專利名稱：收集和探測微生物的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從難分離的環(huán)境樣品(如油井樣品及類似樣品)中收集、濃縮和回收微生物的方法，以及實施該方法的設(shè)備。上述方法可用于分析和鑒定微生物。
環(huán)境微生物的污染導(dǎo)致每年的設(shè)備和產(chǎn)品失效損失達數(shù)百萬美元。由于微生物污染使產(chǎn)品變質(zhì)，污染，腐蝕，成為劣質(zhì)品，以及降低熱交換能力。為監(jiān)測和控制有害的微生物群，需要一種能在現(xiàn)場使用，對微生物濃縮和回收的簡單的樣品加工技術(shù)。
硫酸鹽還原細菌(SRB)是對環(huán)境危害性最大的一種生物體。它們將引起石油加工和煉制(C.O.Obuekwe等，微生物工藝應(yīng)用，26，389-393，(1987))，冷卻水系統(tǒng)(J.W.McCroy.冷卻塔水的微生物學(xué)，化學(xué)出版公司，紐約，(1980))，廢水處理系統(tǒng)(G.Kobrin等，廢水處理槽，典型例，R.E.Tatnall編，材料性能，20，41～48，(1981))，漿液和紙生產(chǎn)(A.Piluso，材料性能，20，41～48(1981))中使用的金屬腐蝕并且應(yīng)力斷裂。SRB產(chǎn)生的硫化氫較之氰化氫更為致命，硫化物產(chǎn)品也可通過其它生物體產(chǎn)生硫酸(P.Bos等，金屬中的硫氧化細菌微生物學(xué)，18～27(1983))，使城市污水系統(tǒng)的混凝土迅速遭到破壞。SRB生物體污染排水溝(J.R.Postagte，在硫酸鹽還原細菌中，Cambridge大學(xué)出版，紐約，(1984))已成為嚴重的問題，一方面造成缺氧，另一方面，產(chǎn)生毒性的硫化氫，二者的共同作用將抑制海洋生命。
直到最近，環(huán)境微生物的微生物探測僅局限于實驗室培養(yǎng)液。一般說，這種培養(yǎng)方法是很慢的，要求幾天或幾周才能完成。它不適于需要控制生物體的現(xiàn)場檢測。因此培養(yǎng)方法僅在監(jiān)測和控制生物體方面有有限的意義。為了加快或省去這種培養(yǎng)方法，已研究出許多新的直接檢驗方法。但因為樣品復(fù)雜，微生物的種類繁多，以及分析不靈敏，因而還有許多困難。
環(huán)境樣品，如土壤，污物，地表水，尤其天然原油是復(fù)雜的混合物。這種混合物為即含固體又含易溶成分的多相物質(zhì)。樣品成份中常含有高濃度的固體沉淀物，膠體，乳狀物，易溶的和不溶的鹽，生物聚合物，生物降解碎片，惰性物質(zhì)，污染的工業(yè)和天然化學(xué)物質(zhì)。多相而復(fù)雜的環(huán)境樣品能阻礙直接檢測或使檢測失效。微生物可粘附在微粒上，因此通過一般依賴液體過濾的方法來提供微生物難以用于檢測。同樣，樣品中含有的化學(xué)或易溶物質(zhì)也會干擾和抑制檢測方法。如當顏色是分析手段時，樣品的顏色可能影響試驗結(jié)果。
在許多情況下，樣品材料所含微生物的量較小(102～105細胞/gm)，這使得微生物和/或它們的產(chǎn)品的直接檢測變得更加復(fù)雜。此外，在許多時候，微生物包含的不是單個的菌株或單個種屬，而是集合了多種不同類型的生物體。由于這些原因，直接檢測方法要求較高的靈敏度，并應(yīng)具有較寬范圍的特性或生物體選擇特性，如U.S.4，592，994所述。由于要求高靈敏度和寬范圍特性，直接檢測處理細胞和它們的產(chǎn)品(如直接的免疫測定法)將存在化學(xué)干擾。
圍繞這些問題，就要求能夠濃縮現(xiàn)場樣品中的少量生物體，并且不受干擾物質(zhì)影響的樣品處理方法。這些干擾物質(zhì)妨礙分析，引起誤差，結(jié)果失真。通常的處理方法包括離心，膜滲濾或化學(xué)沉淀等過程。
