌宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
c.得到的DNA庫用32P標(biāo)記的對目的基因特異的寡聚物進(jìn)行篩選或用一種特異(125I標(biāo)記了的)抗體對IPTG誘導(dǎo)的λ-gtllcDNA進(jìn)行篩選。
d.分離陽性克隆的質(zhì)粒，將插入的DNA片段亞克隆入合適的載體內(nèi)來證明-基因的整個長度注根據(jù)改進(jìn)的方法，通過被稱為聚合酶的鏈反應(yīng)(PCR)(Saiki等人，Science，239，487-491，1988)的方法，用兩種特異寡聚物放大本發(fā)明目的的cDNA(真核生物序列)或基因(原核生物序列)。然后，再將擴(kuò)大的cDNA或DNA插入合適的載體。
本發(fā)明的一方面提供了合適的表達(dá)基因盒，這些基因盒的異源DNA是用前面的步驟分離的，并被放在適當(dāng)?shù)目刂菩蛄兄g以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯，使得DNA在一個合適宿主的細(xì)胞環(huán)境中被表達(dá)，提供所需的一種或多種蛋白質(zhì)。也可以在這些起始控制序列后有一個分泌信號序列。
通過所述的表達(dá)基因盒必須把合適控制序列導(dǎo)入結(jié)構(gòu)DNA中，通過合適宿主細(xì)胞和含有控制序列(它與相關(guān)宿主一致，可操縱地與所需表達(dá)的編碼序列連接)的載體轉(zhuǎn)化作用，可以進(jìn)行表達(dá)。
另外，采用了存在于宿主基因組中合適的控制序列。通過合適宿主細(xì)胞和含所需要的蛋白編碼序列的載體的轉(zhuǎn)化作用也可進(jìn)行表達(dá)。這些編碼序列與宿主基因組同源重組的宿主序列是側(cè)面連接的，并使宿主控制序列適當(dāng)?shù)乜刂茖?dǎo)入DNA的表達(dá)。
作為總的理解，術(shù)語控制序列包括對可操縱地連于其上的編碼序列表達(dá)的合適調(diào)節(jié)是必要的所有的DNA片段如操縱子、促進(jìn)子和尤其是啟動子和控制轉(zhuǎn)錄的序列。
啟動子可受或可以不受調(diào)節(jié)它的環(huán)境控制，原核生物的合適啟動子有如trp啟動子(由色氨酸的喪失來誘導(dǎo))、lac啟動子(由乳糖類似物IPTG誘導(dǎo))、β-乳胺酶(β-Lactamase)啟動子和噬菌體衍生的PL啟動子(由溫度變化誘導(dǎo))。此外，尤其適用于在桿菌中表達(dá)的有用啟動子有α-淀粉酶、蛋白酶、Spoz、Spac和φ105的啟動子以及合成的啟動子序列。優(yōu)選的啟動子是在圖5中表示的啟動子，用“HpaⅡ”表示。適合于在酵母中表達(dá)的合適啟動子有3-磷酸甘油酸激酶啟動子及其其他糖酵解酶的啟動子和乙醇脫氫酶和酵母磷酸酶的啟動子。轉(zhuǎn)錄延長因子(TEF)和乳酸酶的啟動子也是合適的，哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)通常采用來自病毒的啟動子(如腺病毒啟動子和SV40啟動子)，但是它們還包括可調(diào)節(jié)啟動子(如金屬硫因啟動子，它由重金屬或糖皮質(zhì)激素的濃度控制)?，F(xiàn)在，以病毒為基礎(chǔ)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和以如nopaline合成酶啟動子這樣的植物細(xì)胞啟動子的表達(dá)系統(tǒng)也是適宜的。
轉(zhuǎn)譯控制序列在原核生物系統(tǒng)中有一個核結(jié)合位點(RBS)，而在真核生物系統(tǒng)中轉(zhuǎn)譯可由含如AUG那樣的啟始密碼子的核苷酸序列來控制。
除了必須的啟動子和轉(zhuǎn)譯控制序列外，許多其他控制序列，包括調(diào)節(jié)終止(如真核生物系統(tǒng)中的多聚腺苷作用序列)可用于控制表達(dá)。某些系統(tǒng)含有促進(jìn)子元素，這些元素是在實現(xiàn)表達(dá)時可以是希望的但大部分不是必須的。
本發(fā)明還公開了還含有另外一個異源編碼序列的表達(dá)基因盒，這個異源編碼序列編碼了一種酶，它能單獨地或與一種或多種其他蛋白共同催化圖1途徑的另一個步驟。
用PGBSCC-n表示的載體組，這里的“n”為1至17的任何整數(shù)，這些載體專門開發(fā)用在編碼P450SCC酶的DNA。
用PGB17α-n表示的另一組載體，這里的“n”表示1至5的任何整數(shù)，它們專門開發(fā)用于編碼P45017α酶的DNA。
還有一組用PGBC21-n表示的載體，這里的“n”是1至9的任一整數(shù)，它們專門開發(fā)用于編碼P450C21的酶的DNA。
還有另一組用PGB11β-n表示的載體。這里的“n”是1至4的任一整數(shù)，它們專門開發(fā)用于編碼P45011β酶的DNA。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個方面，已選擇了能接受本發(fā)明的載體并使得導(dǎo)入的DNA表達(dá)的合適宿主細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時，與膽甾醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松有關(guān)的蛋白質(zhì)出現(xiàn)在其細(xì)胞組成中?？捎肈NA雜交方法證明所需DNA的存在，用RNA雜交方法證明它們的轉(zhuǎn)錄，通過免疫法證明它們的表達(dá)和在體外或體內(nèi)與起始化合物一起保溫后評定氧化產(chǎn)物的存在，證明它們的活性。
轉(zhuǎn)化的微生物是那些優(yōu)選的宿主，尤其是細(xì)菌(更優(yōu)選的是大腸桿菌和桿菌屬和鏈球菌屬的菌株和酵母(如酵母屬和Kluyveromy-ces)。在植物和動物(包括昆蟲)中找到其它合適的宿主生物，它們的分離出來的細(xì)胞用于細(xì)胞培養(yǎng)，如Cos細(xì)胞、C127細(xì)胞、CHO細(xì)胞和Spodoptera frugrperda(Sfg)細(xì)胞。另外還可采用轉(zhuǎn)化基因的動物或植物。
特殊類型的重組宿主細(xì)胞是導(dǎo)入本發(fā)明的兩個或更多個表達(dá)基因盒或者已由一個至少編碼了兩種異源蛋白的表達(dá)基因盒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，使得細(xì)胞能產(chǎn)生至少兩種與圖1中途徑有關(guān)的兩種蛋白。
本發(fā)明的一個主要特點是制備的新的細(xì)胞不僅能產(chǎn)生類固醇氧化轉(zhuǎn)化作用、最終得到氫化可的松有關(guān)的蛋白質(zhì)，而且完全能將這些蛋白用于加至培養(yǎng)液中的相應(yīng)的底物化合物預(yù)期的氧化轉(zhuǎn)化。類固醇是優(yōu)選的底物，用異源DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞尤其適用于用圖1中提到的類固醇培養(yǎng)，包括其他的甾醇如β-谷甾醇。結(jié)果獲得被氧化的類固醇。
根據(jù)存在于宿主細(xì)胞中的編碼了與圖1途徑有關(guān)的蛋白質(zhì)的多重異源DNA，得到包括甾醇的側(cè)鏈裂解和/或C11，C17，C3和C21上的氧化修飾的幾個生物化學(xué)轉(zhuǎn)變作用。所以，本發(fā)明的表達(dá)基因盒在構(gòu)建一個多基因系統(tǒng)中是有用的，該系統(tǒng)能很快實現(xiàn)圖1中表示的多步驟中接連的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化作用，導(dǎo)入一些所需的宿主表達(dá)基因盒可能是必須的，全部基因盒編碼了所需的蛋白質(zhì)。在某些情況中，所述途徑涉及的一種或多種蛋白質(zhì)可能已存在于宿主中作為天然蛋白發(fā)揮相同的活性作用。例如在宿主中可能已經(jīng)存在鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶和P450還原酶。在那些情況下，只有剩下的酶才必須通過重組轉(zhuǎn)化作用提供。
作為體內(nèi)生化轉(zhuǎn)化的一個替換方法，收集與膽甾醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松有關(guān)的蛋白質(zhì)，必要時純化，用于無細(xì)胞系統(tǒng)的類固醇的體外轉(zhuǎn)化(如在一個柱上固定化)。另外，含有一種或多種途徑的酶的一定程度純化的混合物本身被用于類固醇轉(zhuǎn)化。一個示例性的宿主含有編碼了兩種異源蛋白質(zhì)的DNA，即對產(chǎn)生孕酮所必須的酶P450SCC和蛋白質(zhì)ADX的DNA。與只有P450SCCDNA的宿主相比較，在加入ADR、NADPH和膽甾醇后的一個無細(xì)胞提取物中的孕酮產(chǎn)量大大提高。
本發(fā)明提供了一些構(gòu)建幾種有用類固醇的一步生產(chǎn)方法所必須的表達(dá)基因盒。從便宜和豐富易得的起始化合物開始，它特別適用于氫化可的松和中間產(chǎn)物的生產(chǎn)。本發(fā)明結(jié)束了陳腐的傳統(tǒng)昂貴的化學(xué)反應(yīng)。中間產(chǎn)物不必被分離。除了新的宿主細(xì)胞，在類固醇轉(zhuǎn)化方面，培養(yǎng)這些細(xì)胞使用的方法本身與該技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的生物技術(shù)方法相似。
下列實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不是對本發(fā)明的限制。
例1編碼了牛細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶(P450SCC)的整個cDNA的分子克隆采用Maniatis等人，MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratory，1982的手冊中描述的普通克隆技術(shù)以及DNA和RNA分析。除非特別說明，所有DNA修飾酶、分子克隆載體和大腸桿菌菌株均由供應(yīng)商提供并按照制造商的說明使用。分離和純化DNA和RNA的材料和儀器按照供應(yīng)商的說明使用。
從新鮮的牛腎中制備牛腎上腺皮質(zhì)組織，正在液氮中速凍并貯存于-80℃。
從冷凍的牛腎上腺皮質(zhì)中，用Auffrey和Rougeon(Enr.J.Biochem，107，303-314，1980)描述的方法制備全部細(xì)胞的RNA。在寡聚(dT)層析上選擇多聚A前，于65℃加熱全部RNA樣本得到腎上腺多聚A+RNA。
