專利名稱：用于預(yù)防類固醇性骨壞死的得自淫羊藿的類黃酮餾分的新型組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及巫山淫羊藿(五/7^W/Mm wws/wwe we)提取物、包含巫山淫羊 藿提取物的藥物組合物、制備含有巫山淫羊藿提取物的藥物組合物的方法 及它們的應(yīng)用，具體用于抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積，更具體地，用于預(yù)防 或治療類固醇性骨壞死。
背景技術(shù)：
類固醇常用于治療各種醫(yī)學(xué)病狀。脈沖式類固醇常常被指定為用于諸 如嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)等嚴(yán)重傳染 病，或諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)等慢性自身免疫性 疾病的救生藥劑(l-4)。
不可避免地，常常報(bào)道有類固醇性骨壞死(5-9)，其在救治嚴(yán)重急性呼 吸綜合征(SARS)患者后近來(lái)已被強(qiáng)調(diào)(10-12)。全關(guān)節(jié)置換是治療骨壞死的 最后選擇，然而經(jīng)類固醇治療的骨壞死患者的術(shù)后預(yù)后較差(7， 13-14)。因 此，極為理想的是在形成骨壞死損害之前預(yù)防類固醇性骨壞死的發(fā)展(8)。
對(duì)于類固醇性骨壞死達(dá)成共識(shí)的發(fā)病機(jī)理近來(lái)已經(jīng)統(tǒng)一至血管內(nèi)血栓 形成誘發(fā)的阻塞和血管外脂質(zhì)沉積誘發(fā)的壓迫，從而導(dǎo)致骨內(nèi)血供系統(tǒng)的 結(jié)構(gòu)功能受損(8、 9、 13、 15)。對(duì)于血管內(nèi)血栓形成，易于同時(shí)造成高凝血 和低纖溶的凝血與纖溶間的失衡通常表現(xiàn)為血管內(nèi)事件(16-18)。對(duì)于血管 外脂質(zhì)沉積，脂質(zhì)向外周組織的反常運(yùn)輸(9)和過(guò)量的PPARY2介導(dǎo)的脂肪 生成(20)涉及血管外事件。
2003年在中國(guó)的爆發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)為研究類固醇性 骨壞死提供了獨(dú)特的循證醫(yī)學(xué)。SARS康復(fù)者的骨壞死的流行在華北
1032.7°/。(14)和華南5% 6°/。(10、 ll)之間存在顯著差異。令人感興趣的是，脈、 沖式類固醇治療后在SARS患者康復(fù)過(guò)程的草藥制劑在華南(具有世界衛(wèi)生 組織(WHO)推薦的方案的傳統(tǒng)中藥干預(yù))的使用頻率比在華北(WHO推薦的 方案，未以傳統(tǒng)中藥干預(yù))高得多(3、 20-22)。華南較低的骨壞死流行程度表 明與其對(duì)預(yù)防類固醇性骨壞死的潛在效果有關(guān)。具有免疫調(diào)節(jié)作用的抗病 毒草藥淫羊藿是所述藥草之一(21)，其一直也被用作傳統(tǒng)中藥中的廣譜"壯 骨"藥草以治療許多肌骨疾病(23)。
由于抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積可以有助于預(yù)防類固醇性骨壞死，因此 對(duì)抑制機(jī)制的理解至關(guān)重要。另一方面，需要開發(fā)同時(shí)靶向血栓形成和脂 質(zhì)沉積的強(qiáng)效且特異性的化學(xué)抑制劑用于預(yù)防或治療類固醇性骨壞死。此 外，需要開發(fā)能夠同時(shí)抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積并且易于在常規(guī)和工業(yè)化 學(xué)合成的應(yīng)用中制備和操作的藥物組合物。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的化合物可同時(shí)抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積從而預(yù)防 或治療類固醇性骨壞死。
因此，本發(fā)明提供了用于抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積的一種包含巫山淫 羊藿提取物的新型藥物組合物。
因此，本發(fā)明包括一種藥物組合物，其中提取物是式(I)的異戊烯基黃 酮苷化合物的組合-
<formula>formula see original document page 11</formula>!^選自由葡萄糖、鼠李糖、、木糖及其組合組成的組； R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；和 R3是氫或Q.6的烷基。
同樣包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的是含有巫山淫羊藿的提取物的藥物組 合物，其中，所述提取物選自由淫羊藿屬苷A(Epimedoside A)、溫哥華苷 F(HexandrasideF)、朝藿定A(Epimedin A)、朝藿定B(EpimedinB)、朝藿定 C(Epimedin C)、淫羊藿苷(Icariin )、寶藿苷-I(Baohuoside-I)及其組合組成的組。
本發(fā)明還包括進(jìn)一步含有一種或更多種藥用載體或賦形劑的藥物組合 物。進(jìn)而，本發(fā)明包括被配制成劑型不同的各種制劑的藥物組合物。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包括對(duì)有所需要的受試對(duì)象施用含有 巫山淫羊藿的提取物的藥物組合物的抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積的方法。具 體而言，所述血栓形成是血管內(nèi)血栓形成，所述脂質(zhì)沉積是血管外脂質(zhì)沉 積。
在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了預(yù)防或治療類固醇性骨壞死的方法， 所述方法包括對(duì)有所需要的受試對(duì)象施用含有巫山淫羊藿的提取物的藥物 組合物。
在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了含有巫山淫羊藿提取物的藥物組合物 在用于抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積的藥物的制備中的應(yīng)用。具體而言，所述 血栓形成是血管內(nèi)血栓形成，所述脂質(zhì)沉積是血管外脂質(zhì)沉積。
在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了含有巫山淫羊藿提取物的藥物組合物 在用于預(yù)防或治療類固醇性骨壞死的藥物的制備中的應(yīng)用。
此外，在本發(fā)明的其他方面，提供了制備藥物組合物的方法，其中所
述方法包括以下步驟
(a) 用溶劑提取植物巫山淫羊藿或其一部分以獲得提取物；和
(b) 純化所述提取物以獲得式(I)的異戊烯基黃酮苷化合物
12其中
R,選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組； R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；禾口
R3是氫或CL6的烷基。
此外，在本發(fā)明的這一方面中，式I的異戊烯基黃酮苷化合物選自由 淫羊藿屬苷A、溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、
寶藿苷-I及其組合組成的組。
通過(guò)使用上述方法，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是小規(guī)模批量還是大規(guī)模批量， 均可以穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)從巫山淫羊藿提取類黃酮餾分，并且具有可重復(fù)的結(jié)果。 本發(fā)明的另一個(gè)有利之處在于小規(guī)模批量提取和大規(guī)模批量提取均可實(shí)現(xiàn) 高產(chǎn)率。然后可對(duì)提取物進(jìn)行純化以使本發(fā)明的藥物組合物具有較高的類 黃酮含量。
出于概括本發(fā)明及相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)取得的有利之處的目的，以上已經(jīng) 描述了本發(fā)明的一些目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解的是，并非所有上述目 標(biāo)或優(yōu)點(diǎn)均可根據(jù)本發(fā)明的任何具體實(shí)施方式
來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，例如，本領(lǐng)