硅藻土過濾(DE)和木炭吸附等化學(xué)處理被廣泛用于飲用水處理和廢水處理中(Linstedt等，水研究，8，753-760(1947))。這些大規(guī)模的生產(chǎn)方法研究表明，上述過程在篩除碎屑，除去砂礫，澄清和生物過濾方面是有效的。這與工廠的操作參數(shù)和效率有關(guān)。最終的水過濾液基本上不含有顆粒和微生物。
由K.P.Lang′e等(J.Am水工程協(xié)會，78，76-84，(1986))報導(dǎo)的小型的工廠試驗表明100%寄生菌賈第蟲屬蘭(伯)氏鞭毛蟲屬(Giardia lamblia)囊可通過DE過濾在一較寬范圍的條件下被除去。較小的生物體如大腸桿菌狀的細菌也可以除去，但要受DE的等級的限制。一種硅藻土過濾器能從海水中除去異養(yǎng)細菌(J.Illingworth等，水產(chǎn)養(yǎng)殖，17，181～187，(1979))。借助于化學(xué)試劑和涂層的DE，可濾去病毒。R.De Leon等，水的研究，20，583～587，(1986)表明roto病毒和f2大腸桿菌噬體即使通過嚴格混合的介質(zhì)過濾也不能除去。然而，加入少量明礬和聚合物絮凝劑可以改進病毒的去除率。T.S.Brown等，J.Am.水工程協(xié)會，66，98～102(1974)，證實通過DE過濾可從水中除去病毒，即從水中去除T2噬菌體和脊髓灰質(zhì)炎病毒。然而，除去這些病毒還取決于病毒特性，如調(diào)節(jié)適當?shù)腜H值和選擇有效的DE涂層。
通常DE過濾適用于不含有高濃度的沉淀物或水藻的水處理，上述沉淀物或水藻會使過濾介質(zhì)緊固，背壓升高而阻滯流體流動。僅DE本身的生物過濾不能用在含高沉淀物或混合物的樣品中，如水/油乳狀液(K.P.Lang′e等，J.AWWA，78，76～84(1986))。由于上述原因，DE生物過濾技術(shù)僅局限于滿足如下條件的大工業(yè)和城市工廠密度高于水的樣品必須經(jīng)過預(yù)處理;流體流動的流體動力學(xué)可以控制;DE床層參數(shù)維持一定。因而，試圖用這種過濾方法從油井樣品中分離SRB，由于過濾器堵塞太快而歸于失敗。
滲濾是DE生物過濾最早采用的方式。然而，該過程操作緩慢，同時還必須非常注意不破壞最初的DE床層的孔結(jié)構(gòu)。這要求大部分設(shè)備其液體壓力在過濾過程自始至終都要加以控制。該設(shè)備不適于分析測試和現(xiàn)場使用。
DE生物過濾的第二種方式是細顆?；蚰z體的吸附作用;其中，微生物被二次吸附。DE表面上的電荷和在水樣品中的膠體限制了這種方法的使用。
將化學(xué)物質(zhì)直接加入到水中或同DE過濾聯(lián)合作用，可以防止生物過濾過程中的問題。這種物理/化學(xué)的處理方法是基于拌隨沉淀的化學(xué)絮凝過程以去除懸浮固體的方法。典型的絮凝劑是鋁或鐵鹽，可有效地除去磷和顆粒。Linstedt等，水研究，8，753～760(1974)表明明礬和其它的化學(xué)試劑能有效地從廢水中除去易溶的磷酸鹽，濁水，細菌和重金屬。Lee等，Lab.Pract.，23，297～298(1974)論述了采用硫酸鋁鉀化學(xué)絮凝有效地用于從單體培養(yǎng)液中通過沉淀回收細菌。
化學(xué)絮凝是易于適應(yīng)的過程，它一般不用于已獲得的微生物的分析測定。絮凝過程定量地取決于絮凝劑的濃度，樣品中存在的競爭的荷電物質(zhì)量和微生物上的電荷。如果參與競爭的物質(zhì)方面樣品材料很廣，微生物就不能夠重復(fù)回收。絮凝劑太多也會阻止絮凝。此外，絮凝劑可與進一步分析樣品所需的試劑反應(yīng)，或防止該反應(yīng)發(fā)生。絮凝劑可以增溶或改變細胞的化學(xué)成份是非常重要的。這樣，絮凝劑會損壞微生物的免疫反應(yīng)。由于這些原因，使用化學(xué)添加劑沒有成為收集，回收微生物和從它們當中除去污染的溶解物的有效方法。
