專利名稱：一種含有改組乙醇氧化酶啟動子的畢赤酵母植酸酶表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)，具體涉及含有改組乙醇氧化酶啟動子的畢赤酵母植酸酶表達(dá)系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
酵母作為一類外源基因的表達(dá)系統(tǒng)具有很多優(yōu)點，酵母屬于單細(xì)胞生物又具有真核生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因而即保留了細(xì)菌易于操作和生長快速的特點，又具有糖基化、脂肪?；⒌鞍踪|(zhì)磷酸化等翻譯后修飾功能。大部分重組蛋白的表達(dá)以釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)為宿主表達(dá)系統(tǒng)。然而釀酒酵母表達(dá)蛋白通常存在產(chǎn)量低，自我復(fù)制表達(dá)型載體在細(xì)胞傳代中不穩(wěn)定，外源蛋白過糖基化作用等局限性。
甲醇酵母是上世紀(jì)七十年代初期在研究利用甲醇為單一碳源和能量來源產(chǎn)生單細(xì)胞蛋白的過程中被發(fā)現(xiàn)的。甲醇酵母分為四類畢赤酵母屬(pichia)、漢遜酵母屬(hansenula)、念珠菌屬(candida)和球擬酵母屬(torulopsis)。其中以畢赤酵母屬(pichia.pastoris)的遺傳背景以及生理特征研究得較為透徹。甲醇酵母是一種甲基營養(yǎng)型酵母，在缺乏葡萄糖、甘油等抑制性碳源時，能利用甲醇作為唯一碳源。它含有乙醇氧化酶基因，其強(qiáng)的啟動子受到甲醇的嚴(yán)格調(diào)控，可以用來驅(qū)動外源蛋白的高效表達(dá)。
近年來，甲醇酵母系統(tǒng)由于其在蛋白表達(dá)方面所具有的優(yōu)點而得到廣泛的應(yīng)用。甲醇酵母系統(tǒng)是一種真核表達(dá)系統(tǒng)，可以對表達(dá)的蛋白進(jìn)行加工折疊和翻譯后修飾；具有很高的表達(dá)量，已經(jīng)達(dá)到了14.8g/L；節(jié)省成本，只需要簡單的培養(yǎng)基；可以高密度發(fā)酵；背景雜蛋白少，表達(dá)產(chǎn)物容易純化。
畢氏酵母(Pichia pastoris)系統(tǒng)是近年來發(fā)展很快的一個真核表達(dá)系統(tǒng)，許多有活性的蛋白質(zhì)已經(jīng)在畢氏酵母系統(tǒng)中大量表達(dá)。畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)是真核表達(dá)系統(tǒng)，可以對表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行加工折疊和修飾，還具有發(fā)酵方法成熟、發(fā)酵密度高、培養(yǎng)簡單廉價、外源蛋白質(zhì)既可以胞內(nèi)積累又可分泌；表達(dá)產(chǎn)量高、背景蛋白質(zhì)少易于表達(dá)產(chǎn)物純化等優(yōu)點。
DNA改組是在與基因相關(guān)的DNA片段群體中，由于大量的隨機(jī)相互參入而導(dǎo)致的重組或突變。20世紀(jì)80年代，Leder提出DNA改組(DNA shuffling)概念，期望能通過發(fā)現(xiàn)一個新的遺傳系統(tǒng)增加基因DNA甚至RNA的改變。Stemmer建立了DNA改組的成熟技術(shù)，之后該技術(shù)發(fā)展迅速，利用該技術(shù)可以大大提高基因功能和改變基因的編碼和結(jié)構(gòu)，突變后的基因在序列、結(jié)構(gòu)、功能上均顯著區(qū)別于原來基因。短短二十年間，利用該技術(shù)在已成功地對許多功能基因進(jìn)行了改造，取得了一系列研究成果，例如，獲得了提高32000倍的β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)及熒光強(qiáng)度超過野生型45倍的綠色熒光蛋白(GFP)。通過DNA改組方法，Crameri等得到了高抗砷酸鹽(arsenate)的菌株；Matsumura等成功對GUS基因進(jìn)行突變，獲得了在用戊二醛或甲醛固定植物材料中，GUS活性穩(wěn)定的β-葡萄糖苷酸酶。
目前可用于甲醇酵母表達(dá)的啟動子有很多，其中大多數(shù)來源于甲醇酵母本身，如AOX1、AOX2、DAS、P40、GAP、FLD等。不同的啟動子根據(jù)其在天然轉(zhuǎn)錄的蛋白在酵母中的作用不同而強(qiáng)弱不同。其中乙醇氧化酶啟動子(AOX1)是使用最多、表達(dá)效率最高的一個啟動子。在乙醇氧化酶啟動子被分離、克隆，并建立了轉(zhuǎn)化方法后，畢氏酵母已被發(fā)展成為一種高效的外源蛋白表達(dá)宿主。近年來，許多蛋白質(zhì)在畢氏酵母中實現(xiàn)了高效表達(dá)，達(dá)到了克級水平，部分達(dá)到了十幾克的高表達(dá)；但仍然有多種的蛋白質(zhì)表達(dá)量相對較低。提高畢氏酵母外源蛋白質(zhì)的表達(dá)量是降低工業(yè)化生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。在菌株、培養(yǎng)條件、發(fā)酵等逐漸成熟的情況下，構(gòu)建高表達(dá)的載體是提高外源基因表達(dá)量的一個關(guān)鍵因素。