域的技術(shù)人員將承認(rèn)可以以這樣的方式來(lái)實(shí)施或進(jìn)行本發(fā)明即實(shí)現(xiàn)或優(yōu) 化本文所教導(dǎo)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)或一組優(yōu)點(diǎn)，而不必實(shí)現(xiàn)本文可教導(dǎo)或提出的其 他目標(biāo)或優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將由下列詳細(xì)描述而變得更加清楚。然而， 應(yīng)當(dāng)理解表明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述和具體實(shí)施例僅僅是以闡 釋的方式給出，這種詳細(xì)描述將使本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)的各種變化和改 進(jìn)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將變得更加清楚。
13附配說(shuō)明
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。


圖1A顯示了式(I)的化合物的結(jié)構(gòu)通式。圖IB顯示了類黃酮中7種主 要化合物的化學(xué)信息。共同結(jié)構(gòu)是8-異戊二烯基山奈酚。R和R2由葡萄糖、
鼠李糖或木糖取代，R3由甲基置換。
圖2顯示了得自淫羊藿的類黃酮(EF)的2-DHPLC譜圖。 圖3顯示了得自淫羊藿的類黃酮(EF)的3-DHPLC譜圖。 圖4顯示了不同提取規(guī)模的得自淫羊藿的類黃酮的HPLC指紋的高度 相似性。上部的線是小規(guī)模批量，下部的線是大規(guī)模批量。使用三種流動(dòng) 相(A)水，(B)甲醇，(C)乙腈。流出曲線為0分鐘 25分鐘，A:B:C(65:12:23)， 25分鐘 30分鐘，線性梯度達(dá)A:B:C(40:35:25)， 30分鐘 60分鐘，線性 梯度達(dá)A:B:C(35:40:25)， 61分鐘 65分鐘，線性梯度達(dá)A:B:C(20:55:25); 流速l.OmL/分鐘；波長(zhǎng)270nm;爐溫30°C。
圖5顯示了小規(guī)模批量制劑與大規(guī)模批量制劑之間的相似性。 圖6顯示了組織病理學(xué)鑒定過(guò)程中的主要特征。圖6A顯示了作為包含 相當(dāng)多的空腔隙的骨小梁而被發(fā)現(xiàn)的骨壞死(ON)損害。圖6B顯示了在ON" 兔中，血栓癥主要發(fā)現(xiàn)于ON"兔的小骨髓管中，且骨髓主要由大量的脂肪 細(xì)胞占據(jù)。蘇木精-伊紅染色，x200。
圖7顯示了組織病理學(xué)數(shù)據(jù)分析。圖7A顯示了各組中的ON發(fā)生率 CON(13/14， 93%)， L-EF(9/16， 56%)， M-EF(2/16， 13%)， H-EF(1/16， 6%)。 圖7B顯示了在所有組中ON程度沒(méi)有顯著差異。圖7C和圖7D顯示了在 血栓形成性血管計(jì)數(shù)和脂肪細(xì)胞面積分率中，均存在相似的隨時(shí)間的變化 模式，即，與CON組相比L-EF組中被減弱或M-EF和H-EF兩組中均被阻 止。參表示CON組；令表示L-EF組；隱表示M-EF組；A表示H-EF組；* 表示P0.05。
圖8顯示了血液學(xué)/細(xì)胞學(xué)數(shù)據(jù)分析。誘導(dǎo)后第1周在CON組中APTT 由基線的顯著減少(圖8B)和t-PA/PAI-I(圖8C)在L-EF組中被削弱，或在
14M-EF和H-EF兩組中被阻止，而誘導(dǎo)后CON組中顯著增多的TM(圖8A)、 LDL/HDL(圖8C)和脂肪細(xì)胞陽(yáng)性集落(圖8D)在L-EF組中被削弱，或在 M-EF和H-EF兩組中被阻止。PO.05用于與CON比較；# PO.05用于與基 線比較。魯表示CON組；令表示L-EF組；園表示M-EF組；A表示H-EF組。
圖9顯示了縱向研究過(guò)程中的動(dòng)態(tài)MRI數(shù)據(jù)。圖9A中，誘導(dǎo)后第1 周，PEP在CON組中的明顯減少在L-EF組中被削弱，或在M-EF和H-EF 兩組中均被阻止。圖9B中，整個(gè)試驗(yàn)期間，CON組中明顯增多的PSp在 L-EF組中被削弱，或在M-EF和H-EF兩組中均幾乎被阻止。圖9C顯示了 誘導(dǎo)后第1周CON組與M-EF組之間的來(lái)自代表性的動(dòng)態(tài)MRI的時(shí)間-強(qiáng) 度曲線的比較Z表示P0.05。參表示CON組；令表示L-EF組；b表示M-EF 組；A表示H-EF組。黑色曲線表示M-EF組；灰色曲線表示CON組。
圖10顯示了由基于MicroCT的血管造影術(shù)獲得的代表性三維血管造影 照片和曲線圖。圖10A顯示了誘導(dǎo)前的基線和誘導(dǎo)后第2周的M-EF組或 H-EF組中的血管造影結(jié)構(gòu)單元的模式。圖10B顯示了誘導(dǎo)后第1周CON 組中的血管造影結(jié)構(gòu)單元的模式。圖10C顯示了誘導(dǎo)后第2周CON組中的 血管造影結(jié)構(gòu)單元的模式。圖10D顯示了在CON組中，40(Hmi 600|im或 36^im 200|im的血管造影結(jié)構(gòu)單元在誘導(dǎo)后第1周少于基線，而200pm 400nm的血管造影結(jié)構(gòu)單元在誘導(dǎo)后第1周多于基線。圖10E顯示了在誘 導(dǎo)后第1周時(shí)L-EF組中36)im 200pm或400(im 60(Vm的血管造影結(jié)構(gòu) 單元稍稍少于基線。圖10F顯示了在誘導(dǎo)前的基線和誘導(dǎo)后第1周的M-EF 組或H-EF組之間不存在血管造影結(jié)構(gòu)單元的模式的差異。圖10G顯示了 在誘導(dǎo)后第2周CON組中400pm 600nm的血管造影結(jié)構(gòu)單元少于基線， 而在誘導(dǎo)后第2周CON組中36pm 20(^m的血管造影結(jié)構(gòu)單元多于基線。 圖10H顯示了在誘導(dǎo)后第2周時(shí)L-EF組中400pm 60(Vm的血管造影結(jié) 構(gòu)單元稍稍低于基線，而36)Lrni 200,的血管造影結(jié)構(gòu)單元?jiǎng)t稍稍高于基 線。圖101顯示了在基線和誘導(dǎo)后第2周的M-EF組或H-EF組之間不存在 血管造影結(jié)構(gòu)單元的模式的差異。紅色圓圈表示誘導(dǎo)后第1周的CON組。藍(lán)色正方形表示誘導(dǎo)前的基線。褐色菱形表示L-EF組。綠色菱形表示M-EF 組或H-EF組。
圖11顯示了在用于基于MicroCT的血管造影術(shù)的灌注過(guò)程中存在血管 外滲漏顆粒。圖11A和11B顯示出在誘導(dǎo)后第2周時(shí)CON組中的代表性 的顆粒(由箭頭表示)在血管外分布的組織學(xué)圖像，而在誘導(dǎo)后第2周時(shí) M-EF組中顆粒在血管內(nèi)分布。圖11C和11D顯示血管外滲漏顆粒主要為 200^m 400(im的代表性的曲線圖。從誘導(dǎo)后第1周起發(fā)現(xiàn)，CON組中的 血管外滲漏顆粒更多，而誘導(dǎo)后這些顆粒極少見于M-EF組和H-EF組中， 而有少量見于在L-EF組中。參表示CON組；令表示L-EF組；b表示M-EF 組；A表示H-EF組。
具體實(shí)施例方式
己經(jīng)首次證明包含巫山淫羊藿提取物的藥物組合物可用于抑制血栓形 成和脂質(zhì)沉積，并且這些組合物可預(yù)防或治療類固醇性骨壞死。
盡管不希望受限于理論，不過(guò)這些效果極有可能是由靶向由類固醇引 發(fā)的骨壞死的兩種途徑的獨(dú)特機(jī)制所得到。也就是說(shuō)，通過(guò)抑制血管內(nèi)血 栓形成和血管外脂質(zhì)沉積而獲得這些效果。
因此，本發(fā)明的藥物組合物代表了可通過(guò)兩種途徑發(fā)揮作用的一類新 的藥物。本發(fā)明的藥物組合物可同時(shí)靶向血管內(nèi)血栓形成和血管外脂質(zhì)沉 積。其次，本發(fā)明的藥物組合物可用于預(yù)防或治療類固醇性骨壞死。
因此，在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明包括其中的提取物是式(I)的異戊烯 基黃酮苷化合物的組合的藥物組合物
<formula>formula see original document page 16</formula>其中
A選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組； R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；和 R3是氫或CL6的垸基。
式(I)的化合物包括其中！^選自由鼠李糖、葡萄糖-鼠李糖、木糖-鼠李 糖和鼠李糖-鼠李糖組成的組的那些化合物。式(I)的化合物包括其中R2是葡 萄糖或氫的那些化合物。式(I)的化合物包括其中R3是氫或d-3的烷基的那 些化合物。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，R3是甲基。
更具體而言，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述化合物選自由淫羊藿屬苷
A、溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷-I及 其組合組成的組。