US4，515，697公開了一種用于絮凝微量水藻或其它有機顆粒而不用添加試劑的方法。該方法是將含有欲富集的微量水藻或其它有機顆粒的溶液，以一定速度通過一固定的顆粒床層。所述的速度可使微量水藻或其它有機顆粒在過程中聚集，絮凝，并粘附在顆粒材料床層上。該專利中公開了使用砂子，陶瓷和燒制粘土顆粒作顆粒材料，但該專利并沒有說明怎樣定量收集。
同樣，WO87/00199公開了硅藻土可以不可逆地捕捉微生物或內(nèi)部結(jié)構(gòu)類似的顆粒，以及用硅藻土在纖維材料濃縮細菌。由此方法及濃縮過程，即可實現(xiàn)培養(yǎng)細菌實施生物反應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)。但該專利沒有說明如何有效地回收細菌。
GB2，189，317公開了用氫氧化三鈦懸浮液，使硫酸鹽還原細菌固定不動以便通過ELISA方法檢測。
本發(fā)明的目的是提供一種用來從環(huán)境樣品中收集和回收微生物的價廉的方法。該方法可以用于現(xiàn)場，便于直接檢測微生物和(或)其產(chǎn)品。本發(fā)明的進一步目的是提供一種用于免疫測定法或其它檢測方法時，用來濃縮生物體，并使其不干擾溶解物的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種采用廉價的普通生物過濾材料制得的以完成上述目的的裝置。
一種從樣品中收集微生物的方法包括在樣品容器內(nèi)，將樣品和吸附劑在流體介質(zhì)中混合，搖動混合物，懸浮微生物和吸附劑材料均勻地分布在樣品流體中;在樣品容器上配置一吸附劑收集帽，擠壓樣品流體通過吸附劑床層和吸附劑收集帽，排出樣品流體;可選擇地清洗吸附劑濾餅和在樣品回收裝置內(nèi)捕捉并吸附的微生物，重新懸浮濾餅顆粒，回收被微生物吸附劑富集和濃縮的微生物細胞和其組分，從吸附劑顆粒中分離微生物以便檢測和(或)分析。
一種收集微生物的方法，使用1～20g含固體物小于5%的樣品，將其放入一個為樣品體積3～10倍的樣品容器內(nèi)，每毫升流體樣品同10～60mg硅藻土(DE)，珍珠巖(MgAlSiO3)或堿金屬型或氫型沸石粘土顆粒組成的吸附劑混合，至少一半的吸附劑顆粒尺寸約為2～10微米。具體吸附劑選自硅藻土Cat＃1939-01J.B.Baker，Celite4\4，Kenite4\4 200，Celatom4\4，Cuno4\4M-901，Cuno4\4m802，Perflo4\4 200，Perflo4\4 63，Perflo 4\4 30;將樣品和吸附劑混合物搖動5～30砂，懸浮微生物和吸附劑顆粒，使其均勻地遍及樣品流體;在樣品容器上配制一吸附劑收集帽，擠壓樣品流體使其通過吸附劑收集帽中收集的吸附劑層;排出樣品流體，可選擇地在樣品回收裝置中清洗吸附劑層或濾餅，每次使用的清洗液約是初始樣品體積的10%;通常，將吸附劑顆粒和細胞再懸浮以回收欲收集的細胞;使稠密的吸附劑沉降，濃縮上層清液中的微生物用于后面的檢測和(或)分析。
本發(fā)明的方法包括從樣品中收集微生物，其中，樣品首先與吸附劑顆粒混合。吸附劑為一種能捕捉或吸附微生物的顆粒材料，其孔徑約為20μm，微生物不能通過;吸附劑密度大約為1.0g/cc，本發(fā)明性能優(yōu)良的吸附劑包括J.T.Baker硅藻土(Cat.＃1939-01)，Celite4\4，Kenite4\4200，Celatom4\4FW6，Cuno4\4M-901，Cuno4\4m802，Perflo4\4200，Perflo4\463，Perflo4\430，Alite4\4150，Alite4\4180，及其混合物。其中，J.T.Baker硅藻土(Cat.＃11939-01)，Celite4\4，Kenite4\4200，Calatom4\4FW6，Cuno4\4M-901，Cuno4\4m802，Perflo4\4200，Perflo4\463，Perflo4\430為優(yōu)選的吸附劑。水，土壤和其它物質(zhì)樣品重量為0.5～100g，優(yōu)選范圍是1～20g。如果樣品是干燥的或半固體物質(zhì)，則應(yīng)加入懸浮液，形成含有小于10%固體的懸浮液，固體含量最好小于5%;如樣品基本上為液體，則不必加懸浮液;液固混合物的液體部分作為樣品液體。