與來自牛腎上腺皮質(zhì)的多聚A+RNA互補的DNA被合成如下用氫氧化甲基汞處理過的10μg多聚A+RNA用β-巰基乙醇中和。將混合物調(diào)節(jié)至50mM Tris/Hcl(在42℃將PH8.3)，40mM Kcl、6mM Mgcl2、10mM DTT、3000U R Nasin/ml、4mM Na4P2O7、50μg放線菌素D/ml、0.1mg寡聚(dT12-18)/ml、0.5mM dGTP、0.5mM dATP、0.5mM dTTP、0.25mM dCTP和400μCi α32P-d CTP/ml，所有的物質(zhì)濃度都是在最終體積為100μl中的濃度。將混合物在冰上放置10分鐘，于42℃下加熱2分鐘，加入150U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Anglian Biotechnology Ltd.)起動這種合成，于42℃保溫1小時。
加入Gubler和Hoffman(Gene，25，263-269，1983)的DNA聚合酶和R Nase H進(jìn)行第二條鏈的合成。用T4DNA聚合酶(BRL)處理ds DNA后得到鈍性末端，將decameric EcoRI連接子(Biolabs Inc.)與ds DNA片段連接。用EcoRI(Boehringer)消化后，通過生物凝膠A15m(Bio-Rad)層析從大量的EcoRI連接子中分離雙股cDNA片段。通過T4-DNA連接酶(Boehringer)將約200ng含雙股cDNA的EcoRI連接子與用10μg EcoRI消化和牛腸道磷酸酶(Boehringer)處理的λ-gtll載體DNA(Promega)連接，就像Huynh等人所描述的那樣(在“DNACloning techniquesA Practical approach”，PP.49-78，Oxford IRL-Press，1985中)。在體外進(jìn)行這種連接混合物包裝后得到的噬菌體用來感染大腸桿菌Y1090宿主(Promega)。
從這個cDNA庫中，用32P末端標(biāo)記的合成寡聚物SCC-1(5′-GGC TGA CGA AGT CCT GAG ACA CTG GAT TCA GCA CTGG-3)篩選出約106個噬菌斑形成單位(Pfu′s)，這種合成寡聚物對如Morohashi等人(Proc.Natl.Acad.Scl.USA.81，4647-4651，1984)所描述的牛P450SCC DNA序列具有特異性。得到六個雜交的Pfu′s，再用兩輪感染、平板化和雜交法進(jìn)行進(jìn)一步的純化，將P450SCCcDNA EcoRI插入段亞克隆入PTZ18R(Pharmacia)的EcoRI位點。用限制性酶圖和序列測定對含有最大EcoRI插入段(1.4Kb)的來自克隆λ-gtll SCC-54的克隆PGBSCC-1(圖2)進(jìn)行進(jìn)一步分析。
序列數(shù)據(jù)表明PGBSCC-1EcoRI插入段與P450SCCcDNA圖上的251位和1824位之間的SCCcDNA的核苷酸序列(如Morohashi等人描述的)是一致的。
通過將177bp Pst/HindⅢ片段克隆入pTZ18R合適的位點中，合成得到其余的5′-P450SCCcDNA核苷酸，得到如圖3所示的PTZ/Synlead，它除了含有編碼了Morohashi等人發(fā)表的從118位至273位的成熟P450SCC蛋白的核苷酸外，還在不影響P450SCC蛋白質(zhì)預(yù)期的氨基酸序列下含有ScaⅠ，AvrⅡ和StuⅠ的限制性位點。
通過在含有1372bp HindⅢ/KpnⅠPGBSCC-1片段、177bp Pst/HindⅢPTZ/Synlead片段和用PstⅠ和KpnⅠ消化了的PTZ19R DNA的連接混合物的大腸桿菌JM101(ATCC33876)進(jìn)行分子克隆，構(gòu)建整長的P450SCCcDNA。
得到的質(zhì)粒PGBSCC-2含有編碼了成熟牛P450側(cè)鏈裂解蛋白的全部核苷酸序列，它被表示在圖4中。
例2在枯草桿菌細(xì)菌宿主中P450SCC的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和表達(dá)為了在桿菌宿主中得到細(xì)胞色素P450SCC的表達(dá)，將P450SCCcDNA序列轉(zhuǎn)移到大腸桿菌/桿菌往返載體PBHA-1中。
圖5表示了往返質(zhì)粒PBHA-1的核苷酸序列，該質(zhì)粒含有11-105和121-215位細(xì)菌噬菌體FO終止子(兩個);221-307位質(zhì)粒PBR322的一部分(即2069-2153位);313-768位細(xì)菌噬菌體F1，復(fù)制起點(即5482-5943位);772-2571位質(zhì)粒PBR322部份，即復(fù)制起點和β-乳胺酶基因;2572-2685位轉(zhuǎn)位子TN903，完整基因組;2719-2772位色氨酸終止子(2個);2773-3729位轉(zhuǎn)位子Tn9，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。在3005(A)、3038(C)、3302(A)和3409(A)位的核苷酸不同于野生型貓的編碼序列。導(dǎo)入這些突變是為了消除NcoⅠ、BalⅠ、EcoRⅠ和PvuⅡ位點3730-3804位多克隆位點;3807-7264含有桿菌“HpaⅡ”啟動子的質(zhì)粒PUB110的部分，復(fù)制和卡那霉素抗性基因(EcoRⅠ-PvuⅡ片段)(Mckenzie等人，Plasmid15，93-103，1986和Mckenzie等人，Plasmid17，83-85，1987);7261-7331位多克隆位點。用已知的克隆技術(shù)將這些片段放在一起，這些技術(shù)例如將Klenow片段填入粘性末端、轉(zhuǎn)接物克隆法等，所有數(shù)據(jù)均來自于GenbankR，National Nucleic Acid Sequence Data Bank，NIH，USA。
在大腸桿菌JM101內(nèi)，將PGBSCC-2的KpnⅠ/SphⅠP450SCCcDNA插入段(如例1描述)分子克隆到如圖6所示的PBHA-1的合適位點中，得到PGBSCC-3。
通過在大腸桿菌JM101中進(jìn)行分子克隆，用合成的SphⅠ/StuⅠ片段交換PGBSCC-3中的StuⅠ/SphⅠ片段導(dǎo)入甲硫氨酸起始密碼。
SPH1STU 1CATATGATCAGTACTAAGACCCCTAGGGTACGTATACTAGTCATGATTCTGGGGATCCNDE1成SphⅠ/StuⅠ片段在ATG起始密碼處有NdeⅠ位點。得到的質(zhì)粒PGBSCC-4被表示在圖7中。通過用限制性酶NdeⅠ消化PGBSCC-4，將“HpaⅡ”桿菌啟動子導(dǎo)入P450SCCcDNA序列的上游，用瓊脂糖凝膠電泳分離往返質(zhì)粒的大腸桿菌部分，然后重新連接，再轉(zhuǎn)化到枯草桿菌1A40(BGSC1A40)的適當(dāng)?shù)募?xì)胞中。分析新霉素抗性克隆，得到質(zhì)粒PGBSCC-5(圖8)，通過制取在含有10μg/ml新霉素的TSB培養(yǎng)基(Gibco)中37℃下過夜培養(yǎng)物的細(xì)胞蛋白質(zhì)部分來研究牛P450SCC的表達(dá)。離心收獲約含5×106細(xì)胞的100μl細(xì)胞培養(yǎng)物，再在10mM Tris/Hcl PH7.5中重新懸浮，加入溶菌酶(1mg/ml)進(jìn)行溶菌作用，再于37℃培養(yǎng)15分鐘。于37℃用0.2mg DNase/ml處理5分鐘后，將混合物調(diào)至1×SB緩沖液(如Laemmli，Nature227，680-685，1970描述的)，最終體積為200μl。于100℃加熱5分鐘后，將15μl混合物在7.5%SDS/聚丙烯酰凝膠中進(jìn)行電泳。通過P450SCC特異抗體對凝膠進(jìn)行探針免疫印跡分析，可檢測如圖9(行C)所示的53KDa帶。
用從牛腎上腺皮質(zhì)組織分離純化的P450SCC蛋白對兔進(jìn)行免疫接種，得到牛P450SCC特異抗體。
例3P450SCC在細(xì)菌宿主地衣形芽孢桿菌中的表達(dá)將質(zhì)粒PGBSCC-5轉(zhuǎn)化到合適宿主菌株地衣芽孢桿菌T5(CBS470.83)中，使得牛P450SCC在地衣形芽孢桿菌中表達(dá)。從含有10μg/ml新霉素的Trypton Soy Broth(TSB)培養(yǎng)基(Oxoid)中于37℃培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)物中，用例2描述的方法制備細(xì)胞蛋白質(zhì)部份，用SDS/PAGB和Western-blotting印跡分析進(jìn)行分析。在將硝基纖維濾紙和牛P450SCC特異抗體培養(yǎng)后，可看到圖9(行5)中所示的53KDa大小的蛋白質(zhì)帶。對轉(zhuǎn)化株SCC-201的P450SCC的體內(nèi)活性進(jìn)行進(jìn)一步的分析(見例11)。
例4P450SCC在細(xì)菌宿主大腸桿菌中的表達(dá)(a)表達(dá)基因盒的構(gòu)建為了得到適合于牛P450SCC在宿主大腸桿菌中表達(dá)的載體，用位點誘變方法突變PTZ18R，誘變方法如Zoller和Smith的“Methods in Enzymology”100，468-500，1983;Zoller和Smith的“Methods in Enzymology154，329-350，1987和Kramer和Fritz的“Methods in Enzymology”154，350-367，1987所描述的。體外誘變實驗的質(zhì)粒和菌株從Pharmacia Inc.得到。
一個合成得到的具有序列為
的寡聚體用來在PTZ18R中l(wèi)acZ基因的ATG起始密碼處產(chǎn)生NdeⅠ限制性位點。
得到的質(zhì)粒PTZ18RN用NdeⅠ和KpnⅠ消化，采用如圖10所示的分子克隆方法，插入含有整長SCCcDNA的PGBSCC-4的NdeⅠ/KpnⅠDNA片段。
所得到的質(zhì)粒PGBSCC-17中P450SCCcDNA序列的轉(zhuǎn)錄由大腸桿菌lac啟動子驅(qū)動。
(b)P450SCC在宿主大腸桿菌JM101中的表達(dá)通過選擇氨芐青霉素抗性菌落，將PGBSCC-17導(dǎo)入大腸桿菌JM101適當(dāng)?shù)募?xì)胞中。于37℃將轉(zhuǎn)化株SCC-301和302在含有50μg/ml氨芐青霉素的2XTY培養(yǎng)基(每升去離子水含有細(xì)菌蛋白胨(Difco)，16g;酶母提取物(Difco)，10g和Nacl，5g)中培養(yǎng)過夜，從中制備細(xì)胞蛋白質(zhì)部分(如例2描述)，來研究細(xì)胞色素P450SCC的表達(dá)。
由SDS/PAGE分析、用考馬斯亮蘭染色(圖11A)或用Western印跡分析和用牛P450SCC特異抗體探針(圖11B)來分析蛋白質(zhì)部分。兩種分析分別顯示了轉(zhuǎn)化體SCC-301和SCC-302的預(yù)期長度的蛋白質(zhì)(圖11A中，行1和行2和圖11B中的行3和行4)，而在大腸桿菌JM101對照菌株中是沒有的(圖11A，行3和圖11B中的行2)。