此處使用的術(shù)語(yǔ)"C,.n的烷基"是指包含1個(gè) n個(gè)碳原子的直鏈和/或支 鏈的飽和烷基，其包括(取決于n的數(shù)值)甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁 基、仲丁基、異丁基、叔丁基、2,2-二甲基丁基、正戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基和正己基等。
在本發(fā)明的藥物組合物的實(shí)施方式中，淫羊藿屬苷A以約0.5重量％ 3.5重量％的量存在，溫哥華苷F以約0.2重量°/。 2.5重量％的量存在，朝 藿定A以約0.5重量°/。 3.0重量°/。的量存在，朝藿定B以約0.5重量％ 3.5 重量％的量存在，朝藿定C以約2.0重量％ 6.0重量°/。的量存在，淫羊藿 苷以約70.0重量％ 約95.0重量％的量存在，寶藿苷-I以約0.5重量％ 約 4.0重量％的量存在。
在本發(fā)明的藥物組合物的更具體的實(shí)施方式中，淫羊藿屬苷A以約1.3 重量％ 2.3重量％的量存在，溫哥華苷F以約0.5重量％ 1.5重量％的量 存在，朝藿定A以約0.7重量°/。 1.7重量％的量存在，朝藿定B以約1.0 重量％ 2.0重量％的量存在，朝藿定C以約3.2重量％ 5.2重量％的量存 在，淫羊藿苷以約75.0重量％ 約85.0重量％的量存在，寶藿苷-I以約1.5 重量％ 約2.5重量％的量存在。本發(fā)明的藥物組合物可以以適宜體內(nèi)施用的生物相容形式配制以施用 于人類對(duì)象。因此，在另一方面，本發(fā)明包括進(jìn)一步包含一種或更多種藥 用載體或賦形劑的本發(fā)明的藥物組合物。
可以將本發(fā)明的藥物組合物施用于受試對(duì)象，以使有效量的活性物質(zhì)
與藥用載質(zhì)結(jié)合成為混合物。適宜的載質(zhì)例如在Remington's Pharmaceutical Sciences (2003-20th edition)禾卩1999年出版的The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF 19)中有所描述。在此基礎(chǔ)上，所述組合 物包括，但并不絕對(duì)，結(jié)合一種或更多種藥用載質(zhì)或稀釋劑的所述物質(zhì)的 溶液，并且包含在具有適宜的pH和與生理溶液等滲的緩沖溶液中。
術(shù)語(yǔ)"藥用"指的是與動(dòng)物、尤其是人的治療相容。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述的藥物組合物可依據(jù)選擇的施用途徑以 各種形式施用于患者，正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的。本發(fā)明的組合物 可以例如通過(guò)口服、胃腸外、含服、舌下、鼻、直腸、貼劑、泵或透皮(局 部)施用而給藥。胃腸外施用包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、透上皮、 鼻、肺內(nèi)、鞘內(nèi)、直腸和局部等施用模式。胃腸外施用可通過(guò)在選擇的一 段時(shí)間內(nèi)而連續(xù)輸注。
可以通過(guò)下述方式來(lái)口服施用本發(fā)明的藥物組合物例如，與惰性稀 釋劑或能被吸收的可食用載體結(jié)合，或者可以包封在硬殼或軟殼明膠膠囊 中，或者壓制成片劑，或者直接與日常食品結(jié)合。對(duì)于治療性口服施用， 本發(fā)明的組合物可以與賦形劑結(jié)合，并以可攝取的片劑、含片劑、錠劑 (troche)、膠囊劑、酏齊j、懸浮劑、糖漿劑和薄片劑等形式使用。
本發(fā)明的組合物還可以胃腸外施用。本發(fā)明的組合物的溶液可以在水 中適當(dāng)?shù)嘏c諸如羥丙基纖維素等表面活性劑混合來(lái)制備。分散液也可以在 丙三醇、液態(tài)聚乙二醇、DMSO以及這些物質(zhì)的混合物(含有或不含有醇) 中，以及油中制備。在普通的存儲(chǔ)和使用條件下，這些制劑含有抑制微生 物生長(zhǎng)的防腐劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何制備合適的制劑。
適于注射使用的藥物形式包括無(wú)菌水溶液或分散液以及用于即時(shí)制備無(wú)菌注射液或分散液的無(wú)菌粉末。在所有的情況中，所述形式必須無(wú)菌， 并且流動(dòng)性必須達(dá)到具有易于注射性的程度。安瓿是方便的單位劑量。
用于鼻部給藥的組合物可方便地配制為氣霧劑、滴劑、凝膠劑和散劑。 氣霧劑制劑通常包括活性物質(zhì)在生理學(xué)可接受的水性或非水性溶劑中的溶 液或微細(xì)懸浮液，并通常以無(wú)菌形式的單劑量或多劑量的量存在于密封容
器中，所述容器可采用盒(cartridge)或內(nèi)膽(refill)的形式以用在霧化裝置上。 作為選擇，密封容器可以是單位式分配裝置，如單劑量鼻吸入器，或配有 用于使用后處理的計(jì)量闊的噴霧器。劑型包括噴霧器的情況中，其包含可 以是諸如壓縮空氣等壓縮氣體的推進(jìn)劑，或諸如氟氯烴等有機(jī)推進(jìn)劑。氣 霧劑劑型還可采用泵-噴霧器的形式。
適于含服給藥或舌下給藥的組合物包括片劑、含服錠劑(lozenge)和軟 錠劑，其中活性組分與載體如糖、阿拉伯膠、黃蓍膠或明膠和甘油配制。 用于直腸給藥的組合物可以方便地是包含可可油等常見栓劑基質(zhì)的栓劑的 形式。
用于局部給藥的組合物可包括例如丙二醇、異丙醇、礦物油和丙三醇。 適于局部給藥的制劑包括液體或半液體制劑，例如擦劑、洗劑、涂敷劑、 水包油或油包水乳液如乳劑、軟膏劑或糊劑；或者溶液或懸浮液如滴劑。 除了前述組分之外，局部用制劑可包含一種或更多種其他組分，如稀釋劑、 緩沖劑、芳香劑、粘合劑、表面活性劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑如羥基 苯甲酸甲酯(包括抗氧化劑)和乳化劑等。
可以配制緩釋的組合物或一次釋放的組合物，例如脂質(zhì)體，或者其中 活性化合物以具有差別的可降解包衣來(lái)保護(hù)，例如通過(guò)微囊化、多層包衣 等。還可以凍干本發(fā)明的化合物，并使用所得的例如用于制備注射用產(chǎn)品 的凍干物。
本發(fā)明的藥物組合物可單獨(dú)地或結(jié)合上述的其他藥用載體、和/或與其 他用于預(yù)防或治療類固醇性骨壞死的藥物活性劑結(jié)合施用給受試對(duì)象，其 比例由組合物的溶解度和化學(xué)性質(zhì)、所選擇的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐確定。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述藥物組合物被配制成劑型不同的各種制 劑。本發(fā)明的組合物的劑量可隨許多因素變化，例如組合物的藥效學(xué)性質(zhì)、 給藥模式、受者的年齡、健康狀態(tài)和體重、癥狀的性質(zhì)和程度、治療的步頁(yè) 率和同時(shí)治療(如果有的話)的類型，以及所述組合物在受治療動(dòng)物體內(nèi)的、清 除率。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可基于上述因素確定適宜的劑量。本發(fā)明的藥物 組合物最初以合適劑量施用，根據(jù)臨床反應(yīng)可按照需要調(diào)節(jié)所述劑量。對(duì) 于短期的細(xì)胞的離體治療，例如30分鐘至1小時(shí)或更長(zhǎng)，可使用的化合物 的劑量高于用于長(zhǎng)期體內(nèi)治療的劑量。
本發(fā)明的藥物組合物可單獨(dú)地使用，也可以結(jié)合其他藥劑或治療使用。 在本發(fā)明的更具體的實(shí)施方式中，所述藥物組合物可用于抑制血管內(nèi)血栓 形成。在本發(fā)明的另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述藥物組合物可用于抑 制血管外脂質(zhì)沉積。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物 可用于預(yù)防或治療類固醇性骨壞死。
進(jìn)而，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是含有巫山淫羊藿提取物的藥物組
合物，其中所述提取物選自由淫羊藿屬苷A、溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿 定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷-I及其組合組成的組，以用于抑制血栓 形成和脂質(zhì)沉積。具體的，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，淫羊藿屬苷A以約0.5 重量％ 3.5重量％的量存在，溫哥華苷F以約0.2重量％ 2.5%重量的量存 在，朝藿定A以約0.5重量％ 3.0重量°/。的量存在，朝藿定B以約0.5重 量°/。 3.5重量％的量存在，朝藿定C以約2.0重量％ 6.0重量％的量存在， 淫羊藿苷以約70.0重量％ 約95.0重量％的量存在，寶藿苷-I以約0.5重 量％ 約4.0重量°/。的量存在。