本發(fā)明方法包括采用如

圖1所示的樣品回收裝置。該裝置由樣品容器和吸附劑收集帽兩部分組成。圖1中，樣品容器由一柔性管狀殼體13構(gòu)成，其一端開孔，適于氣密地與吸附劑收集帽相連，樣品容器適于轉(zhuǎn)移吸附劑至收集帽。管狀殼體部分容積是樣品體積的2～20倍，最好為3～10倍。前述使用的微生物吸附劑(或溶劑(S))放在容器內(nèi)。
收集帽12有一空心的錐形管14，在管14的一端開有狹小的孔15，另一端開有大孔17，管的頂端形成狹窄的孔道以夾持多孔固定環(huán)16，其材料為聚乙烯或其它惰性纖維材料或類似的材料。大孔17與樣品容器氣密性地連接，樣品容器11用于盛裝吸附劑和樣品。小孔15的直徑為1.4～14mm，最好為2.8～6.9mm，多孔固定環(huán)16位于管的狹窄區(qū)域內(nèi)并被固定。所要求的樣品體積，決定了盛裝樣品和吸附劑的管的尺寸，帽的大孔直徑為5.6～56mm，最好為5.6～20.8mm。帽的大口徑部分有一腔室(容器室)23收集吸附劑和樣品固體。該容器室所需容積是吸附劑固體體積的1.5～5倍。
如上所述，將樣品流體18置于樣品容器11內(nèi)，搖動樣品和吸附劑顆粒19，使含有的微生物和吸附劑材料懸浮而均勻地遍布于樣品流體。吸附劑材料可隨意用于混合物中。為了提高吸附功能，可通過化學(xué)涂覆或接枝聚合對吸附劑顆粒進行表面處理。通過這些手段，顆粒表面得到改進，以提供適宜的用于細胞相互作用或改變其表面性質(zhì)(如潤濕性)的zeta勢，離心交換特性。吸附劑的用量取決于樣品體積。每毫升樣品流體所需吸附劑在10～170mg之間，最好為10～60mg。通常操作時，人工搖動樣品-吸附劑混合物5～30秒，可使樣品完全成為懸浮液19;使所使用的特種吸附劑顆粒懸濃將取決于樣品的類型和必要的搖動的程度。
吸附劑收集帽12連接于樣品容器上(見圖B)，頭朝下地將樣品回收裝置和管端倒置，如圖C。讓懸浮材料部分沉淀，直到厚1～5mm的吸附劑薄層形成在管內(nèi)20處。密度較大的吸附劑首先沉淀，一般該過程可在10～60秒內(nèi)完成，這取決于懸浮樣品的粘度和微生物吸附劑的密度。為不降低微生物的回收率，可采用較長的沉淀時間。
擠壓樣品容器使樣品流體被迫穿過吸附劑層而被排出。該步驟能去除一些易溶物質(zhì)，這些易溶物質(zhì)的存在會干擾以后的檢測分析。如果必要，可吸入清洗液并洗提吸附層20。通常，清洗液體積等于或小于原始樣品流體體積。最好使用較少的清洗液。一般清洗液為原始樣品流體體積的10%，這對排除易溶物是有效的，這取決于溶解物的濃度和干擾的機制。
在吸附劑層20中富集和濃縮的生物體被轉(zhuǎn)移回樣品容器內(nèi)而用于檢測和(或)分析。首先加入“檢測流體”22，倒轉(zhuǎn)樣品回收裝置，使樣品容器11在帽12的下面(如圖D)，搖動裝置，使流體中的吸附劑和所夾持的微生物重新絮凝。如果希望完全回收生物體，則讓固體沉淀，拿去吸附劑帽后，輕輕倒出含有重新絮凝的微生物的上層清液。在一較佳的實施例中，檢測生物體細胞內(nèi)或溶劑化的成份是有重義的，在檢測液一吸附劑混合物中的微生物被溶解了，然后，檢測液22從固體中分離出來，這可以通過擠壓樣品容器使流體通過吸附劑收集帽得以完成。生物體可以通過對檢測液中的吸附劑-微生物混合物進行聲處理而溶解出來。另外檢測液也可含溶解劑(S)。