乙醇氧化酶啟動子(AOX1)控制著乙醇氧化酶的表達(dá)機(jī)制，而乙醇氧化酶可催化甲醇的代謝反應(yīng)。由于AOX1表達(dá)系統(tǒng)中需要使用甲醇，鑒于甲醇對細(xì)胞的毒性和甘油對甲醇誘導(dǎo)的弱抑制等因素，在發(fā)酵過程中必須先經(jīng)過1-2天的甘油生長階段，再通過補(bǔ)加甘油和其它成分，以及通過控制溶解氧含量和發(fā)酵環(huán)境的PH使細(xì)胞生長到合適的密度，最后才逐漸補(bǔ)加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)酵過程中必須使細(xì)胞處于一段“饑餓期”，消耗發(fā)酵環(huán)境中的甘油。整個發(fā)酵周期需要10天左右，發(fā)酵過程較難控制。而且發(fā)酵過程中大量使用甘油。
葡萄糖的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于甘油，用葡萄糖替代甘油作為碳源，可以節(jié)約發(fā)酵成本。但由于葡萄糖是表達(dá)的阻遏物，當(dāng)AOX啟動子用葡萄糖進(jìn)行甲醇酵母發(fā)酵時，用甲醇誘導(dǎo)效果較低，因此必須去除發(fā)酵液中痕量的葡萄糖，才能夠獲得好的誘導(dǎo)表達(dá)效果，因而目前一般難以實現(xiàn)用葡萄糖作為碳源。尋找和發(fā)掘新的更好的甲醇酵母啟動子具有重要的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有改組乙醇氧化酶啟動子的畢赤酵母植酸酶表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)中采用經(jīng)過DNA改組突變和篩選得到的AOX1啟動子，能夠利用葡萄糖作為碳源，在簡便的發(fā)酵條件獲得外源蛋白的高效表達(dá)，從整體上降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明所提供的植酸酶表達(dá)系統(tǒng)包括(1)含有改組乙醇氧化酶啟動子的甲醇酵母表達(dá)載體pYPX99質(zhì)粒；(2)宿主畢赤酵母[Pichia pastoris(His-Mut+)]。
本發(fā)明畢赤酵母植酸酶表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法由下列步驟組成1、乙醇氧化酶啟動子(AOX1)突變體庫的構(gòu)建；本步驟通過DNA突變過程，包括AOX1啟動子DNA片段的擴(kuò)增，AOX1啟動子DNA片段PCR產(chǎn)物用DNA酶降解得到小片段，小片段進(jìn)行無引物的PCR擴(kuò)增以及取無引物PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行引物PCR擴(kuò)增四步，獲得AOX1啟動子DNA片段的突變體庫。
(1)AOX1啟動子DNA片段的擴(kuò)增根據(jù)基因庫Z46233(查閱網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的乙醇氧化酶啟動子核苷酸序列(見圖1)，合成兩個寡核苷酸引物。以含有AOX1啟動子的質(zhì)粒pPCI9為模板，擴(kuò)增得到長度為940bp左右的AOX1啟動子DNA片段。
(2)回收DNA，回收的AOX1啟動子DNA片段用DNA酶進(jìn)行降解，形成彌散的片段，通過透析袋回收30-50bp的小片段。
(3)回收產(chǎn)物進(jìn)行無引物PCR擴(kuò)增，形成200-400bp的彌散條帶。
(4)取無引物擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，加入引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物即為AOX1啟動子DNA片段的突變體庫。
2、含AOX1啟動子DNA片段的突變體庫的甲醇酵母表達(dá)載體pYPX99質(zhì)粒的構(gòu)建本步驟是將回收的AOX1啟動子DNA片段的突變體庫經(jīng)過BglII和HindIII雙酶切后，植入含有報告基因酸性植酸酶的甲醇酵母表達(dá)載體pPCI9中，構(gòu)建形成pYPX99質(zhì)粒，其構(gòu)建策略見圖7。該質(zhì)粒可以通過檢測酸性植酸酶的活性篩選所需要的改組AOX1啟動子。