在本發(fā)明的更為具體的實(shí)施方式中，淫羊藿屬苷A以約1.3重量％ 2.3重量％的量存在，溫哥華苷F以約0.5重量％ 1.5重量％的量存在，朝 藿定A以約0.7重量％ 1.7重量。/。的量存在，朝藿定B以約1.0重量％ 2.0 重量％的量存在，朝藿定C以約3.2重量％ 5.2重量％的量存在，淫羊藿苷以約75.0重量％ 約85.0重量％的量存在，寶藿苷-1以約1.5重量％ 約 2.5重量％的量存在。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述藥物組合物可進(jìn)一步包含一種或更多種 藥用載體或賦形劑。
此外，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述組合物被配制成劑型不同的各種 制劑。
本發(fā)明的藥物組合物可用于抑制血管內(nèi)血栓形成。在本發(fā)明的其他實(shí) 施方式中，所述藥物組合物用于抑制血管外脂質(zhì)沉積。此外，在本發(fā)明的 實(shí)施方式中，所述藥物組合物可用于預(yù)防或治療類固醇性骨壞死。
本發(fā)明還包括抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積的方法，所述方法包括對(duì)有所 需要的受試對(duì)象施用有效量的本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明還包括本發(fā)明 的藥物組合物抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積的應(yīng)用以及本發(fā)明的藥物組合物在 用于抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積的藥物的制備中的應(yīng)用。
更具體的，抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積的方法包括對(duì)有所需要的受試對(duì)
象施用含有巫山淫羊藿的提取物的藥物組合物。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述方法用于抑制血管內(nèi)血栓形成。同樣也 在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，所述方法用于抑制血管外脂質(zhì)沉積。
應(yīng)該明確的是，在上述的方法中，所述提取物是式(I)的異戊烯基黃酮 苷化合物的組合<formula>formula see original document page 21</formula>
R,選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組; R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；和R3是氫或CL6的垸基。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述提取物選自由淫羊藿屬苷A、溫哥華苷F、
朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷-I及其組合組成的組。
在上述方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合物進(jìn)一步包含一種或 更多種藥用載體或賦形劑。進(jìn)而，在上述方法的實(shí)施方式中，所述藥物組 合物被配制成劑型不同的各種制劑。
同樣處于本發(fā)明范圍內(nèi)的是預(yù)防或治療類固醇性骨壞死的方法，所述 方法包括對(duì)有所需要的受試對(duì)象施用含有巫山淫羊藿的提取物的藥物組合 物。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述提取物是式(I)的異戊烯基黃酮苷化合物
的組合<formula>formula see original document page 22</formula>
其中
R,選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組； R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；禾口
R3是氫或Cw的垸基。
在本發(fā)明的更具體的實(shí)施方式中，所述提取物選自由淫羊藿屬苷A、 溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷-I及其組 合組成的組。
此外，在上述的本發(fā)明的方法的實(shí)施方式中，所述藥物組合物還包含 一種或更多種藥用載體或賦形劑。迸而，在上述的本發(fā)明的方法的實(shí)施方 式中，所述藥物組合物被配制成劑型不同的各種制劑。
將化合物施用給受試對(duì)象包括體內(nèi)、離體和體外治療。
此處使用的術(shù)語(yǔ)藥劑的"有效量"或"足夠量"是足以產(chǎn)生有益的或所需的結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的量，因而，"有效量"取決于其被應(yīng)用的背景。例如， 在施用預(yù)防或治療類固醇性骨壞死的藥劑的情況中，藥劑的有效量例如是 與不施用所述藥劑而獲得的響應(yīng)相比足以實(shí)現(xiàn)該治療的量。
正如此處使用的以及在本領(lǐng)域中所理解的，"治療"是用于獲得有益的 或所需的結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的方法。有益的或所需的臨床結(jié)果可以包括但 不限于緩解或改善一種或更多種癥狀或病狀，削弱疾病的程度，穩(wěn)定(即， 不惡化)疾病的狀態(tài)，防止疾病的傳播，延遲或減緩疾病的發(fā)展，改善或減 輕疾病的狀態(tài)，以及好轉(zhuǎn)(無(wú)論是部分或者全部)，無(wú)論是否可檢測(cè)到。"治 療"還可以表示與不接受治療的預(yù)計(jì)存活期相比延長(zhǎng)存活期。
此處使用的術(shù)語(yǔ)"受試對(duì)象"包括動(dòng)物界的全體成員，包括人類。所述 受試對(duì)象適宜為人類。
此外，本發(fā)明包括含有巫山淫羊藿提取物的藥物組合物在用于抑制血 栓形成和脂質(zhì)沉積的藥物的制備中的應(yīng)用。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述 藥物組合物在藥物制備中的應(yīng)用是用于抑制血管內(nèi)血栓形成。在本發(fā)明的 其他實(shí)施方式中，所述應(yīng)用是用于抑制血管外脂質(zhì)沉積。
特別是，在上述的應(yīng)用中，所述提取物是式(I)的異戊烯基黃酮苷化合 物的組合
R,選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組； R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；禾口
R3是氫或C,.6的垸基。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述提取物選自由淫羊藿屬苷A、溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、、寶藿苷-I及其組合組成的組。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，所述藥物組合物還包含一種或更多種藥 用載體或賦形劑。
在本發(fā)明的另一些實(shí)施方式中，所述藥物組合物被配制成劑型不同的 各種制劑。
同樣在本發(fā)明范圍內(nèi)的是含有巫山淫羊藿提取物的藥物組合物在預(yù)防 或治療類固醇性骨壞死的藥物的制備中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述提取物是式(I)的異戊烯基黃酮苷化
合物的組合
其中
R,選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組；
R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；禾口 R3是氫或CL6的烷基。
在本發(fā)明的更具體的實(shí)施方式中，所述提取物選自由淫羊藿屬苷A、 溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷-I及其組 合組成的組。
此外，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述藥物組合物可以進(jìn)一步包含一種 或更多種藥用載體或賦形劑。進(jìn)而，所述藥物組合物可被配制成劑型不同 的各種制劑。
本發(fā)明的藥物組合物可使用包括以下步驟的方法制備
(a) 用溶劑提取植物巫山淫羊藿或其一部分以獲得提取物；和
(b) 純化所述提取物以獲得式(I)的異戊烯基黃酮苷化合物其中
^選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組； R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；和 R3是氫或Cw的烷基。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述植物是巫山淫羊藿的葉。