本發(fā)明所述的方法，使用硅藻土，DE，或類似的吸附劑顆粒，其中至少一半的顆粒尺寸在2～10微米之間;特別設(shè)計的樣品回收裝置，能充分回收微生物(回收率至少60%)，本發(fā)明易于除去干擾的溶解物，最終的微生物易于鑒別或分析;另外，本方法現(xiàn)場使用方便，迅速，價格低廉。
實例和對照實驗下列實例和對照實驗有助于完整地說明所采用的樣品加工方法和樣品回收裝置。
試劑和材料現(xiàn)場樣品產(chǎn)品油井樣品(有關(guān)11)取自ConocoNorthEastCherokee鉆井場。將從油田生產(chǎn)水中分離析出的已知DesulfovibriodesulfuricansG100A純凈菌株的細菌添加到樣品中。
細胞檢測當樣品中SRB濃縮到一定程度時，使用相襯顯微鏡在Petroff-Hauser計數(shù)器內(nèi)直接檢測以確定其細胞數(shù)。
然而，通常SRB濃度太低，不能直接用顯微鏡檢測。為此，可采用對照SRB生物體腺苷-5′-硫酸磷(APS)還原酶的免疫測定法間接地測定，該方法公開于US專利申請?zhí)枮?46，547中。在所有已知的SRB生物體中均發(fā)現(xiàn)APS還原酶為一種細胞內(nèi)的酶。如前所述，樣品經(jīng)超聲處理大約60秒，從而破開細菌的細胞，釋放出APS還原酶。
試驗緩沖劑三緩沖劑(TRISBUFFER)(50mM，PH7.5)氯化鈉(75mM)，0.1%低泡洗滌劑(SL-18)，BSA(0.1%)，疊氮化物(0.02%)。
TRIZMA＊HCL (mwt.157.6)6.35gmTRIZMA＊BASE (mwt.121.14)1.18gm氯化鈉(mwt.58.45)4.38gm牛血清白蛋白1.00gmSL-18聚Tergent4\41.0ml疊氮化鈉0.20gm純化水1000ml＊三-氫-甲基氨甲烷，由Sigma Chemical Corporation生產(chǎn)。將試劑溶解于水中，pH值調(diào)節(jié)到7.4～7.6之間。
清洗液三緩沖劑(50mM，pH7.4)，疊氮化物
(0.05%)TRIZMA＊HCl 6.61GMTRIZMA＊BASE 0.97GM疊氮化物0.50GM水1000Ml將溶液的pH值調(diào)節(jié)到7.3～7.4之間，用一無菌的過濾器過巳芤?，?°貯藏。
PNP顯色試劑，在二乙醇胺緩沖劑內(nèi)混合溶解了的0.1%P-硝基苯磷酸鹽制得試劑上緩沖劑組成為二乙醇胺97mlMgCl20.1g疊氮化鈉0.2g精制水1000mlAPS還原酶免疫法典型的免疫測定法檢驗如下按照Imagawa，J.Biochem.92，1413(1982)中所述的方法，首先將2.0μl家兔抗-APS堿性磷酸酶抗體共軛溶液加到0.2ml試驗緩沖液的樣品材料中。如果樣品材料包含的是完整的細胞，則首先對試驗混合物聲處理90秒，將混合物置于室溫下3分鐘，然后加入單個的(直徑為4.0mm)固相抗APS抗體試劑粒狀物，在室溫下攪拌混合物15分鐘，用1.0ml新鮮的試驗緩沖劑分4次連續(xù)清洗粒狀物，然后用0.5mlPNP顯色試劑于室溫下平衡15分鐘。采用FlowLaboratories(Mclean，VA22102)微滴定板指示器在405nm測量溶液(0.2ml)的顏色變化。
對照實驗A現(xiàn)場樣品對直接SRB測定法的影響該對照實驗表明在含有干擾物質(zhì)的油流體樣品中離析和檢測微生物所遇到的困難。從石油生產(chǎn)裝置獲取的四種含水樣品和從工業(yè)冷卻塔獲取的附加樣品被用來試驗。通過APS還原酶免疫法確定SRB檢測的容許含量，上述樣品中可含有化學(xué)物質(zhì)和固體物質(zhì)。可以直接檢測樣品，也可以在排降假定的污染之后檢測。上述樣品代表了油生產(chǎn)各階段各類型水，包括從注水現(xiàn)場注入的水，從井口直接抽出的生產(chǎn)水和從分離罐分離的水。每種樣品接種SRB，濃度達2×106細胞/ml，SRB培養(yǎng)物也是樣品來源之一。如上所述，證明可能存在干擾物質(zhì);每次樣品都做了直接(即沒有清洗或其它處理)檢測，也在離析和清洗存在的細胞之后進行了檢測。