3、陽性酵母菌的篩選本步驟是將含有報告基因酸性植酸酶及突變的AOX1啟動子庫的表達(dá)載體pYPX99質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌畢氏酵母[Pichia pastoris(His-Mut+)]，在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選得到良好表達(dá)酸性植酸酶的陽性酵母菌。
(1)將構(gòu)建好的含有報告基因酸性植酸酶的及突變的AOX1啟動子庫的表達(dá)載體pYPX99質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，轉(zhuǎn)化物涂布在含有氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，進(jìn)行建庫，獲得大于108個轉(zhuǎn)化子。
(2)將庫進(jìn)行質(zhì)粒抽提，后電泳鑒定。
(3)用限制性內(nèi)切酶BglII對抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌株[Pichia pastoris(His-Mut+)]，將轉(zhuǎn)化子在含有葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心去除培養(yǎng)基中的葡萄糖成分，進(jìn)行表達(dá)篩選，獲得良好表達(dá)酸性植酸酶的陽性菌株。
本發(fā)明所構(gòu)建的改組AOX1啟動子的測序與分析利用PCR方法，從篩選得到的畢赤酵母陽性菌株中擴(kuò)增AOX1啟動子，構(gòu)建入克隆載體PMD18-T。經(jīng)過DNA序列測定，得到全長的核苷酸序列。分析發(fā)現(xiàn)與原始的AOX1啟動子核苷酸序列相比，核苷酸改動了48個，同源性為94.9％。
本發(fā)明所構(gòu)建的改組AOX1啟動子的核苷酸序列見圖2。


圖1為基因庫Z46233公布的乙醇氧化酶啟動子核苷酸序列。
圖2為改組后的乙醇氧化酶啟動子核苷酸序列。
圖3為引物核苷酸序列。
圖4為PCR擴(kuò)增AOX1啟動子DNA產(chǎn)物瓊脂糖電泳鑒定圖譜，其中左列為DNA長度標(biāo)記，右列為PCR擴(kuò)增AOX1啟動子DNA產(chǎn)物電泳條帶，該條帶大小為938bp。
圖5為用DNA酶對PCR擴(kuò)增AOX1啟動子DNA產(chǎn)物進(jìn)行降解的結(jié)果丙烯酰胺電泳鑒定圖譜，其中左列為降解產(chǎn)物電泳條帶，右列為DNA長度標(biāo)記。
圖6為降解產(chǎn)物的無引物擴(kuò)增結(jié)果的瓊脂糖電泳鑒定圖譜，其中左列為DNA長度標(biāo)記，右列為無引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶。
圖7為有引物PCR擴(kuò)增得到的AOX1啟動子DNA片段的突變體庫的瓊脂糖電泳鑒定圖譜，其中左列為DNA長度標(biāo)記，右列為AOX1啟動子DNA片段的突變體庫的電泳條帶。
圖8為pYPX99質(zhì)粒構(gòu)建策略圖。
圖9為畢赤酵母表達(dá)酸性植酸酶活性試驗結(jié)果圖，其中1表示用甘油進(jìn)行發(fā)酵的含有常規(guī)AOX1啟動子的畢赤酵母，2表示用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵的含有改組AOX1啟動子的畢赤酵母。有益效果1、本發(fā)明提供的含有改組乙醇氧化酶啟動子的畢赤酵母植酸酶表達(dá)系統(tǒng)對酸性植酸酶有高效表達(dá)性。
2、本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)采用經(jīng)過DNA改組突變和篩選得到的AOX1啟動子，能夠利用葡萄糖替代甘油作為碳源，節(jié)約了發(fā)酵成本，縮短發(fā)酵周期，從整體上降低生產(chǎn)成本。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
下述實施例中，所用的試驗材料及其來源包括質(zhì)粒pPCI9、大腸桿菌菌株DH5α購自Invitrogen公司；畢氏酵母菌株[Pichia pastoris(His-Mut+)]購自美國種質(zhì)保藏中心(ATCC)；ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA測序試劑盒購自美國應(yīng)用系統(tǒng)公司；質(zhì)粒PMD18-T、限制性內(nèi)切酶XhoI和NotI；BglII和HindIII酶、Taq聚合酶、脫氧核糖核酸酶(DNase I)、連接酶、dNTP、10×PCRbuffer購自寶生物工程大連有限公司。