例5P450SCC在酵母Kluyveromyces lactis中的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和表達(dá)(a)PUC19中發(fā)生素(geneticin)抗性標(biāo)記的導(dǎo)入與Bennetzen和Hall(J.Biol.Chem.，257，3018-3025，1982)中描述的相似，將含Tn5基因(Reiss等人，EMBOJ.，3，3317-3322，1984)(在啤酒酵母乙醇脫氫酶I(ADHI)啟動子賦于發(fā)生素抗性的基因)的DNA片段插入PUC19的SmaⅠ位點(Yanisch-Perron等人，Gene，33，103-119，1985)，得到的質(zhì)粒PUCG418被表示在圖12中。
含PUCG418的大腸桿菌保藏于CentraalBureauVoorSchimmelcultures保藏號為CBS872.87。
(b)表達(dá)基因盒的構(gòu)建構(gòu)建一個載體，該載體包括用XbaⅠ和HindⅢ切割的PUCG418(如例5(a)描述)、來自PGB901含乳糖酶啟動子的XbaⅠ-SalⅠ片段(見J.A.VandenBerg等人，美國專利申請?zhí)枮?72.414的部份繼續(xù)申請Kluyveromyves作為宿主菌株)和含有K.lactis乳糖酶基因的3′非編碼區(qū)域部分的合成DNA。這個質(zhì)粒PGB950表示在圖13中。
用SalⅠ和XhoⅠ切割PGB950，插入人工合成的DNASAL1STU 1XHO1TCGACAAAAATGATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTCGTTTTTACTAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT得到的質(zhì)粒PGBSCC-6如圖13所示。
從含P450SCC編碼區(qū)域的PGBSCC-2(見例1)中分離StuⅠ-EcoRI片段，使用Klenow DNA聚合酶填充粘性末端。這個片段插入用StuⅠ切割的PGBSCC-6中，含有正確取向片段的質(zhì)粒稱為PGBSCC-7(見圖14)。
(c)K.lactis的轉(zhuǎn)化作用將K.lactis菌株CBS2360在含2.5ml6.7%(W/W)酵母氮堿基(Difco實驗室)溶液的100mlYEPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物，2%的胨、2%的葡萄糖-水合物)中培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD61-0約為7。從10ml培養(yǎng)物中，離心收集細(xì)胞，用TE緩沖液沖洗(10mM Fris-Hcl，PH7.5;0.1mM EDTA)，再重新懸浮在1ml TE-緩沖液中。加入等體積0.2M的乙酸鋰，于30℃在振蕩水浴中，將混合物保溫1小時。在乳糖酶啟動子的單拷貝SacⅡ位點切割15ug PGBSCC-7，用乙醇沉淀并重新懸浮于15ul TE-緩沖液中，在該DNA制劑中加入100ul預(yù)保溫過的細(xì)胞，保溫延續(xù)30分鐘，然后加入等體積的70%PEG4000，混合物在相同溫度下保溫1小時，再于42℃進(jìn)行5分鐘熱振蕩，再加入1ml YEPD培養(yǎng)基，將這些細(xì)胞在30℃的振蕩水浴中保溫1.5小時。最后離心收集細(xì)胞，懸浮于300μl YEPD中，再擴(kuò)散到含15ml YEPD瓊脂和300μg/ml遺傳素的瓊脂平板上，在使用前1小時用15ml浸有G418的YEPD瓊脂覆蓋一層，菌落于30℃生長3天。
(d)轉(zhuǎn)化株的分析轉(zhuǎn)化株和對照菌株CBS2360于30℃在YEPD培養(yǎng)基中生長約64小時。離心收集細(xì)胞，再懸浮在OD610為300的生理鹽水溶液中，在Vortex振蕩器中，以最大速度用玻璃珠振蕩破碎3分鐘。在Hearaeus Christ minifuge GL中，轉(zhuǎn)速為4500rpm離心10分鐘，除去細(xì)胞碎屑，從上清液中取40μl樣本用于免疫印跡分析(見圖15A，行3和圖15B，行4)。
結(jié)果顯示了預(yù)期長度的蛋白質(zhì)在用PGBSCC-7轉(zhuǎn)化的K.lactis細(xì)胞中被表達(dá)。轉(zhuǎn)化株稱為K.lactisSCC-101。
例6P450SCC在酵母菌啤酒酵母中的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化和表達(dá)。
(a)表達(dá)基因盒的構(gòu)建為了去除乳糖酶啟動子，用XbaⅠ和SalⅠ切割PGB950〔見例4(b)〕，采用KlenowDNA聚合酶填充其粘性末端，然后再連接，在所得到的質(zhì)粒PGBSCC-8中，XbaⅠ位點被破壞，但保留了SalⅠ位點。
對從PGB161(見J.A.VandenBerg等人;EP96430)中分離的、含有啤酒酵母的異細(xì)胞色素CI(Cyc)啟動子的SalⅠ片段，用XhoⅠ部分地消化，分離670bpXhoⅠ-SalⅠ片段，克隆到PGBSCC-8的SalⅠ位點。在選擇的質(zhì)粒PGBSCC-9中，保持Cyc1啟動子和乳糖酶基因的3′端非編碼區(qū)域之間的SalⅠ位點(圖16)(用HindⅢ部份地消化)。
將來自PGBSCC-7，含有P450SCC編碼區(qū)域的SalⅠ-HindⅢ片段插入用SalⅠ和HindⅢ切割的PGBSCC-9中，在得到的質(zhì)粒PGBSCC-10中，P450SCC編碼區(qū)域在cyc1啟動子的下游(如圖17)。
(b)啤酒酵母的轉(zhuǎn)化于30℃將啤酒酵母菌菌株D273-10B(ATCC25657)在100ml YEPD培養(yǎng)過夜，再用新鮮培養(yǎng)基稀釋(1∶10000)并生長至OD610為6，從10ml培養(yǎng)物中離心收集細(xì)胞，懸浮在5ml TE-緩沖液中，再用離心方法收集細(xì)胞，懸浮于1ml TE-緩沖液中，再加入1ml0.2M乙酸鋰。將這些細(xì)胞于30℃振蕩水浴中保溫1小時。在cyc1啟動子的單拷貝MluⅠ-位點處切割15μg PGBSCC-10，乙醇沉淀后，再懸浮于15μlTE中。在這個DNA制劑中加入100μl預(yù)培養(yǎng)過的酵母細(xì)胞，于30℃保溫(振蕩)30分鐘。加入115μl的70%PEG4000溶液后，持續(xù)保溫60分鐘(不振蕩)。然后，于42℃對細(xì)胞熱振蕩5分鐘，加入1ml YEPD培養(yǎng)基，再于30℃在振蕩水浴中保溫1 1/2 小時。最后用離心方法收集細(xì)胞，重懸浮于300μlYEPD中并擴(kuò)散到含發(fā)生素(300μg/ml)的YEPD的瓊脂平板上。
菌落于30℃生長三天。
(c)轉(zhuǎn)化株分析轉(zhuǎn)化株和對照株在YEPL-培養(yǎng)基(1%酵母提取物，2%細(xì)菌蛋白胨，3.48%K2HP4和2.2%的90%L-(+)-乳酸溶液，在滅菌前用25%的氨溶液將PH調(diào)至6.0)中于30℃生長64小時，再用如例5(d)中描述的方法進(jìn)行分析。
免疫印跡分析證明了P450SCC在啤酒酵母中的表達(dá)(圖15A，行1)。
例7前-P450SCC編碼DNA在酵母Kluyveromyces lactis中的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和表達(dá)
(a)表達(dá)基因盒的構(gòu)建用SalⅠ和XhoⅠ切割質(zhì)粒PGB950(見例5(b))，并插入合成的DNA
得到質(zhì)粒PGBSCC-11(圖18)。與例5(b)中描述的類似，將PGBSCC-2的P450SCC編碼區(qū)域插入用StuⅠ切割的PGBSCC-11中。含正確取向片段的質(zhì)粒叫作PGBSCC-12(圖18)。
(b)K.lactis的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體的分析用如例5(c)中描述的方法用PGBSCC-12轉(zhuǎn)化K.lactis，用例5(d)描述的方法分析轉(zhuǎn)化株，分析證明通過K.lactis的P450SCC的生產(chǎn)(圖15B，行3)。
例8前-P450SCC的編碼DNA在啤酒酵母中的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和表達(dá)(a)表達(dá)基因盒的構(gòu)建將來自PGBSCC-12、含有前-P450SCC編碼區(qū)域的SalⅠ-HindⅢ(HindⅢ被部分地消化)片段插入用SalⅠ和HindⅢ切割的PGBSCC-9中，得到的質(zhì)粒叫做PGBSCC-13(圖19)。
(b)啤酒酵母的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化株的分析如例6(b)描述的方法，用PGBSCC-13轉(zhuǎn)化啤酒酵母菌株D273-10B，轉(zhuǎn)化株分析用如例5(c)描述的方法進(jìn)行，結(jié)果(如圖15(c)(行3)表示)，證明了由啤酒酵母表達(dá)P450SCC。進(jìn)一步分析了一個轉(zhuǎn)化株，SCC-105的P450SCC的體外活性(見例12)。
例9融合到啤酒酵母的細(xì)胞色素氧化酶Ⅵ的前區(qū)域的P450SCC序列在Kluyveromyces lactis中構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及其表達(dá)(a)表達(dá)基因盒的構(gòu)建用SalⅠ和XhoⅠ切割質(zhì)粒PGB950(見例6(b))并插入合成的DNA
得到質(zhì)粒PGBSCC-14。
來自細(xì)胞色素氧化酶Ⅵ(COX Ⅵ)前序列的氨基酸序列出自Wright等人(J.Biol.Chem，259，15401-15407，1984)的文章。采用優(yōu)選的酵母密碼子，設(shè)計合成DNA。與例5(b)中描述的相似，將PGBSCC-2的P450SCC編碼區(qū)域插入用StuⅠ切割的PGBSCC-14中。在COXⅥ前序列框內(nèi)含有P450SCC編碼序列的質(zhì)粒叫做PGBSCC-15(圖20)。
(b)K.lactis的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化株的分析用例5(c)描述的方法，用PGBSCC-15對K.lactis轉(zhuǎn)化。用如例5(d)描述的方法分析轉(zhuǎn)化株，結(jié)果(圖15B，行2)顯示了P450SCC被表達(dá)。