直接試驗是將每種樣品取出0.2ml，經(jīng)聲處理90秒，按照上述APS還原酶測定法檢測以用于SRB濃縮。為制備沒有干擾物的樣品，每種樣品取出1.0ml，用0.45μm無菌膜過濾器過濾。取2.0ml試驗緩沖液通過過濾器漂洗過濾器收集的固體沉淀物，再用1.0ml強脈沖試驗緩沖劑反沖洗掉每個過濾器上的固體。取已過濾的細胞的懸浮部分(0.2ml)，經(jīng)聲處理，用APS還原酶免疫測定法進行APS還原酶測定。表A給出過濾器APS的響應(yīng)值。同樣用二種處理方式以測試SRB培養(yǎng)物(0.2ml)。
表A中列出了試驗結(jié)果的比較值，說明在大部分現(xiàn)場試驗樣品中存在有抑制物質(zhì)。如上所述，數(shù)字代表了按照APS還原酶免疫測定法目測所得到的密度讀數(shù)。
表A樣品類型直接APS響應(yīng)值過濾器APS響應(yīng)值變化%(O.D.405nm)(O.D.405nm)培養(yǎng)物＊0.95 1.00 5油樣品A0.791.1934油樣品B0.771.3443油樣品C1.141.104油樣品D0.801.2634冷卻水1.221.285＊從實驗室SRB培養(yǎng)液中取出的沒有抑制的對照樣品。
實例1從油井生產(chǎn)水樣品中收集和回收硫酸鹽-還原細菌(SRB)。
取沒有抑制的油樣品，向該樣品中加入SRB，濃度達2×106SRB/ml樣品，在1.5ml上述配制的油樣品中加入50mg J.T.Baker(Phillipsburg，NJ08865)硅藻土(DE)(＃1939-01)，搖動盛放混合物的樣品容器15秒，然后沉降1.0分鐘直至形成薄的DE層。擠壓含油的上層清液通過DE層并排出。
為測定回收的細菌細胞，將1.5ml試驗緩沖劑加入到容器中，帽附在容器上，帽內(nèi)DE固體以濾餅的形式被回收。連同濾餅取下吸附劑收集帽，在樣品容器內(nèi)使樣品混合物重新絮凝，并經(jīng)聲處理90秒而釋放出APS酶。讓DE沉淀，取200μl含酶的上層清液(檢測液)用APS還原酶免疫測定法檢測。
為測定回收SRB的相對效率，比較上述試驗樣品和對照實驗樣品的結(jié)果。對照實驗樣品其SRB通過下述步驟回收首先通過-0.45μm的無菌膜過濾器，然后擠壓脈沖1.5ml的新鮮試驗緩沖液反洗過濾器上的細胞。取200μl該溶液，用聲處理90秒，然后按上述方法檢測。在該樣品上標注對照實驗標記。
為測定100%細胞回收(100%對照實驗)，直接測試接種的油樣品。
表1所示結(jié)果表明從油/水樣品中采用DE生物過濾處理以回收SRB細胞是有效的。上油/水樣品對用0.45μm無菌膜過濾器給出大體相同的細胞回收率。
表1油處理試驗結(jié)果回收率%(O.D.405nm)試驗DE1.3977%對照實驗0.45μm過濾器1.4782%100%對照本底無1.78100%實例2從油井樣品中回收SRB細胞吸附劑濃度對回收率的影響。
該實例說明用于從微生物呈懸浮狀的流體中回收微生物時，吸附劑用量將影響微生物回收的完整性。
從J.T.Baker，Supra，(Cat.＃1939-1)購買來的各種數(shù)量不同的硅藻土裝入上述的7個樣品回收裝置中。取2ml從生產(chǎn)油井中得到的含1×106SRB細胞/ml的液體樣品，將其加入到每個樣品的回收裝置中。處理樣品，按照上述的APS還原酶免疫測定法檢測。
表2所示結(jié)果表明，吸附劑濃度影響細胞回收率。用這種尺寸的油井樣品，使用的吸附劑量為每毫升樣品40～80mg時可獲得最佳回收率。