在本發(fā)明的具體的實(shí)施方式中，步驟(a)中的所述溶劑是約40°/。 90% 的醇，適宜為約40°/。 80%的醇，更適宜為約60% 75°/。的醇。在本發(fā)明的 更具體的實(shí)施方式中，所述醇選自由甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇和己 醇組成的組。在本發(fā)明的進(jìn)而更具體的實(shí)施方式中，步驟(a)中的所述溶劑 是約60% 80%的乙醇，更適宜為約70%的乙醇。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，在上述方法中，在步驟(a)之后，使提取物懸 浮在水中以形成溶液。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，將所述溶液過(guò)濾以獲得濾 液。在本發(fā)明的更具體的實(shí)施方式中，所述濾液分配在水和醇之間以獲得 水溶部分和醇溶部分，其中所述提取物在醇溶部分中。進(jìn)而，在本發(fā)明的 實(shí)施方式中，所述醇選自由甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇和己醇組成的 組。具體而言，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述丁醇是正丁醇。
本發(fā)明的方法中的一個(gè)實(shí)施方式是通過(guò)選自由色譜法、重結(jié)晶、過(guò)濾 及其組合組成的組的純化技術(shù)來(lái)純化步驟(b)中的提取物。本發(fā)明的更具體 的實(shí)施方式是通過(guò)柱色譜來(lái)純化步驟(b)中的提取物，其中對(duì)所述提取物進(jìn) 行分餾以獲得多種餾分。
具體而言，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，提取物以氯仿-甲醇洗提。在本發(fā) 明的實(shí)施方式中，所述氯仿-甲醇的范圍是約9:1 6:4。進(jìn)而更具體的，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述氯仿-甲醇的范圍是約8:2 7:3。
在上述方法的其他實(shí)施方式中，對(duì)多種餾分分析式(I)的異戊烯基黃酮 苷化合物。具體而言，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，式(I)的異戊烯基黃酮苷化 合物選自由淫羊藿屬苷A、溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、 淫羊藿苷、寶藿苷-I及其組合組成的組。
下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了更詳細(xì)的描述，不過(guò)應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不 限于特定的實(shí)施例。
實(shí)施例 眾合激
由巫山淫羊藿提取七種異戊烯基黃酮苷，并鑒定為淫羊藿屬苷A(l)、 溫哥華苷F(2)、朝藿定A(3)、朝藿定B(4)、朝藿定C(5)、淫羊藿苷(6)和寶 藿苷-1(7)，如圖1所示。
在HPLC譜圖中，在270nm處，各化合物的曲線下面積(AUC)的百分 比分別為1.8°/0、 1.0%、 1.2%、 1.5%、 4.2%、 80.9%和2.1%。本發(fā)明的發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)，對(duì)得自巫山淫羊藿的類黃酮餾分的HPLC-UV-MS/MS譜圖的研究 可快速鑒定其中92.7%的成分(圖1 3)。
被鄉(xiāng)微射激微成 潛欽微
巫山淫羊藿的葉采自中國(guó)貴州省雷山(Lei Shan)，其是具有對(duì)于巫山淫 羊藿的良好農(nóng)業(yè)規(guī)范(GAP)認(rèn)證的種植地，并由沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院授 權(quán)。憑證標(biāo)本(EW 2006)保存在中國(guó)深圳的深圳中藥及天然藥物研究中心 (Shenzhen Research Center of Traditional Chinese Medicines and Nature Products)。
微
德漠微
用70。/。的乙醇對(duì)巫山淫羊藿的葉(2kg)進(jìn)行提取(20L，回流，2小時(shí)，2次)。減壓下除去乙醇以得到殘留物(21g)，將其懸浮在水中并攪拌。靜置約
12小時(shí)后，將溶液過(guò)濾，然后使濾液在水和正丁醇之間分配。正丁醇部分 (6.4g)通過(guò)真空蒸發(fā)濃縮，然后進(jìn)行硅膠柱色譜。用氯仿-甲醇體系洗滌柱。 對(duì)于得到的類黃酮提取物利用薄層色譜(TLC)來(lái)進(jìn)行分析。類黃酮提取物 (2.3g)隨后在8:2 CHCl3-MeOH和7:3 CHCl3-MeOH洗提液中濃縮。 力蕭微
用70。/。的乙醇對(duì)巫山淫羊藿的葉(50kg)進(jìn)行提取(500L，回流，2小時(shí)， 2次)。減壓下除去乙醇以得到殘留物(490g)，將其懸浮在水中并攪拌。靜置 約12小時(shí)后，將溶液過(guò)濾，然后使濾液在水和正丁醇之間分配。正丁醇部 分(168g)通過(guò)真空蒸發(fā)濃縮，然后進(jìn)行硅膠柱色譜。用氯仿-甲醇體系洗滌 柱。對(duì)于得到的類黃酮提取物利用薄層色譜(TLC)進(jìn)行分析。類黃酮提取物 (49g)隨后在8:2 CHCl3-MeOH和7:3 CHCl3-MeOH洗提液中濃縮。
德/,微默麟微微夢(mèng)
為獲得可重復(fù)的結(jié)果，植物資源由貴州的良好農(nóng)業(yè)規(guī)范(GAP)植物生境 保證。通過(guò)使用向量夾角法量化兩批(小規(guī)模制備和大規(guī)模制備)樣品之間的 相似性，從而證實(shí)由巫山淫羊藿制備類黃酮餾分的方法的穩(wěn)定性。小規(guī)模 批次和大規(guī)模批次之間的HPLC色譜圖的相似性依據(jù)保留時(shí)間為98.2%，依 據(jù)峰面積為99.9%(圖4，圖5)。
#辦減 動(dòng)欽微
在第0天(O周)對(duì)兔靜脈內(nèi)注射每kg體重為IO昭的脂多糖(LPS; ^&c/^r/c/^ co// 0111:B4， Sigma-Aldrich， Inc. USA)。 24小時(shí)后，以24小曰寸 的時(shí)間間隔進(jìn)行三次20mg/kg的甲潑尼龍(Methylprednisolone)(MPS; Pharmacia & Upjohn, USA)的肌內(nèi)注射。
體重為4kg 5kg的112只28周齡的雄性新西蘭白兔飼養(yǎng)在威爾士親王醫(yī)院(香港中文大學(xué)的附屬醫(yī)院)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物服務(wù)中心(Laboratary Animal Service Center)。用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室膳食和水隨意喂養(yǎng)這些動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)方案由香 港的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)(Animal Experiment Ethics Committee)批準(zhǔn)。對(duì)所 有的兔給予上述注射方案(動(dòng)物模型)以誘發(fā)類固醇性骨壞死，從而評(píng)價(jià)得自 淫羊藿的類黃酮(EF)的預(yù)防效果。將兔分成四組用于下列每日口服給藥低 齊(J量EF組(L-EF; n=28; 10mg/kg體重/天)，中等劑量EF組(M-EF; n=28; 20mg/kg體重/天)，高劑量EF組(H-EF; n=28; 40mg/kg體重/天)，一個(gè)對(duì) 照組每天給予EF的相應(yīng)載質(zhì)(CON; n=28)。
EF的植物化學(xué)概況由HPLC鑒定，其中EF的共同結(jié)構(gòu)是8-異戊二烯 基山奈酚。EF的二維HPLC譜圖顯示在圖2中，EF的三維HPLC譜圖顯 示在圖3中。在誘導(dǎo)后第O周(即將進(jìn)行LPS注射之前)、第1周和第2周， 采集血樣用于全面檢査凝固指數(shù)、纖溶指數(shù)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)指數(shù)。同時(shí)獲取來(lái) 自髂嵴的骨髓樣品用于間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂潛力指數(shù)(adipogenic potential index)的局部評(píng)價(jià)。在誘導(dǎo)后的第O周(即將進(jìn)行LPS注射之前)、第1周和 第2周，處死所述動(dòng)物之前對(duì)各動(dòng)物的股骨近端局部進(jìn)行動(dòng)態(tài)MRI以用于 骨內(nèi)灌注功能指數(shù)。此外，在誘導(dǎo)后的第0周、第1周和第2周分別處死 各組中的4、 8和16只兔。使用過(guò)量的戊巴比妥鈉處死動(dòng)物后，解剖雙側(cè) 近端股骨以用于基于MicroCT的血管造影術(shù)、對(duì)局部ON損害的組織病理 學(xué)檢査、血管內(nèi)血栓形成和血管外脂質(zhì)沉積。存檔被殺死前的每只兔的體 重。記錄整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間各組中的存活情況。