例10融合于啤酒酵母的細(xì)胞色素氧化酶Ⅵ前區(qū)域的P450SCC在啤酒酵母中的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化和表達(dá)(a)表達(dá)基因盒的構(gòu)建來自PGBSCC-15，含有融合到COX Ⅵ前序列上的P450SCC的編碼區(qū)域的SalⅠ-HindⅢ(HindⅢ部分地消化)片段被插入用SalⅠ和HindⅢ切割的PGBSS-9中，得到的質(zhì)粒叫做PGBSCC-16(圖21)。
(b)啤酒酵母的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化株的分析用例6(b)中描述的方法，用PGBSCC-16轉(zhuǎn)化啤酒酵母菌株D273-10B。用例6(C)描述的方法分析轉(zhuǎn)化株。結(jié)果(如圖15C(行2)所示)顯示了P450SCC在啤酒酵母中的表達(dá)。
例11地衣形芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)SCC201中P450SCC在活體內(nèi)的活性按照例3中所描述的方法得到地衣形芽孢桿菌SCC-201。將此生物體接種于100ml培養(yǎng)基A中。培養(yǎng)基A由下列成分組成Cacl2·6H2O 1g硫酸銨5gMgcl2·6H2O 2.25gMgSO4·4H2O 20mg六合水氯化鈷1mg一水合檸檬酸1.65g蒸餾水600ml微量元素原料溶液1ml防沫劑(SAG5693)0.5mg微量元素原料溶液在每1毫升蒸餾水中含有CuSO4·5H2O 0.75gH3BO30.60gKI0.30gFeSO4(NH4)2SO4·2H2O 27gZnSO4·7H2O 5g檸檬酸·H2O 15gMnSO4·H2O 0.45gNa2MoO4·H2O 0.60g
H2SO4(96%) 3ml經(jīng)滅菌并冷卻至30℃制成培養(yǎng)基后，將60g溶于200ml蒸餾水(120℃滅菌20分鐘)的一水合麥芽糖酶、200ml1M的磷酸鉀緩沖液(PH6.8;120℃滅菌20分鐘)、以及溶于100ml蒸餾水(膜過濾滅菌)的1.7g酵母氮基(Difco公司)加入培養(yǎng)基中。
此培養(yǎng)物在37℃下生長64小時，然后取2ml培養(yǎng)物接種于含10mg膽固醇的100ml培養(yǎng)基A中，膽固醇以一種溶液的方式加入，該溶液含有10mg膽固醇、0.75mlTergitol(注冊商標(biāo))/乙醇(體積比1∶1)、以及20μlTween80(注冊商標(biāo))。培養(yǎng)物在37℃生長48小時，然后用100ml二氯甲烷萃取。離心分離混合物并收集有機(jī)溶劑層。萃取過程重復(fù)兩次并匯集3×100ml的二氯甲烷組分。真空蒸餾二氯甲烷蒸發(fā)，并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合分析法對干提取物(大約為450mg)進(jìn)行孕甾烯酮分析。
氣相色譜-質(zhì)譜分析從干提取物中取一定的量，并通過加入一種吡啶雙-(三甲硅烷)-三氟乙酰胺與三甲基氯硅烷的混合物使其硅烷化。按照被選擇離子的方式對硅烷化樣品進(jìn)行GL-MS-DS聯(lián)合分析(CarloErbaMEGA5160-FinniganMAT311A-KratosDS90)。氣相色譜是在下述條件下進(jìn)行的在300℃用自動注射器注射;內(nèi)徑為0.25、df0.2μm的M。Cpsil29色譜柱在300℃恒溫操作;直接引入質(zhì)譜源。
在800的分辨率下，通過對孕甾烯醇酮離子苛質(zhì)比M/Z298的監(jiān)測，對樣品進(jìn)行分析。測量結(jié)果顯然表明在宿主菌株為地衣形芽孢桿菌T5的情況下未檢查出孕甾烯醇酮(檢出的最低限為1微微克)，而在地衣形芽孢桿菌SCC-201的情況下，很容易檢測到孕甾烯醇酮產(chǎn)物。
例12從啤酒酵母菌SCC-105得到的P450SCC在活體內(nèi)的活性將按照例8中描述的方法得到的啤酒酵母菌SCC-105接種于100ml培養(yǎng)基B中。培養(yǎng)基B在每升蒸餾水中含有酵母提取物10gBactoPeptone(Oxoid)20g乳酸(90%)20g磷酸氫二鉀35gPH＝5.5(用25%W/W的氨調(diào)至)此培養(yǎng)物在30℃生長48小時，然后將其接種于含有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)。培養(yǎng)基C由下列成分組成酵母提取物100gBactoPeptone(OXoid)200g乳酸(90%)220g磷酸氫二鉀35g蒸餾水7800ml用25%的氨將PH調(diào)至6.0并將內(nèi)含培養(yǎng)基的發(fā)酵罐滅菌(1小時，120℃)。
冷卻后，將溶于25ml蒸餾水的2.4g發(fā)生素(geneticin)經(jīng)膜過濾滅菌并加入培養(yǎng)基中。在30℃下，在攪拌反應(yīng)器中(800rpm)使接種混合物生長，同時以300升/小時的速度使無菌空氣通過培養(yǎng)液，并且用4N H2SO4及5%NH4OH(5%NH4OH的蒸餾水溶液;經(jīng)膜過濾滅菌)使PH值自動保持在6.0。48小時后，開始以20克/小時的速度加入乳酸(90%，膜過濾滅菌)。然后再發(fā)酵40小時，離心(4000×g，15分鐘)收集細(xì)胞。
用0.9%(W/W)的Nacl洗滌沉淀，然后離心(4000×g，15分鐘);用磷酸鹽緩沖液(50mM，PH＝7.0)洗滌沉淀物并離心(4000×g，15分鐘)收集細(xì)胞。取沉淀物置于磷酸鹽緩沖液(50mM，PH＝7.0)中，得到每毫升含濕重0.5g沉淀物的懸浮液。用Dyno(注冊商標(biāo))-粉碎機(jī)(WillyA.Bachofen，Maschinenfabrik，Basel，Schweiz)處理該懸浮液。離心(4000×g，15分鐘)除去未破碎的細(xì)胞。將沒有細(xì)胞的提取物(2250ml，15-20mg蛋白質(zhì)/毫升)于-20℃貯存。
通過下述方法對P450SCC粗提純。經(jīng)超速離心(125000×g，30分鐘)將粗的膜成分從50ml解凍的無細(xì)胞提取物中沉淀，并再次懸浮于50ml含1%膽酸鈉的75mM磷酸鉀溶液(PH7.0)中。將此分散體在0℃輕輕攪拌1小時，然后離心(125000×g，60分鐘)。向所得的含可溶性膜蛋白的上清液中加入(NH4)2SO4(30%W/V)，同時通過加入少量NH4OH溶液(6N)使PH保持在7.0。此懸浮液在0℃攪拌20分鐘，然后離心(15000×g，10分鐘)收集沉淀蛋白質(zhì)部分。將沉淀物再次懸浮于2.5ml含有0.1mM二硫-threitol和0.1mM EDTA的100mM的磷酸鉀緩沖液中(PH7.0)。此懸浮液經(jīng)凝膠過濾柱(PD10，Pharmacia)洗脫，得到3.5ml脫鹽蛋白質(zhì)成分(6mg/ml)，此成分用于P450SCC活性分析。
大體上根據(jù)Doering的方法(Methods Enzymology，15，591-596，1969)對P450SCC的活性進(jìn)行測定。分析混合物由下列溶液構(gòu)成溶液A(天然P450SCC電子供給系統(tǒng))10mM磷酸鉀緩沖液(PH7.0)，其中含有3mM EDTA、3mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、20μM腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白及1μM腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(電子受體;均由牛腎上腺皮質(zhì)提純)、1mMNADPH(電子供體)和15mM葡萄糖-6-磷酸鹽以及8單位/毫升葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶(NADPH再生系統(tǒng))。
溶液B(底物)于10%(V/V)Tergitol(注冊商標(biāo))NP40/乙醇(1∶1，V/V)中的37.5μM膽固醇膠束溶液(用〔26，27-14C〕膽固醇(40Ci/mol)與〔7-α-3H〕膽固醇(400Ci/mol)雙放射標(biāo)記)。
首先將75μl溶液A與50μl溶液B及125μl粗提純的P450SCC組分(或是緩沖液，作為參照)混合?；旌衔镌?0℃輕輕攪拌。在0、30和180分鐘時取出50μl樣品并用100μl水稀釋。向稀釋的樣品中加入100μl甲醇和150μl氯仿。經(jīng)萃取與離心(5000×g，2分鐘)后，收集氯仿層并干燥。將干燥的殘余物溶于50μl含有0.5mg類固醇混合物(膽固醇、孕甾烯醇酮與孕酮1∶1∶1，W/W/W)的丙酮中，然后加入110μl濃甲酸。懸浮液在120℃加熱15分鐘。然后通過雙標(biāo)記液體閃爍計數(shù)測定14C/3H的比值，這種比值是側(cè)鏈斷裂反應(yīng)的一個直接的量度，因為14C-標(biāo)記的側(cè)鏈在加熱過程中以異辛酸的形式從混合物中蒸發(fā)了。
通過這種分析發(fā)現(xiàn)從啤酒酵母菌中得到的粗提純的P450SCC成分具有側(cè)鏈斷裂活性。在保溫3小時的過程中，45%的膽固醇被轉(zhuǎn)化了。通過薄層色譜法鑒定出反應(yīng)產(chǎn)物是孕甾烯醇酮。
例13編碼了牛細(xì)胞色素P450類固醇17α-羥化酶(P45017α)的整長cDNA的分子克隆。
通過用對P45017αcDNA特異的二種32P-末端標(biāo)記的合成寡聚物進(jìn)行篩選，對例1中所描述的約106Pfu′s的牛腎上腺皮質(zhì)cDNA庫選擇P45017αcDNA序列。寡聚物17α-1(5′-AGT GGC CAC TTT GGG ACG CCC AGA GAA TTC-3′)與寡聚物17α-2(5′-GAG GCT CCT GGG GTA CTT GGC ACC AGA GTG CTT GGT-3′)分別與Zuber等人(J.Biol.Chem.261，2475-2482，1986)描述的牛P45017αcDNA序列中位349-320及位139-104互補。
用寡聚物17α-1進(jìn)行選擇顯示出±1500雜交Pfu′s。對幾種雜交Pfu′s進(jìn)行選擇、提純和擴(kuò)大，用于初步的噬菌體DNA的分離。重組體λ-gtllDNA′s的EcoRI插入段亞克隆于PTZ18R的EcoRI位點。一種克隆，PGB17α-1進(jìn)一步由限制性核酸內(nèi)切酶圖和DNA定序表征其特性。質(zhì)粒PGB17α-1含有一個1.4Kb的EcoRI插入段，該插入段與Zuber等人描述的P45017α3′部分從320號位置的EcoRI位點至1721號位置的多腺苷酸作用位點互補。
PGB17α-1的圖譜被表示在圖22A上。