表2硅藻土mg/ml樣品平均試驗響應(yīng)值(0.D.405nm)50.86101.07151.49251.50401.61601.64801.601601.68實例3改變SRB細胞濃度對細胞的回收率下面實例表明，微生物可在環(huán)境樣品經(jīng)常出現(xiàn)的較寬范圍的細胞密度下有效地回收細胞。
在該實例中，如材料部分所述，生產(chǎn)油井樣品接種多種濃度的SRB，濃度達到0.5×106細胞/ml樣品，用這些樣品采用本發(fā)明的吸附劑方法測量細胞回收率。每個樣品回收裝置中盛有80mg吸附劑/ml樣品，并通過0.45μm無菌膜過濾器過濾。
為說明兩種方法的相對的回收率，對照樣品不含有抑制劑溶解物，該樣品是通過接種50mM的三緩沖劑而制得的，緩沖劑的細胞密度同接種油田樣品一樣。全部樣品經(jīng)聲處理90秒，然后用APS還原酶免疫法進行APS還原酶檢測。等分對照實驗試樣(1.5ml)，不用任何處理而直接分析。由對照實驗樣品決定的APS還原酶量被認為是代表著包含于每種濃度的接種SRB內(nèi)100%的可探測的APS酶。
采用本發(fā)明的方法，取不同細胞密度的每種樣品1.5ml回收細胞。將每種樣品1.5ml通過一0.45μm無菌膜過濾器(Gelman，SciencesInc.AnnArbor，MI48106)。而完成回收細胞過程。然后取2.0ml清洗液通過過濾器清洗回收的細胞。進一步，用1.5ml樣品緩沖劑進行強的反沖洗而從過濾器上得到的回收的細胞，反沖洗是用10ml注射液使流體通過過濾膜而完成的。
表3所示結(jié)果表明用本發(fā)明的方法對所有試驗的細胞密度都可以有效地回收細胞。采用無菌的膜過濾器而完成本發(fā)明，樣品中幾乎100%的可檢測的免疫APS還原酶可被測量。這些結(jié)果表明本發(fā)明中使用的微生物吸附劑不僅能很好地回收微生物，而且不干擾檢測試劑或分析。
表3細胞密度對細胞回收的影響添加SRB對照實驗樣品發(fā)明的吸附劑方法0.45μm過濾器細胞數(shù)/ml(O.D.405nm)(O.D.405nm)(O.D.405nm)0.5×1071.69 1.78 1.640.5×1060.80 0.76 0.670.5×1050.16 0.19 0.120.5×1040.05 0.08 0.0400.040.070.08后3列是以APS還原酶免疫測定法測定APS還原酶密度時，于405nm下目測讀數(shù)。需要指出，在細胞濃度0.5×104SRB細胞/ml或小于該密度時，試驗是不靈敏的。
實例4吸附劑類型對SRB細胞回收的影響如實例1取(100mg)不同類型的吸附劑材料裝入樣品回收裝置內(nèi)，按上述實例操作，將含有約5×108SRB/ml的培養(yǎng)液(2.0ml)加入到每個樣品的回收裝置中。然后在吸附劑材料上回收SRB，原始樣品中SRB數(shù)和濾液中的SRB數(shù)，使用相襯顯微鏡由Petroff-Hauser計數(shù)器來直接測定細胞讀數(shù)，SRB是被吸附劑保持在上述濾液中并從中汽提出來。測試的物質(zhì)如表4所示。所有測試的物質(zhì)細胞回收率大于65%，這些物質(zhì)均適宜于本發(fā)明。采用不同類型的吸附劑材料可獲得足夠的細胞回收率。各種類型的DE，珍珠巖，粘土，其顆粒尺寸至少有一半在2～10微米之間，用于本發(fā)明可獲得足夠的微生物回收率(至少60%)。
表4吸附劑類型對SRB回收率的影響材料名稱材料性質(zhì)SRB回收率%顆粒尺寸Celite4\41硅藻土 88Kenite4\4 2002硅藻土 90 2～20Kenite4\4 7002硅藻土 42 6～40Kenite4\4 30002硅藻土 00 10→40Celatom4\4FW63硅藻土 61 平均6Celatom4\4FW603硅藻土 00 平均19Celatom4\4FW403硅藻土 39Cuno4\4M-9014硅藻土 66Cuno4\4m8024硅藻土 96Perflo4\4 2005珍珠巖 75Perflo4\4 635珍珠巖 83Perflo4\4 305珍珠巖 81Alite4\4 1506Na沸石/粘土 86Alite4\4 1806H沸石/粘土 71