絲敝微資會(huì)激微艘徑，舒淑虛飾*舒/#常微臠 * ,膽一織微學(xué)廁凝 游,伴
就組織病理學(xué)而言，血栓癥主要發(fā)現(xiàn)于誘導(dǎo)后第1周的CON組中的小 骨髓管中(圖6)。CON組中的血栓性血管計(jì)數(shù)在誘導(dǎo)后第1周增至峰值水平， 然后一直維持到誘導(dǎo)后第2周。血栓性血管計(jì)數(shù)隨時(shí)間改變的模式在CON組與蘭個(gè)EF組間有所不同。在整個(gè)試驗(yàn)階段，在CON組中增犬的血栓性血管計(jì)數(shù)在L-EF組中削弱，或者在M-EF和H-EF組中被抑制(被阻止)。Fisher的確切概率檢驗(yàn)顯示，在誘導(dǎo)后第1周血栓性血管計(jì)數(shù)的順序與誘導(dǎo)后第2周相似，即，CON〉L-EF〉M-EF-H隱EF(圖7)。
對(duì)于對(duì)血管內(nèi)血栓形成最初起作用的內(nèi)皮損傷事件，CON組中的TM在誘導(dǎo)后第1周呈現(xiàn)明顯增加(P-O.OOO)，然后朝向基線下降。TM隨時(shí)間變化的模式在CON組與三個(gè)EF組間顯著不同(對(duì)于L-EF對(duì)CON為P<0.05，對(duì)于M-EF對(duì)CON和H-EF對(duì)CON均為P<0.01)。尤其是，CON組中明顯增大的TM在誘導(dǎo)后第1周時(shí)在L-EF組中減弱，或者在M-EF和H-EF組中幾乎被抑制(圖8A)。
對(duì)于對(duì)血管內(nèi)血栓形成起作用的高凝血事件，CON組中的APTT在誘導(dǎo)后第1周顯著減少(PO.Ol)，然后朝向基線下降。根據(jù)重復(fù)測(cè)量的方差分析，APTT隨時(shí)間變化的模式在CON組與三個(gè)EF組間明顯不同(對(duì)于L-EF對(duì)CON為P<0.05，對(duì)于M-EF對(duì)CON和H-EF對(duì)CON均為PO.Ol)。尤其是，CON組中的APTT的明顯減少在誘導(dǎo)后第1周的L-EF組中減弱，或者在M-EF和H-EF組中幾乎被抑制(圖犯)。
對(duì)于對(duì)血管內(nèi)血栓形成起作用的低纖溶事件，CON組中的tPA/PAI-I在誘導(dǎo)后第1周呈現(xiàn)明顯減少(PO.Ol)，然后向基線返回。tPA/PAI-I隨時(shí)間變化的模式在CON組與三個(gè)EF組間明顯不同(對(duì)于L-EF對(duì)CON為P<0.05，對(duì)于M-EF對(duì)CON和H-EF對(duì)CON均為PO.Ol)。尤其是，CON組中tPA/PAI-I的明顯減少在誘導(dǎo)后第1周時(shí)在L-EF組中減弱，或者在M-EF和H-EF組中幾乎被抑制(圖8C)。
* ,微辦群淑赫/爐條伴
就組織病理學(xué)而言，誘導(dǎo)后CON組中骨髓主要由大量的脂肪細(xì)胞占據(jù)(圖6)。誘導(dǎo)后第1周CON組中的脂肪細(xì)胞面積分率明顯增大，然后一直維持到誘導(dǎo)后第2周(二者均為P<0.05)。脂肪細(xì)胞面積分率隨時(shí)間改變的模式在CON組與三個(gè)EF組間不同。在整個(gè)試驗(yàn)階段，CON組中明顯增大的脂肪細(xì)胞面積分率在L-EF組中削弱，或者在M-EF和H-EF組中被抑制。Fisher的確切概率檢驗(yàn)顯示，誘導(dǎo)后第1周時(shí)脂肪細(xì)胞面積分率的順序與誘導(dǎo)后第2周類似，g卩，CON〉L-EF〉M-EF二H-EF(圖7)。
對(duì)于對(duì)血管外脂質(zhì)沉積起作用的脂肪生成事件，CON組中的脂肪細(xì)胞陽(yáng)性集落在誘導(dǎo)后第l周明顯增加(PO.Ol)，隨后朝向基線適度恢復(fù)。脂肪細(xì)胞陽(yáng)性集落隨時(shí)間變化的模式在CON組與三個(gè)EF組間明顯不同(對(duì)于L-EF對(duì)CON為P<0.05，對(duì)于M-EF對(duì)CON和H-EF對(duì)CON均為PO.Ol)。尤其是，CON組中明顯增加的脂肪細(xì)胞陽(yáng)性群體在誘導(dǎo)后第1周時(shí)在L-EF組中減弱，或者在M-EF和H-EF組中幾乎被抑制(圖8D)。
對(duì)于對(duì)血管外脂質(zhì)沉積起作用的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)事件，CON組中的LDL/HDL在誘導(dǎo)后第1周明顯增大(PO.Ol)，然后返回基線。LDL/HDL隨時(shí)間變化的模式在CON組與三個(gè)EF組間明顯不同(L-EF對(duì)CON、 M-EF對(duì)CON和H-EF對(duì)CON分別為P〈0.05)。尤其是，CON組中明顯增大的LDL/HDL在誘導(dǎo)后第1周的L-EF組中減弱，或者在M-EF和H-EF組中幾乎被抑制(圖8E)。
微錢
整個(gè)試驗(yàn)期間各組中均未發(fā)現(xiàn)出血或死亡。各組中誘導(dǎo)后第2周才發(fā)現(xiàn)骨壞死損害。骨壞死損害以包含相當(dāng)多的空腔隙的骨小梁為組織病理學(xué)特征(圖6)。骨壞死的發(fā)生率分別為在CON組中為93Q/。(15/16)，在L-EF組中為56%(9/16)，在M-EF組中為13%(2/16),在H-EF組中為6%( 1/16)。Fisher的確切概率檢驗(yàn)顯示，L-EF、M-EF和H-EF組的骨壞死發(fā)生率明顯低于CON組的發(fā)生率(分別為P-0.039, P=0.000和P=0.000)。 M-EF和H-EF組的骨壞死發(fā)生率明顯低于L-EF組的骨壞死發(fā)生率(二者為P=0.023, P=0.005)，而M-EF和H-EF組間未發(fā)現(xiàn)骨壞死發(fā)生率的差異(二者均為P4.000)(圖7A)。在CON組(2.8士0.8)、L-EF組(2.5士0.6)、 M-EF組(2.4士0.7)和H-EF組(2.6士0.5)之間不存在骨壞死程度的明顯差異(圖7B)。秀潘學(xué),薪
對(duì)f淑,/M飾辦辦縦辦教群遂徑條喊趁毅縦
對(duì)于基于動(dòng)態(tài)MRI的血管指數(shù)，CON組中的PEP在誘導(dǎo)后第1周明顯下降( <0.01)，然后在誘導(dǎo)后第2周時(shí)明顯增大超過(guò)基線(PO.Ol)。 PEP隨時(shí)間變化的模式在CON組與三個(gè)EF組間明顯不同(對(duì)于L-EF對(duì)CON、M-EF對(duì)CON和H-EF對(duì)CON分別為P<0.01)。尤其是，CON組中PEP的明顯減少在誘導(dǎo)后第1周時(shí)在L-EF組中減弱，或者在M-EF和H-EF組中幾乎被抑制(圖9A、 9C)。
對(duì)于基于動(dòng)態(tài)MRI的滲透指數(shù)，CON組中的PSp在誘導(dǎo)后第1周明顯增大(PO.Ol)，然后在誘導(dǎo)后第2周進(jìn)一步明顯增大(PO.Ol)。 PSp隨時(shí)間變化的模式在CON組與三個(gè)EF組間明顯不同(對(duì)于CON組對(duì)CON為P<0.05，對(duì)于M-EF對(duì)CON和H-EF對(duì)CON均為PO.Ol)。尤其是，在整個(gè)試驗(yàn)期間，CON組中明顯增大的PSp在L-EF組中削弱，或者在M-EF和H-EF組中幾乎被抑制(圖9B、 9C)。
圖10A 10C中顯示了代表性的三維血管造影照片，圖10D 10I顯示了代表性的曲線圖。
與基線情況相比時(shí)，誘導(dǎo)后第1周CON組中的血管造影照片顯示了同時(shí)由大量中等尺寸的散布的滲漏顆粒樣結(jié)構(gòu)單元(200(im 400^im)和少量血管樣結(jié)構(gòu)單元(36nm 20(Vm或400pm 600nm)所環(huán)繞的擴(kuò)張血管樣的結(jié)構(gòu)單元(〉60(HimX圖10D)。相對(duì)于誘導(dǎo)后第1周的CON組中的情況，在M-EF組和H-EF組中均未發(fā)現(xiàn)由大量中等尺寸的散布的滲漏顆粒樣結(jié)構(gòu)單元(200iam 40(Hmi)所圍繞的典型的擴(kuò)張血管樣的結(jié)構(gòu)單元，除了有少量在L-EF組中。在M-EF組和H-EF組中均極少發(fā)現(xiàn)對(duì)血管樣結(jié)構(gòu)單元(36pm 200|im或400pm 60(^m)的減少的灌注，但在L-EF組中適度發(fā)現(xiàn)(圖〗0E和IOF)。與基線情況相比時(shí)，誘導(dǎo)后第2周，CON組中的'血管造影照片展示了 同時(shí)由大量小尺寸的血管樣結(jié)構(gòu)單元(36^m 200^m)和大量中等尺寸的散 布的滲漏顆粒樣結(jié)構(gòu)單元(200^im 40(^m)所環(huán)繞的擴(kuò)張血管樣的結(jié)構(gòu)單元 (〉600^m)(圖IOG)。相對(duì)于誘導(dǎo)后第2周的CON組中的情況，在M-EF組 和H-EF組中均未發(fā)現(xiàn)由許多小尺寸的血管樣結(jié)構(gòu)單元(36pm 200nm)和大 量中等尺寸的散布的滲漏顆粒樣結(jié)構(gòu)單元(20(^m 400^im)所環(huán)繞的擴(kuò)張血 管樣的結(jié)構(gòu)單元，但在L-EF組中適度發(fā)現(xiàn)，在M-EF組和H-EF組中均極 少發(fā)現(xiàn)對(duì)血管樣結(jié)構(gòu)單元(400pm 60(Vm)的減少的灌注，但在L-EF組中 適度發(fā)現(xiàn)(圖IOH和101)。