通過用寡聚物17α-2選擇cDNA庫得到8個雜交Pfu′s。在重組噬菌體提純、擴(kuò)大和分離rec λ-gtll DNA′s后，EcoRI插入段亞克隆于PTZ18R的EcoRI位點。EcoRI插入段長度變化可以從270bp至1.5Kbp。只有一種克隆，含有一個345bp EcoRI片段的PGB17α-2通過核苷酸定序被進(jìn)一步研究，并與Zuber等人公布的P45017αcDNA序列進(jìn)行比較。如圖22B所示，PGB17α-2中P45017αcDNA序列起始于所預(yù)料的47號位的AUG起始密碼上游的72bp，并表明和Zuber等人所描述的一樣，與P45017αcDNA的5′部分直至320位的EcoRI位點完全符合。
通過在一個連接混合物的大腸桿菌(E.coli)JM101中進(jìn)行分子克隆構(gòu)建一條整長的牛P45017αcDNA，該連接混合物中含有PGB17α-1的部分EcoRI消化液及345bp PGB17α-2的EcoRI片段。所得到的克隆PGB17α-3含有一條整長的牛P45017αcDNA，并被表示在圖22C中。
例14克隆于酵母菌Kluyveromyces lactis中的整長P45017αcDNA的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化(a)表達(dá)載體的構(gòu)建為得到一適合于牛P45017α在酵母菌宿主中表達(dá)的載體，根據(jù)Zoller與Smith(MethodsinEnzymol.，100，468-500，1983)、Zoller與Smith(MethodsinEnzymol.，154，329-350，1987)以及Kramer與Fritz(MethodsinEnzymol.，154，350-360，1987)所描述的通過位變誘變使PGB17α-3發(fā)生突變?；铙w外誘變實驗用的質(zhì)粒與菌株從PharmaciaInc.買到。
如圖23所示，使用合成的寡聚物17α-3SAL 15′-TCTTTGTCCTGACTGCTGCCAGTCGACAAAAATGTGGCTGCTC-3改變ATG起始密碼子上游的9bp，從而得到一個SalⅠ限制位點和最佳酵母菌轉(zhuǎn)譯信號。
所得到的質(zhì)粒PGB17α-4用SalⅠ和SmaⅠ消化，通過凝膠電泳分離出含有整長P45017αcDNA的DNA片段，經(jīng)過在大腸桿菌(E.Coli)JM101中進(jìn)行分子克隆使其分離并轉(zhuǎn)移至預(yù)先被XhoⅠ消化的PGB950載體中(參見例5)，用Klenow DNA聚合酶填充粘性末端，然后用SalⅠ消化，從而得到圖24所示的質(zhì)粒PGB17α-5。
(b)K.lactis的轉(zhuǎn)化如例5中所表示的，在乳糖酶啟動子中單拷貝的SalⅡ位點處被切割的15μg PGB17α-5被用于轉(zhuǎn)化K.lactis菌株CBS2360。通過Southern分析對轉(zhuǎn)化株宿主基因組中是否存在整合PGB17α-5序列進(jìn)行分析。對在基因組宿主DNA中含有至少三個復(fù)制的PGB17α-5的一種轉(zhuǎn)化株17α-101進(jìn)一步進(jìn)行P45017α的活體內(nèi)活性分析(參見例16)。
例15枯草桿菌與地衣形芽孢桿菌細(xì)菌宿主中P45017α的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化(a)表達(dá)載體的構(gòu)建為得到適合于牛P45017α在芽孢桿菌屬宿主中表達(dá)的載體，按照例14中所描述的方法通過位點誘變使PGB17α-3發(fā)生突變。
如圖25所示，用合成寡聚物17α-4
將一個NdeⅠ限制位點引入ATG起始密碼子。
用EcoRI將得到的質(zhì)粒PGB17α-6部分消化，通過凝膠電泳將含有整長P45017αcDNA的DNA片段分離，按圖26所示的方法分離并連接于EcoRI消化的PBHA-1DNA。通過將該連接混合物轉(zhuǎn)移至大腸桿菌JM101中使連接物分子克隆，從而得到PGB17α-7。
(b)枯草桿菌與地衣形芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化通過用限制酶NdeⅠ消化PGB17α-6，用瓊脂糖凝膠電泳分離往返質(zhì)粒中的大腸桿菌部分，然后重新連接并使枯草桿菌1A40(BGSC 1A40)足夠的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而使“HpaⅡ”芽孢桿菌屬啟動子引入到P45017αcDNA序列的上游。對新霉素抗性菌落進(jìn)行分析結(jié)果得到質(zhì)粒PGB17α-8(圖27)。
又用PGB17α-8進(jìn)行宿主地衣形芽孢桿菌T5(CBS470.83)的轉(zhuǎn)化。PGB17α-8的限制性分析表明，即使在很多代后，在適當(dāng)?shù)难挎邨U菌屬中，該質(zhì)粒仍保持穩(wěn)定。
例16在Kluyveromyces lactis 17α-101中P45017α在活體內(nèi)的活性按照例14中描述的方法得到K.lactis17α-101。將此生物體接種于100ml培養(yǎng)基D中。培養(yǎng)基D在每升蒸餾水中含有酵母提取物(Difco)10gBactopeptone(Oxoid)20g右旋糖20g經(jīng)滅菌并冷卻至30℃后，將溶于40ml蒸餾水(膜過濾滅菌)的2.68g酵母氮基(Difco)與溶于1ml蒸餾水(膜過濾滅菌)的50mg新霉素加入培養(yǎng)基中。然后將溶于1.5ml二甲基甲酰胺中的50mg孕酮加入100ml培養(yǎng)基中。此培養(yǎng)物在30℃生長120小時，然后用50ml二氯甲烷對50ml培養(yǎng)液進(jìn)行萃取。將混合物離心并分離出有機(jī)溶劑層。通過真空蒸餾將二氯甲烷蒸發(fā)，將干燥的提取物(約200mg)放入0.5ml氯仿中。如同薄層色譜所表示的，該提取物含有17α-羥基孕酮。通過H-NMR與13C-NMR進(jìn)一步證實了該化合物的結(jié)構(gòu)。NMR分析還表明，提取物中17α-羥基孕酮/孕酮的比率約0.3。
例17編碼了牛細(xì)胞色素P450類固醇21-羥化酶(P450C21)的整長cDNA的分子克隆將按照例1中描述的方法制備的牛腎上腺皮質(zhì)cDNA庫的約106Pfu′s與32P末端標(biāo)記的寡聚C21-1雜交。如Yoshioka等人所描述的那樣(J.Biol.Chem.，261，4106-4109，1986)，含有5′-GAT GAT GCT GCA GGT AAG CAG AGA GAA TTC-3′序列的這種寡聚物是位于P450C21cDNA序列中EcoRI位點下游的牛P450C21基因的一種特異探針。經(jīng)過篩選得到一種雜交Pfu。這種重組體λ-gtll DNA的EcoRI插入段亞克隆于PTZ18R的EcoRI位點，從而得到一種命名為PGBC21-1的結(jié)構(gòu)。如圖28所示，根據(jù)核苷酸定序表明，該質(zhì)粒含有一個1.53Kb的EcoRI插入段，如Yoshioka等人所描述的，該插入段與P450C21cDNA序列從489位的EcoRI位點至多腺苷酸作用點互補。
為了分離P450C21cDNA中殘余的5′部分(490bp)按照例1中所描述的過程，僅用一種修飾制備一種新的牛腎上腺皮質(zhì)cDNA庫。作為第一條DNA鏈合成的引物，加入另一種寡聚物C21-2。具有5′-AAG CAG AGA GAA TTC-3′核苷酸序列的寡聚物C21-2被定位于P450C21cDNA從504至490位的EcoRI位點的下游。
用含有P450C21特異序列5′-CTT CCA CCG GCC CGA TAG CAG GTG AGC GCC ACT GAG-3′(72-37號位)的32P末端標(biāo)記的寡聚物C21-3對這種cDNA庫的篩選表明了約100個雜交Pfu′s。僅有一種重組λ-gtll DNA的EcoRI插入段亞克隆于PTZ18R的EcoRI位點，從而得到一種稱為PGB21-2的結(jié)構(gòu)。該質(zhì)粒(圖28)含有一個540bp的插入段，如核苷酸定序所表明的那樣，該插入段與P450C21cDNA序列從-50位到489位的EcoRI位點互補。
例18P450C21cDNA芽孢桿菌屬表達(dá)載體的構(gòu)建與枯草桿菌和地衣形芽孢桿菌細(xì)菌宿主的轉(zhuǎn)化(a)表達(dá)載體的構(gòu)建為了構(gòu)建一條整長的具有對芽孢桿菌屬表達(dá)載體PBHA-1特異的側(cè)鏈序列的P450C21cDNA，首先通過聚合酶的鏈反應(yīng)(PCR)方法用PGBC21-2作為模板以及兩種特異的P450C21-寡聚物作為引物對P450C21基因的5′部分進(jìn)行修飾。寡聚物C21-4(5′-CTG ACT GAT ATC CAT ATG GTC CTC GCA GGG CTG CTG-3′)含有與C-21序列從1-21位互補的21個核苷酸以及產(chǎn)生EcoRV限制位點及ATG起始密碼子的NdeⅠ限制位點的18個堿基。
寡聚物C21-5(5′-AGCTCAGAATTCCTTCTGGATGGTCAC-3′)是21個與49g位的EcoRI位點上游的負(fù)鏈互補的堿基。
根據(jù)Saiki等人的描述(Science 239，487-491，1988)，用較少的修飾進(jìn)行聚合酶的鏈反應(yīng)(PCR)。PCR反應(yīng)是在100μl體積中進(jìn)行的，這100μl體積中含有50mM Kcl，10mM Tris-Hcl PH8.3，1.5mM MgCl2，0.01%(W/V)白明膠，200μM每一種dNTP，1μM的每個C21底物和10ng PGBC21-2模板。在變性(100℃，7分鐘)及加入2U Taq-聚合酶(Cetus)后，在一個DNA放大設(shè)備中(Perkin-Elmer)使反應(yīng)混合物進(jìn)行25次放大循環(huán)(每次為55℃，2分鐘;72℃，3分鐘;94℃，1分鐘)。在最后一次循環(huán)中，去掉變性步驟。P450C21cDNA放大的圖解被表示在圖29中。
放大的片段用EcoRV與RcoRI消化，并通過分子克隆插入PSP73(Promega)適當(dāng)?shù)奈稽c。所得到的質(zhì)粒命名為PGBC21-3。如圖30所示，將PGBC21-1的3′P450C21-EcoRI片段在右側(cè)插入PGBC21-3的EcoRI位點。所得到的載體PGBC21-4用EcoRV和KpnⅠ消化(KpnⅠ位于PSP73的多克隆位點)，通過凝膠電泳法分離含有整長P450C21cDNA的片段，并通過分子克隆將該片段插入PBHA-1的適當(dāng)位點。所得到的質(zhì)粒PGBC21-5被表示在圖31中。
(b)芽孢桿菌屬的轉(zhuǎn)化通過用限制性酶NdeⅠ消化PGBC21-5，用瓊脂糖凝膠電泳分離往返質(zhì)粒的大腸桿菌部分，然后重新連接并轉(zhuǎn)化枯草桿菌1A40(BGSC 1A40)足夠的細(xì)胞，將“HpaⅡ”芽孢桿菌屬啟動子引入P450C21cDNA基因的上游。對新霉素抗性菌落進(jìn)行分析，從而得到PGBC21-6(圖32)。