1詳見Johns Manville Corporation的“Tech Information Bulltin”2詳見Witco Chemical Company的“Toch Information Bulletin”3詳見Eagle Pitcher Company的“Tech Information Bulletin”4詳見“Tech Information Bulletin”5詳見“Tech Information Bulletin”6詳見“Tech Information Bulletin”
權(quán)利要求
1.一種從含有各種雜質(zhì)的難分離的流體樣品中分離和檢測微生物的方法，包括如下步驟a.將一種流體樣品同一種可吸附或捕捉微生物細胞的吸附劑顆粒混合；b.攪拌上述混合物，使上述流體中的吸附劑顆粒，微生物和其它固體雜質(zhì)呈基本均勻的懸浮液c.將上述懸浮液通過一過濾器，該過濾器基本上能將含有捕捉或吸附了微生物的吸附劑顆粒保持為濾餅；d.可選擇地清洗基本上含全部溶解的雜質(zhì)的濾餅；e.在純凈的液體中重新懸浮所說的含有微生物的吸附顆粒，上述純凈液體對所說的微生物是不活潑的，這使所說的吸附劑顆粒與所說的微生物分離；f.使所說的吸附劑顆粒沉淀，釋放出所說的微生物進入上層清液。
2.一種從含有各種雜質(zhì)的難分離的流體樣品中分離和檢測微生物的方法，包括如下步驟a.將一種流體樣品同一種可吸附或捕捉微生物細胞的吸附劑顆?；旌?b.攪拌上述混合物，使上述流體中的吸附劑顆粒，微生物和其它固體雜質(zhì)呈基本均勻的懸浮液;c.將上述懸浮液通過一過濾器，該過濾器基本上能將含有捕捉或吸附了微生物的吸附劑顆粒保持為濾餅;d.可選擇地清洗基本上含全部溶解雜質(zhì)的濾餅;e.在純凈的液體中重新懸浮所說的含有微生物的吸附劑顆粒，上述純凈液體對所說的微生物是不活潑的;f.使微生物細胞破裂釋放出可檢測的細胞組分;g.檢測所說的組分，以測量所說的微生物。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其特征是所說的吸附劑顆粒選自硅藻土顆粒，珍珠巖顆粒，沸石粘土顆粒，大部分顆粒徑為2～10微米。
4.按照權(quán)利要求2的方法，其特征是步驟“f”中通過聲處理“破裂”細胞，用免疫測定法檢測微生物。
5.按照權(quán)利要求2的方法，其特征是通過一多孔的塞子過濾步驟“c”的懸浮液，孔的尺寸約為20微米。
6.按照權(quán)利要求3的方法，其特征是流體為油井樣品，所說的微生物為硫酸鹽還原的細菌。
7.一種從含有雜質(zhì)的難分離的流體中分離微生物的裝置，該裝置包括一面開孔的樣品容器和收集帽兩個部分;收集帽為一空心的管狀體，在帽的一端開一小孔，另一端開一大孔，在開孔之間的區(qū)域適于夾持一堵塞物或過濾材料，大口孔適于氣密性地與所說的樣品容器的開孔端相連接。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從難分離的環(huán)境樣品(如油井樣品及類似樣品)中，收集、濃縮、檢測微生物的方法，該方法用于微生物的分析和鑒定；還涉及實施上方法的裝置。
文檔編號C12PGK1037926SQ89103369
公開日1989年12月13日 申請日期1989年5月22日 優(yōu)先權(quán)日1988年5月23日
發(fā)明者里查德·卡爾文·埃伯索爾, 弗蘭克·托馬斯·蓋洛明尼, 羅伯特·埃米特·塔特諾爾 申請人:納幕爾杜邦公司