虛舒/滲濕微游尉分恭微邀
在用于基于MicroCT的血管造影術(shù)的灌注過(guò)程中在誘導(dǎo)后的CON組 中發(fā)現(xiàn)了更多的血管外滲漏顆粒，而在誘導(dǎo)后的M-EF和H-EF組中都很少 發(fā)現(xiàn)，除了有少量在L-EF組中。所有的曲線圖均顯示滲漏顆粒的尺寸是 200^im 400iim(圖11A 11D)。
EF對(duì)抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積具有劑量依賴性影響，以維持兔模型的 骨內(nèi)血管的結(jié)構(gòu)-功能的完整性，并由此減少類固醇性O(shè)N的發(fā)生率。內(nèi)在 機(jī)制可通過(guò)其對(duì)高凝血、低纖溶、過(guò)度脂肪生成和突出的脂質(zhì)向外周組織 轉(zhuǎn)運(yùn)的對(duì)抗作用來(lái)解釋。
盡管本發(fā)明參考目前被視為優(yōu)選實(shí)施例的方案進(jìn)行描述，不過(guò)應(yīng)當(dāng)理 解本發(fā)明并不限于所公開的實(shí)施例。相反，本發(fā)明意圖涵蓋包括在所附權(quán) 利要求的實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)的各種修正和等同方式。
所有公報(bào)、專利和專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文，程度 與將各單獨(dú)的公報(bào)、專利或?qū)＠暾?qǐng)的全部?jī)?nèi)容具體地、個(gè)別地指出并以 引用的方式引入相同。本申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)的定義與通過(guò)引用方式并入本文的 文獻(xiàn)中不同的，以本文提供的定義作為所述術(shù)語(yǔ)的定義。本說(shuō)明書中所引用的全部參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含用于抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積的巫山淫羊藿的提取物。
2. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述提取物是式(I)的異戊烯基黃酮苷化合物的組合其中 Ri選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組； R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；禾口R3是氫或C,-6的垸基。
3. 如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中R,選自由鼠李糖、葡萄糖-鼠李糖、木糖-鼠李糖和鼠李糖-鼠李糖組成的組。
4. 如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中R2是葡萄糖或氫。
5. 如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中R3是氫或Q.3的垸基。
6. 如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中R3是甲基。
7. 如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述化合物選自 由淫羊藿屬苷A、溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、 寶藿苷-I及其組合組成的組。
8. 如權(quán)利要求7所述的藥物組合物,其中淫羊藿屬苷A以約0.5重量°/。
3.5重量％的量存在，溫哥華苷F以約0.2重量％ 2.5重量％的量存在，朝 藿定A以約0.5重量％ 3.0重量％的量存在，朝藿定B以約0.5重量％ 3.5 重量％的量存在，朝藿定C以約2.0重量％ 6.0重量°/。的量存在，淫羊藿苷以約70.0重量°/。 約95.0重量％的量存在，寶藿苷-I以約0.5重量％ 約 4.0重量％的量存在。
9. 如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中淫羊藿屬苷A以約1.3重量％ 2.3重量°/。的量存在，溫哥華苷F以約0.5重量o/。 1.5重量M的量存在，朝 藿定A以約0.7重量°/。 1.7重量y。的量存在，朝藿定B以約1.0重量％ 2.0 重量％的量存在，朝藿定C以約3.2重量％ 5.2重量％的量存在，淫羊藿 苷以約75.0重量°/。 約85.0重量°/。的量存在，寶藿苷-I以約1.5重量％ 約 2.5重量％的量存在。
10. 如權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述藥物組合物進(jìn) 一步包含一種或更多種藥用載體或賦形劑。
11. 如權(quán)利要求IO所述的藥物組合物，其中所述組合物被配制成劑型 不同的各種制劑。
12. 如權(quán)利要求1 11中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述組合物用于抑 制血管內(nèi)血栓形成。
13. 如權(quán)利要求1 11中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述組合物用于抑 制血管外脂質(zhì)沉積。
14. 如權(quán)利要求1 13中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述組合物用于預(yù) 防或治療類固醇性骨壞死。
15. —種包含巫山淫羊藿的提取物藥物組合物，其中所述提取物選自由 淫羊藿屬苷A、溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、 寶藿苷-I及其組合組成的組，用于抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積。
16. 如權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其中淫羊藿屬苷A以約0.5重 量％ 3.5重量％的量存在，溫哥華苷F以約0.2重量％ 2.5重量％的量存 在，朝藿定A以約0.5重量％ 3.0重量％的量存在，朝藿定B以約0.5重 量％ 3.5重量％的量存在，朝藿定C以約2.0重量％ 6.0重量％的量存在， 淫羊藿苷以約70.0重量％ 約95.0重量％的量存在，寶藿苷-I以約0.5重量％ 約4.0重量％的量存在。
17. 如權(quán)利要求16、所述的藥物組合物，其中淫羊藿屬苷A以約1.3重 量°/。 2.3重量％的量存在，溫哥華苷F以約0.5重量％ 1.5重量°/。的量存 在，朝藿定A以約0.7重量°/。 1.7重量°/。的量存在，朝藿定B以約1.0重 量°/。 2.0重量％的量存在，朝藿定C以約3.2重量°/。 5.2重量％的量存在， 淫羊藿苷以約75.0重量％ 約85.0重量％的量存在，寶藿苷-I以約1.5重量％ 約2.5重量°/。的量存在。
18. 如權(quán)利要求15 17中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述藥物組合物 進(jìn)一步包含一種或更多種藥用載體或賦形劑。
19. 如權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其中所述組合物被配制成劑型 不同的各種制劑。
20. 如權(quán)利要求15 19中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述組合物用于 抑制血管內(nèi)血栓形成。
21. 如權(quán)利要求15 19中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述組合物用于 抑制血管外脂質(zhì)沉積。
22. 如權(quán)利要求15 21中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，所述組合物用于 預(yù)防或治療類固醇性骨壞死。
23. —種抑制血栓形成和脂質(zhì)沉積的方法，所述方法包括對(duì)有所需要的 受試對(duì)象施用含有巫山淫羊藿的提取物的藥物組合物。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中血栓形成是血管內(nèi)血栓形成。
25. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中脂質(zhì)沉積是血管外脂質(zhì)沉積。