又用PGBC21-6進(jìn)行宿主地衣形芽孢桿菌T5(CBS470.83)的轉(zhuǎn)化。限制性分析表明，在兩種芽孢桿菌屬宿主中該質(zhì)粒保持穩(wěn)定。
例19P450C21cDNA酵母菌表達(dá)載體的構(gòu)建以及酵母菌宿主Kluyveromyces lactis的轉(zhuǎn)化(a)表達(dá)載體的構(gòu)建為了得到適合于牛P450C21在酵母菌宿主中表達(dá)的載體，根據(jù)例14所描述的方法，通過位點誘變使PGBC21-2發(fā)生突變。對于這種突變體，如圖33所示，利用寡聚物C21-6(5′-CCTCTGCCTGGGTCGACAAAAATGGTCCTCGCAGGG-3′)產(chǎn)生一個SalⅠ限制性位點和在ATG起始密碼子上游的最佳酵母菌轉(zhuǎn)譯信號。
如圖34所示，將得到的質(zhì)粒PGBC21-7的SalⅠ/EcoRIDNA片段與PGBC21-1的3′P450C21-EcoRI片段連接，并通過分子克隆將其插入PSP73的適當(dāng)位點。用SalⅠ和EcoRV切割所得到的PGBC21-8(EcoRV位點位于PSP73的多克隆位點)，并將含有整長P450C21cDNA的DNA片段插入酵母菌表達(dá)載體PGB950。所得到的PGBC21-9被表示在圖35中。
(b)K.lactis的轉(zhuǎn)化按照例5(C)中所描述的方法，用SacⅡ?qū)?5μgPGBC21-9消化，并使K.lactisCBS2360轉(zhuǎn)化。
例20編碼了牛細(xì)胞色素P450類固醇11β-羥化酶(P45011β)的整長cDNA的分子克隆如例1中所述的方法，通過一次修飾制備牛腎上腺皮質(zhì)cDNA庫。將另一個具有5′-GGC AGT GTG CTG ACA CGA-3′序列的P45011β-特異引物(寡聚物11β-1)加到第一鏈cDNA合成的反應(yīng)混合物中。寡聚物11β-1定位于與轉(zhuǎn)譯終止子1530至1513位的下游。根據(jù)Morohashi等人描述(J.Biochem.102，(3)，559-568，1987)的P45011βcDNA序列資料，得到核苷酸序列及所述P45011β-寡聚物的圖譜位置。cDNA庫用32P標(biāo)記的寡聚物11β-2(5′-CCG CAC CCT GGC CTT TGC CCA CAG TGC CAT-3′)進(jìn)行修飾，并位于P45011βcDNA5′端的36至1位。
寡聚物11β-2的篩選揭示了6個雜交Pfu′s。它們被進(jìn)一步純化并用寡聚物11β-3(5′-CAG CTC AAA GAG AGT CAT CAG CAA GGG GAA GGC TGT-3′，990至955號位)對它們進(jìn)行分析。六個之中有兩個顯示出具有32P標(biāo)記寡聚物11β-3的陽性雜交信號。
將兩個11β-λ-gtll重組體的EcoRI插入段亞克隆于PTZ18R的EcoRI位點。用限制性酶圖對具有一個2.2Kb的EcoRI插入段的一種克隆(PGB11β-1)進(jìn)一步進(jìn)行分析，并被表示在圖36中。根據(jù)Morobashi等人的測定，PGB11β-1含有全部編碼了P45011βcDNA的序列。
例21P450C21cDNA芽孢桿菌屬表達(dá)載體的構(gòu)建以及枯草桿菌和地衣形芽孢桿菌細(xì)菌宿主的轉(zhuǎn)化(a)表達(dá)載體的構(gòu)建對于芽孢桿菌屬表達(dá)載體PBHA-1修飾了側(cè)鏈序列的整長P45011βcDNA通過PCR方法(在例18中描述過)，以PGB11β-1作為模板和兩種特異的P45011β-寡聚物作為引物獲得。
寡聚物11β-4(5′-TTT GAT ATC GAA TTC CAT ATG GGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC-3′)含有21個與成熟的P45011βcDNA序列從72至93號位互補的堿基以及21個產(chǎn)生EcoRV、EcoRI和NdeⅠ限制性位點和ATG起始密碼子的堿基。
寡聚物11β-5(5′-TAA CGA TAT CCT CGA GGG TAC CTA CTG GAT GGC CCG GAA GGT-3′)含有21個與在1511號位的轉(zhuǎn)譯中止子上游的P45011βcDNA頁鏈互補的堿基，以及21個產(chǎn)生EcoRV、XhoⅠ和KpnⅠ限制性位點的堿基。
利用上述模板與P45011β引物進(jìn)行PCR放大后，將放大的片段(1.45Kb)用EcoRI和KpnⅠ消化，并通過分子克隆將其插入用EcoRI和KpnⅠ切割的芽孢桿菌屬表達(dá)載體PBHA-1中，從而得到載體PGB11β-2(參見圖36)。
(b)芽孢桿菌屬的轉(zhuǎn)化通過用NdeⅠ消化PGB11β-2，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離往返質(zhì)粒的大腸桿菌部分，然后重新連接(如例18中所述)并轉(zhuǎn)化枯草桿菌1A40(BGSC1A40)足夠的細(xì)胞，將“HpaⅡ”芽孢桿菌屬啟動子引入P45011βcDNA序列的上游。對新霉素抗性菌落進(jìn)行分析并得到質(zhì)粒PGB11β-3，所得到的質(zhì)粒PGB11β-3也被傳遞給地衣形芽孢桿菌宿主株T5(CBS470.83)。
例22P45011βcDNA酵母菌表達(dá)載體的構(gòu)建以及酵母菌宿主Kluyveromyces lactis的轉(zhuǎn)化(a)表達(dá)基因的構(gòu)建對于酵母菌表達(dá)載體PGB950，修飾了側(cè)鏈序列的整長P45011βcDNA可通過PCR方法(例18中所述)用PGB11β-1作為模板和兩種特異P45011β寡聚物作為引物獲得。
寡聚物11β-6(5′-CTTCAGTCGACAAAAATGGGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC-3′)含有21個與成熟的P45011βcDNA序列從72至93號位互補的堿基，以及產(chǎn)生一個SalⅠ限制性位點、一個最佳酵母菌轉(zhuǎn)譯信號和一個ATG起始密碼子的另外18個堿基。
寡聚物11β-5在例21(a)中進(jìn)行了描述。在用提到過的模板與P45011β引物進(jìn)行PCR放大后，將放大的片段(1.45Kb)用SalⅠ和XhoⅠ消化，并通過分子克隆將其插入用SalⅠ切割的酵母菌表達(dá)載體PGB950中，從而得到載體PGB11β-4(圖37)。
(b)K.lactis的轉(zhuǎn)化在乳糖酶啟動子中單拷貝的SacⅡ位點處切割15μgPGB11β-4，并如例5(C)所述方法進(jìn)行K.lactisCBS2360的轉(zhuǎn)化。
例23編碼了牛腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白(ADX)的整長cDNA的分子克隆與構(gòu)建，以及隨后在酵母菌K.lactis中ADXcDNA的轉(zhuǎn)化與表達(dá)(a)ADX的分子克隆對于酵母菌表達(dá)載體PGB950，修飾了5′和3′側(cè)鏈序列的整長ADXcDNA可通過用PCR方法放大(參見例18)直接由牛腎上腺皮質(zhì)mRNA/cDNA庫獲得(詳見例1)。
為放大ADXcDNA，合成了兩個合成的寡聚物引物。
根據(jù)Okamura等人所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，5705-5709，1985)，寡聚物ADX-1(5′CTTCAGTCGACAAAAATGAGCAGCTCAGAAGATAAAATA-3′)含有21個與成熟的ADXcDNA序列的5′端從173至194號位互補的堿基。該寡聚物ADX-1在5′端含有另外18個生成一個SalⅠ限制性位點、一個最佳酵母菌轉(zhuǎn)譯信號和一個ATG起始密碼子的核苷酸。
寡聚物ADX-2(5′-TGTAAGGTACCCGGGATCCTTATTCTATCTTTGAGGAGTT-3′)與ADXcDNA頁鏈的3′端從561至540號位互補，另外它含有一些生成BamHI、SmaⅠ和KpnⅠ限制性位點的核苷酸。
如例18所述，以1μM的每種ADX引物及10μlmRNA/cDNA混合物(如例1所述)作為模板進(jìn)行聚合酶的鏈反應(yīng)(PCR)。
ADXcDNA放大的圖解被表示在圖38上。
放大的片段含有整長的修飾了側(cè)鏈的ADXcDNA序列，它的特性由限制性位點分析以及核苷酸定序來描述。
(b)表達(dá)載體的構(gòu)建將放大的ADXcDNA片段用SalⅠ和SmaⅠ消化，并通過分子克隆將其插入用SalⅠ和EcoRV切割的酵母菌表達(dá)載體PGB950。所得到的質(zhì)粒PGBADX-1被表示在圖38中。
(c)K.lactis的轉(zhuǎn)化在乳糖酶啟動子中的單拷貝SacⅡ位點處切割15μgPGBADX-1，并按例5(C)所述的方法進(jìn)行K.lactisCBS2360的轉(zhuǎn)化。
(d)轉(zhuǎn)化株的分析選擇兩種轉(zhuǎn)化株ADX-101-5，ADX102以及對照株CBS2360進(jìn)行進(jìn)一步的分析。這些菌株于30℃在YEPD培養(yǎng)基中生長約64小時。如例5(d)所述分離出總的細(xì)胞蛋白質(zhì)。從上清液中取8μl樣品進(jìn)行免疫印跡分析(參見圖39，行3、4和5)。
結(jié)果表明，所預(yù)期長度(14KDa)的蛋白質(zhì)在用PGBADX-1轉(zhuǎn)化的K.lactis細(xì)胞中得到表達(dá)。
轉(zhuǎn)化株ADX-102在活體外的活性在例24中被描述。
例24從K.lactisADX-102中得到的腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白在活體外的活性按照例23所述得到的K.lactis ADX-102以及對照株K.lactis CBS2360于30℃在100ml YEPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物，2%胨，2%葡萄糖-水合物)中生長56小時，該培養(yǎng)基中含有2.5ml6.7%(W/V)酵母菌氮基(Difco實驗室)溶液以及100mg1-1發(fā)生素(G418 Sulphate;Gibco Ltd)。離心(4000×g，15分鐘)收集細(xì)胞，重新懸浮于生理鹽水中并用磷酸鹽緩沖液(PH7.0，50mM)沖洗。經(jīng)離心(4000×g，15分鐘)后沉淀物再次懸浮于磷酸鹽緩沖液(PH7.0，50mM)中，從而得到一個每毫升含有濕重0.5g細(xì)胞的懸浮液。用Braun MSK勻漿器(6×15秒，0.45-0.50mM的玻璃珠)將細(xì)胞打碎。離心(4000×g，15分鐘)除去未破碎的細(xì)胞。將無細(xì)胞的提取物(每毫升40mg蛋白質(zhì))在-20℃貯存。
通過P450SCC活性分析對無細(xì)胞提取物中ADX活性、即從腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶向細(xì)胞色素P450SCC傳遞電子的能力進(jìn)行測定，所分析的混合物由下列溶液組成溶液A(除ADX外的天然P450SCC電子供給系統(tǒng))50mM磷酸鉀緩沖液(PH7.0)，其中含有3mM EDTA、2μM腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(由牛腎上腺皮質(zhì)提純)、1mM NADPH(電子供體)、15mM葡萄糖-6-磷酸鹽以及16單位/ml葡萄糖-6-磷酸鹽-脫氫酶(NADPH再生系統(tǒng))。
溶液B(底物與酶)75μM膽固醇的膠囊溶液(用〔26，27-14C〕膽固醇(40Ci/mol)與〔7α-3H〕膽固醇(400Ci/mol)雙放射標(biāo)記)以及在10%(V/V)Tergitol(注冊商標(biāo))NP40/乙醇(1∶1V/V)中的1.5μM P450SCC(由牛腎上腺皮質(zhì)提純)。
分析首先將75μl溶液A與50μl溶液B和125μl無細(xì)胞提取物或125μl磷酸鉀緩沖液(50mM，PH7.0)混合，該緩沖液中含有10μM ADX(由牛腎上腺皮質(zhì)提純)?；旌衔镌?0℃輕輕攪拌。在保溫15分鐘后取出樣品并用100μl水稀釋。用100μl甲醇及150μl氯仿從樣品中萃取出底物與產(chǎn)物。離心后(5000×g，2分鐘)收集氯仿層并使其干燥。將干燥的殘余物溶于50μl含有0.5mg類固醇混合物(膽固醇、孕甾烯醇酮與孕酮(1∶1∶1W/W/W))的丙酮中，然后加入110μl濃甲酸。懸浮液在120℃加熱15分鐘。然后通過雙標(biāo)記液體閃爍計數(shù)測定14C/3H的比值。這個比值是側(cè)鏈斷裂反應(yīng)的一個直接量度，因為在加熱過程中，14C標(biāo)記的側(cè)鏈以異辛酸的形式從混合物中蒸發(fā)掉了。
在K.lactisADX102的無細(xì)胞提取物中，利用這種分析能夠很容易地證明ADX的電子受體活性。在用K.lactisADX-102的無細(xì)胞提取物或用提純的ADX進(jìn)行的分析中，在15分鐘之內(nèi)，50%的膽固醇側(cè)鏈發(fā)生斷裂，而在用對照株K.lactisCBS2360的無細(xì)胞提取物進(jìn)行的分析中未檢測到側(cè)鏈斷裂。
例25編碼了牛腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白氧化-還原酶(ADR)的整長cDNA的分子克隆與構(gòu)建，以及隨后在酵母菌K.lactis中ADRcDNA的轉(zhuǎn)化(a)腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白氧化-還原酶的分子克隆如例1所述，通過一次修飾制備牛腎上腺皮質(zhì)cDNA庫。將另一種具有5′-GGCTGGGATCTAGGC-3′核苷酸序列的ADR特異引物(寡聚物ADR-1)加入到合成cDNA第一鏈的反應(yīng)混合物中。寡聚物ADR-1位于1494至1480位的轉(zhuǎn)譯中止子的下游。所述ADR寡聚物的核苷酸序列及位置圖都是由Nonaka等人(Biochem.Biophys.Res.Comm.145(3)，1239-1247，1987)所述的ADRcDNA序列資料得到的。
所得到的cDNA庫用32P標(biāo)記的寡聚物ADR-2(5′-CAC CAC ACA GAT CTG GGG GGT CTG CTC CTG TGG GGA-3′)進(jìn)行篩選。
對4個雜交Pfu′s進(jìn)行鑒定并提純。但是只有1個Pfu還顯示出寡聚物ADR-3(5′-TTGCATCAGCCGCTTCCTCGGGCGAGCGGCCTCCCT-3′)的陽性信號，該寡聚物位于ADRcDNA的中間(840至805號位置)。該ADRcDNA插入段(約2Kb)被分子克隆于PTZ18R的EcoRI位點。
限制性酶圖及核苷酸定序表明所得到的質(zhì)粒PGBADR-1含有整長的ADRcDNA。PGBADR-1的物理圖表示在圖40中。
(b)表達(dá)基因盒的構(gòu)建對于酵母菌表達(dá)載體PGB950，通過PCR方法(參見例18)，以PGBADR-1作為模板和兩種特異的ADR寡聚物作為引物，得到對側(cè)鏈序列進(jìn)行了修飾的整長ADRcDNA。
寡聚物ADR-4(5′-CGAGTGTCGACAAAAATGTCCACACAGGAGCAGACC-3′)含有18個從96至114號位與成熟的ADRcDNA序列互補的堿基，以及18個引入一個SalⅠ限制性位點、一個最佳酵母菌轉(zhuǎn)譯信號和一個ATG起始密碼子的堿基。
寡聚物ADR-5(5′-CGTGCTCGAGGTACCTCAGTGCCCCAGCAGCCGCAG-3′)含有18個與在1479位轉(zhuǎn)譯中止子上游的ADRcDNA的負(fù)鏈互補的堿基，以及15個用于在各種表達(dá)載體中進(jìn)行分子克隆的KpnⅠ和XhoⅠ限制性位點。
在用上述模板與ADR引物進(jìn)行放大后，放大的片段(1.4Kb)用SalⅠ和XhoⅠ消化，并通過分子克隆將其插入用SalⅠ和XhoⅠ切割的酵母菌表達(dá)載體中。
所得到的質(zhì)粒PGBADR-2被表示在圖40上。
(c)K.lactis的轉(zhuǎn)化在乳糖酶啟動子中單拷貝的SacⅡ位點處切割15μgPGBADR-2，并如例5(C)所述方法進(jìn)行K.lactisCBS2360的轉(zhuǎn)化。
例26編碼了牛NADPH細(xì)胞色素P450還原酶(RED)的整長cDNA的分子克隆用32P標(biāo)記的合成寡聚物5′-TGC CAG TTC GTA GAG CAC ATT GGT GCG TGG CGG GTT AGT GAT GTC CAG GT-3′對例1中所描述的牛腎上腺皮質(zhì)cDNA庫進(jìn)行篩選，如Katagari等人(J.Biochem.，100，945-954，1986)與Murakami等人(DNA，5，1-10，1986)所述，該寡聚物對大鼠、豬和兔RED的保守氨基酸區(qū)是特異的。
獲得5個雜交的Pfu′s，并進(jìn)一步用限制性酶圖及核苷酸定序來描述它們的特性。將整長的REDcDNA插入表達(dá)載體并按照例2、3和6所述方法將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的宿主。
例27編碼了蛋白質(zhì)P450SCC與酵母菌K.lactis中的ADX的表達(dá)基因盒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與表達(dá)(a)表達(dá)基因盒的構(gòu)建將表達(dá)基因盒PGBADX-1(參見例23)用SacⅡ和HindⅢ(部分地)消化，利用KlenowDNA聚合酶填充粘性末端。分離由部分乳糖酶啟動子(但仍保持其功能)、編碼ADX序列和乳糖酶終止子組成的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化，然后將其插入PGBSCC-7，PGBSCC-7首先經(jīng)XbaⅠ消化使其線性化(參見例5(6))，并用KlenowDNA聚合酶填充粘性末端。按照這樣一種方式進(jìn)行構(gòu)建，產(chǎn)生一個單拷貝的限制性位點(SacⅡ)，這個位點是將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至K.lactis中所必需的。這個單拷貝SacⅡ限制性位點位于乳糖酶啟動子序列的SCC側(cè)鏈序列中，因為乳糖酶啟動子ADX側(cè)鏈序列中的SacⅡ限制性位點被這種填充反應(yīng)破壞了。所得到的表達(dá)基因盒PGBSCC/ADX-1含有分別被乳糖酶啟動子控制的SCC和ADX的編碼序列。
(b)K.lactis的轉(zhuǎn)化如例5(C)中所述方法，用在單拷貝SacⅡ限制性位點被線性化的PGBSCC/ADX-1進(jìn)行K.lactisCBS2360的轉(zhuǎn)化，選擇一種轉(zhuǎn)化株(SCC/ADX-101)以進(jìn)行SCC及ADX表達(dá)的研究。
(c)轉(zhuǎn)化株K.lactisSCC/ADX-101的分析如例5(d)中所述方法，從SCC/ADX-101及對照株CBS2360培養(yǎng)物制備細(xì)胞蛋白質(zhì)成分，并對它們進(jìn)行SDS/PAGE及Western印跡分析。印跡分別是用SCC和ADX的特異抗體作為探針得到的。與對照株相比較，轉(zhuǎn)化株SCC/ADX-101的細(xì)胞蛋白質(zhì)組分顯示出另外兩段所期望的長度(分別為53和14KDa)，反映出蛋白質(zhì)SCC與ADX的表達(dá)。轉(zhuǎn)化株SCC/ADX-101中兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可與只表達(dá)一種蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化株中觀察到的水平相比擬(對于SCC，參見圖15A，行3;對于ADX，參見圖39，行5)。轉(zhuǎn)化株SCC/ADX-101活體外的SCC活性及ADX活性在例28中已描述。
例28P450SCC以及從K.lactis SCC/ADX-101得到的腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白的活體外活性在30℃，按照例27所述方法得到的K.lactisSCC/ADX-101以及按照例5(d)中所述方法得到的對照株K.lactis SCC-101在1升YEPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物，2%胨，2%葡萄糖一水合物)中生長72小時，該培養(yǎng)基中含有100mg1-1發(fā)生素(G418 Sulphate;Gibco Ltd)。離心(4000×g，15分鐘)收集細(xì)胞，將其再懸浮于生理鹽水中并用磷酸鹽緩沖液(PH7.5，75mM)洗滌，在離心(4000×g，15分鐘)后，將沉淀物懸浮在磷酸鹽緩沖液(PH7.5，75mM)中，從而得到一個每毫升含濕重0.5g細(xì)胞的懸浮液。用Braun MSK勻漿器(6×15秒，0.45-0.50mM玻璃珠)將細(xì)胞打碎。離心(4000×g，15分鐘)除去未破碎的細(xì)胞。
在有NADPH和ADR存在下，通過對膽固醇側(cè)鏈斷裂反應(yīng)的測定，對無細(xì)胞提取物中蛋白質(zhì)復(fù)合物P450SCC/ADX進(jìn)行分析。所分析的混合物由下述溶液組成溶液A(除ADX外的天然P450SCC電子供給系統(tǒng))50mM磷酸鉀緩沖液(PH7.0)，其中含有3mM EDTA、2μM腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(由牛腎上腺皮質(zhì)提純)、1mM NADPH(電子供體)、15mM葡萄糖-6-磷酸鹽及16單位/毫升葡萄糖-6-磷酸鹽-脫氫酶(NADPH再生系統(tǒng))。