26. 如權(quán)利要求23 25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述提取物是式① 的異戊烯基黃酮苷化合物的組合- <formula>formula see original document page 4</formula>其中Rj選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組； R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；和 R3是氫或Cw的烷基。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述提取物選自由淫羊藿屬苷A、 溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷-I及其組 合組成的組。
28. 如權(quán)利要求23 27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述藥物組合物進(jìn) 一步包含一種或更多種藥用載體或賦形劑。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述藥物組合物被配制成劑型不 同的各種制劑。
30. —種預(yù)防或治療類固醇性骨壞死的方法，所述方法包括在對(duì)有所需 要的受試對(duì)象施用含有巫山淫羊藿的提取物的藥物組合物。
31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述提取物是式(I)的異戊烯基黃 酮苷化合物的組合其中R,選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組； R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；禾口 R3是氫或Q—6的烷基。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述提取物選自由淫羊藿屬苷A、 溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷-I及其組 合組成的組。
33. 如權(quán)利要求30 32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述藥物組合物進(jìn) 一步包含一種或更多種藥用載體或賦形劑。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述藥物組合物被配制成劑型不 同的各種制劑。
35. 含有巫山淫羊藿提取物的藥物組合物在用于抑制血栓形成和脂質(zhì) 沉積的藥物的制備中的應(yīng)用。
36. 如權(quán)利要求35所述的應(yīng)用，其中血栓形成是血管內(nèi)血栓形成。
37. 如權(quán)利要求35所述的應(yīng)用，其中脂質(zhì)沉積是血管外脂質(zhì)沉積。
38. 如權(quán)利要求35 37中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述提取物是式(I) 的異戊烯基黃酮苷化合物的組合其中R,選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組； R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；和R3是氫或C.6的烷基。
39. 如權(quán)利要求38所述的應(yīng)用，其中所述提取物選自由淫羊藿屬苷A、 溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷-I及其組 合組成的組。
40. 如權(quán)利要求35 39中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述藥物組合物進(jìn)一步包含一種或更多種藥用載體或賦形劑。
41. 如權(quán)利要求40所述的應(yīng)用，其中所述藥物組合物被配制成劑型不 同的各種制劑。
42. 具有巫山淫羊藿的提取物的藥物組合物用于制備預(yù)防或治療類固醇性骨壞死的藥物的應(yīng)用。
43.如權(quán)利要求42所述的應(yīng)用，其中所述提取物是式(I)的異戊烯基黃酮苷化合物的組合<formula>formula see original document page 7</formula>其中R,選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組； R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；和R3是氫或Q—6的垸基。
44. 如權(quán)利要求43所述的應(yīng)用，其中所述提取物選自由淫羊藿屬苷A、 溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷-I及其組 合組成的組。
45. 如權(quán)利要求42 44中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述藥物組合物進(jìn) 一步包含一種或更多種藥用載體或賦形劑。
46. 如權(quán)利要求45所述的應(yīng)用，其中所述藥物組合物被配制成劑型不 同的各種制劑。
47. —種制備藥物組合物的方法，所述方法包括以下步驟(a) 用溶劑提取植物巫山淫羊藿或其一部分以獲得提取物；和(b) 純化所述提取物以獲得式(I)的異戊烯基黃酮苷化合物其中Rj選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其組合組成的組； R2選自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氫組成的組；和 R3是氫或Cw的垸基。
48. 如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述植物是巫山淫羊藿的葉。
49. 如權(quán)利要求47或48所述的方法，其中步驟(a)中的所述溶劑是約 40% 卯％的醇。
50. 如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述醇選自由甲醇、乙醇、丙醇、 丁醇、戊醇和己醇組成的組。
51. 如權(quán)利要求49所述的方法，其中步驟(3)中的所述溶劑是約60% 80%的乙醇。
52. 如權(quán)利要求47 49中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(a)之后將所 述提取物懸浮在水中以形成溶液。
53. 如權(quán)利要求52所述的方法，其中將所述溶液過(guò)濾以獲得濾液。
54. 如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述濾液分配在水和醇之間以獲 得水溶部分和醇溶部分，并且其中所述提取物在所述醇溶部分中。
55. 如權(quán)利要求54所述的方法，其中所述醇選自由甲醇、乙醇、丙醇、 丁醇、戊醇和己醇組成的組。
56. 如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述丁醇是正丁醇。
57. 如權(quán)利要求47所述的方法，其中將步驟(b)中的所述提取物通過(guò)選 自由色譜法、重結(jié)晶、過(guò)濾及其組合組成的組的純化技術(shù)純化。
58. 如權(quán)利要求57所述的方法，其中將步驟(b)中的所述提取物通過(guò)柱 色譜法純化，其中對(duì)所述提取物進(jìn)行分餾從而獲得多種餾分。
59. 如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述提取物用氯仿-甲醇洗提。
60. 如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述氯仿-甲醇的范圍是約9:1 6:4。
61. 如權(quán)利要求60所述的方法，其中所述氯仿-甲醇的范圍是約8:2 7:3。
62. 如權(quán)利要求58所述的方法，其中對(duì)于所述多種餾分分析所述式(I) 的異戊烯基黃酮苷化合物。
63. 如權(quán)利要求62所述的方法，其中所述的式(I)的異戊烯基黃酮苷化 合物選自由淫羊藿屬苷A、溫哥華苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、 淫羊藿苷、寶藿苷-I及其組合組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含巫山淫羊藿提取物的新型藥物組合物、它們的制備方法以及它們?cè)谝种蒲ㄐ纬珊椭|(zhì)沉積中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的藥物組合物來(lái)預(yù)防或治療類固醇性骨壞死的方法。不論是小規(guī)模提取還是大規(guī)模提取，本發(fā)明的制備方法均穩(wěn)定，并且提供可重復(fù)的結(jié)果。
文檔編號(hào)A61K36/296GK101641112SQ200880002423
公開日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2008年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月23日
發(fā)明者姚新生, 戈 張, 王新巒, 王曉春, 輝 盛, 嶺 秦 申請(qǐng)人:同濟(jì)堂藥業(yè)