溶液B(底物)于10%(V/V)Tergitol(注冊商標(biāo))NP40/乙醇(1∶1，V/V)中的37.5μM膽固醇膠囊溶液(用〔26，27-14C〕膽固醇(40Ci/mol)和〔7α-3H〕膽固醇(400Ci/mol)雙放射標(biāo)記)。
分析首先將75μl溶液A與50μl溶液B及125μl無細(xì)胞提取物混合。在30℃輕輕攪拌混合物。在保溫60分鐘后取出樣品，并用100μl水稀釋。用100μl甲醇和150μl氯仿從樣品中萃取底物和產(chǎn)物。離心后(5000×g，2分鐘)收集氯仿層并使之干燥。將干燥的殘余物溶于50μl丙酮，其中含有0.5mg類固醇混合物(膽固醇、孕甾烯醇酮和孕酮(1∶1∶1，W/W/W)，然后加入110μl濃甲酸。
在120℃將懸浮液加熱15分鐘。然后通過雙標(biāo)記液體閃爍計數(shù)測定14C/3H的比值，該比值是側(cè)鏈斷裂反應(yīng)的一個直接量度，因為在加熱過程中14C標(biāo)記的側(cè)鏈以異辛酸的形式從混合物中蒸發(fā)掉了。
利用這種分析證明了K.lactisSCC/ADX-101在無細(xì)胞提取物中膽固醇側(cè)鏈的斷裂活性，而在K.lactisSCC-101的無細(xì)胞提取物中沒有能檢測到活性。通過HPLC分析的方法，對由K.lactisSCC/ADX-101無細(xì)胞提取物產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物鑒定是孕甾烯醇酮。
權(quán)利要求
1.一種在重組宿主中操作的表達(dá)基因盒，包括一個編碼了一種蛋白的異源DNA編碼序列，該蛋白能單獨地或與一個或多個另外的蛋白共同合作、在膽甾醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松的生物學(xué)途徑中具有催化氧化作用步驟的功能，這個步驟選自于由以下組成的組膽甾醇轉(zhuǎn)化成孕甾烯醇酮；孕甾烯醇酮轉(zhuǎn)化成孕酮；孕酮轉(zhuǎn)化成17α-羥基孕酮；17α-羥基孕酮轉(zhuǎn)化成11－脫氧皮甾醇；和11-脫氧皮甾醇轉(zhuǎn)化成氫化可的松。以及在所述宿主中起作用的相應(yīng)的控制序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種表達(dá)基因盒，其特征在于其中的異源DNA編碼序列編碼了至少兩種蛋白質(zhì)，這兩種蛋白質(zhì)單獨地或與一種或多種蛋白質(zhì)合作、具有催化權(quán)利要求1組中的至少兩個氧化步驟的功能。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)基因盒，其特征在于它至少含有一個另外的異源DNA，該DNA具有它自己的起作用的控制序列，編碼了一種蛋白質(zhì)，能單獨地或與一個或多個另外蛋白質(zhì)共同合作、具有催化權(quán)利要求1組中的一個氧化步驟的功能。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一權(quán)利要求的表達(dá)基因盒，其特征在于所述蛋白質(zhì)選自由以下組成的組側(cè)鏈裂解酶(P450SCC);腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白(ADX);腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(ADR);3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶(3β-HSD);類固醇-17α-羥化酶(P45017α);NADPH細(xì)胞色素P450還原酶(RED);類固醇-21-羥化酶(P450C21)和類固醇-11β-羥化酶(P45011β)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的表達(dá)基因盒，其特征在于所述異源DNA編碼序列來源于牛種屬。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的表達(dá)基因盒，其特征在于該異源DNA編碼了至少一種權(quán)利要求4的組中的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5的表達(dá)基因盒，其特征在于它至少含有另一個異源DNA，該DNA具有它自己的起作用的控制序列，編碼了權(quán)利要求4組中的一種蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的表達(dá)基因盒，其特征在于該異源DNA編碼了牛P450SCC和牛的ADX。
9.根據(jù)權(quán)利要求5中的表達(dá)基因盒，其特征在于該異源DNA編碼了酶P450SCC，并且該表達(dá)基因盒取自于用PGBSCC-n表示的組，其中n是1至17的任一整數(shù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的表達(dá)基因盒，其特征在于該異源DNA編碼了酶P45017α，并且該表達(dá)基因盒取自于用PGB17α-n表示的組，其中n是1至5的任一整數(shù)。
11.根據(jù)權(quán)利要求5的表達(dá)基因盒，其特征在于該異源DNA編碼了酶P45021C，并且該表達(dá)基因盒取自于用PGBC21-n表示的組，其中n是1至9的任一整數(shù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求5的表達(dá)基因盒，其特征在于該異源DNA編碼了酶P45011β，并且該表達(dá)基因盒取自于用PGB11β-n表示的組，其中n是1至4的任一整數(shù)。
13.一種重組宿主細(xì)胞及其子代，包括有微生物、植物或動物的細(xì)胞，并含有異源DNA的表達(dá)基因盒，其特征在于該表達(dá)基因盒為權(quán)利要求1至12的任一權(quán)利要求中的表達(dá)基因盒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的重組宿主細(xì)胞及其子代，其特征在于該宿主是一種微生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的重組宿主細(xì)胞及其子代，其特征在于該宿主是一種酵母菌(Saccharomyces)、Kluyveromyces或桿菌(Bacillus)或者是大腸桿菌(EscherichiaColi)。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15的任一權(quán)利要求的重組宿主細(xì)胞及其子代，其特征在于它至少含有兩個如權(quán)利要求1至12的任一權(quán)利要求中限定的表達(dá)基因盒。
17.一種由重組細(xì)胞制備外源蛋白的方法，包括在能形成所述蛋白質(zhì)并在培養(yǎng)物中累積的培養(yǎng)條件下將重組細(xì)胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其特征在于該重組細(xì)胞是權(quán)利要求13至15的任一權(quán)利要求限定的重組宿主細(xì)胞。
18.一種在營養(yǎng)培養(yǎng)基中、在能形成所述蛋白質(zhì)并在培養(yǎng)物中累積的培養(yǎng)條件下、由一種重組細(xì)胞制備外源蛋白混合物的方法，其特征在于所述的重組細(xì)胞是如權(quán)利要求16所限定的重組宿主細(xì)胞。
19.一種用于體外選擇性生物氧化的方法，該方法包括在一種或多種蛋白質(zhì)存在時，在能夠發(fā)生所述氧化并使氧化化合物能在培養(yǎng)液中累積的條件下，保溫待氧化的化合物，再回收氧化后的化合物，其特征在于所述的一種或多種蛋白質(zhì)是通過權(quán)利要求17或18的方法生產(chǎn)的。
20.一種氧化一個選取的化合物的方法，該方法包括在所述化合物存在時，在能夠發(fā)生所需的氧化作用并能在培養(yǎng)液中累積該氧化后的化合物的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)重組細(xì)胞再回收氧化后的化合物，其特征在于所述重組細(xì)胞是權(quán)利要求13至16的任一權(quán)利要求中的重組宿主細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其特征在于該氧化作用選自于以下組中的一個氧化作用裂解甾醇化合物的側(cè)鏈產(chǎn)生孕甾烯醇酮;孕甾烯醇酮轉(zhuǎn)化成為孕酮;孕酮轉(zhuǎn)化成為17α-羥基孕酮;17α-羥基孕酮轉(zhuǎn)化成11-脫氧皮甾醇和11-脫氧皮甾醇轉(zhuǎn)化成氫化可的松。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其特征在于該氧化作用是裂解甾醇化合物的側(cè)鏈，得到孕甾烯醇酮。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其特征在于該氧化作用是孕酮的17α-羥化作用。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其特征在于在同一底物分子上一步完成所述組中至少兩個氧化作用。
25.含有根據(jù)權(quán)利要求19-24的任一權(quán)利要求的方法制備的活性化合物的藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有新的表達(dá)基因盒的遺傳工程方法得到的宿主細(xì)胞，它能完成類固醇的生物化學(xué)氧化作用，尤其是用導(dǎo)入了編碼了與膽甾醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松的生物途徑有關(guān)的蛋白質(zhì)的DNA的細(xì)胞來完成氧化作用。合適的宿主細(xì)胞有桿菌屬(Bacillus)、酵母菌屬(Saccharomgces)或Kluyveromyces的菌種。這些新的宿主細(xì)胞適合于膽甾醇，導(dǎo)甾烯醇酮、孕酮、17α-孕酮和11-脫氧皮質(zhì)醇的微生物氧化作用，它們是所述生物途徑的中間產(chǎn)物。這些新的表達(dá)基因盒在最終產(chǎn)生一個一步完成膽甾醇向氫化可的松轉(zhuǎn)化的多基因系統(tǒng)中也是有用的。
文檔編號C12N15/09GK1038667SQ89104208
公開日1990年1月10日 申請日期1989年5月6日 優(yōu)先權(quán)日1988年5月6日
發(fā)明者荷曼·斯利杰克惠斯, 格拉杜斯·考尼利斯·瑪利亞·塞爾坦, 埃利克·巴斯提安·思馬爾 申請人:吉斯特-布羅卡迪斯公司