下述實施例中常規(guī)的基因操作參照有關(guān)文獻(xiàn)，其中引物PAGE純化、透吸袋回收DNA、DNA測序、質(zhì)粒堿法抽提方法參照分子克隆文獻(xiàn)Sambrook J，F(xiàn)rets E F，Mannsdes T et al.InMolecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.植酸酶酶活的測定參照van der Heeft.Phytase activity，vanadate manual method.Gist-brocades methodNr，1995，61696(41)，2832)；酵母DNA抽提參照Adams，A.，Gottschling，D.E.，Kaiser，C.A.andStearns，T.(1998)Methods in yeast geneticsA Cold Spring Harbor laboratory course manual.Cold Spring Harbor laboratory press。
實施例1 PCR擴(kuò)增AOX1啟動子DNA片段
(一)試驗方法1、寡核苷酸引物的合成1)根據(jù)基因庫Z46233(查閱網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的乙醇氧化酶啟動子核苷酸序列，設(shè)計兩個寡核苷酸引物，分別編號為A1、A2。為了便于克隆和構(gòu)建，在引物的5’端分別加上了BglII和HindIII酶切位點序列。所設(shè)計的引物序列具體見圖32)引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。
3)參照分子克隆文獻(xiàn)方法進(jìn)行PAGE純化。
2.PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物A1 5’aagatctctgaaaaataacagttattatt 3’A2 5’aaagcctatctctcaagttgtcgtt 3’pPCI9質(zhì)粒模板1μl；A110.2ng；A20.2ng；10×PCR buffer5μl；dNTP(2.5mmol/L)4μl；Taq聚合酶2U；加ddH2O至終體積為50μl。
反應(yīng)程序為94℃10min預(yù)變性，94℃變性30s，72℃復(fù)性和延伸2min，共30循環(huán)。
采用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，用透吸袋法回收得到938bp的基因片段。
3、DNA序列的測定采用雙脫氧核苷酸終止法，用ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA測序試劑盒，在ABI377型DNA自動化熒光測序儀上進(jìn)行雙鏈DNA序列的測定。
(二)試驗結(jié)果1、采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的結(jié)果見圖4。
2、AOX1啟動子測序結(jié)果用PCR法擴(kuò)增得到AOX1啟動子的DNA序列與基因庫Z46233公布的序列比較，結(jié)果完全一致。
實施例2乙醇氧化酶啟動子(AOX1)突變體庫的構(gòu)建(一)試驗方法1、AOX1啟動子DNA片段的DNase I降解及回收1)DNase I降解用100μl DNase I緩沖液溶解實施例1所回收的AOX1啟動子DNA片段，加入0.1UDNase I，25℃處理15min后70℃處理10min(失活DNA酶)。采用10％丙烯酰胺凝膠電泳鑒定降解產(chǎn)物。本步驟中，DNase I緩沖液的組成為50mmol/L Tris-Cl pH7.4+1mmol/L MgCl22)降解產(chǎn)物回收用透吸袋法回收得到10～50bp的小片段。用10μl 10×無引物PCR緩沖液(50mmol/LKCl+10mmol/LTris-Cl pH9.0+1％Triton)溶解沉淀。
2、降解產(chǎn)物的無引物PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
降解小片段DNA模板5μl；dNTPs(2.5mmol/L)4μl；MgCl2(2.5mmol/L)4.5μl；Ex-Taq聚合酶2U；加ddH2O至終體積為50μl。
反應(yīng)程序為94℃30s，40℃30s，72℃30s，共45個循環(huán)。
采用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果，用透吸袋法回收DNA。
3、無引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的引物PCR擴(kuò)增無引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物模板5μl；A110.2ngA2 0.2ng；10×PCR buffer5μl；dNTPs(2.5mmol/L)4μl；Pyrobest-Taq聚合酶2U；加ddH2O至終體積為50μl。
反應(yīng)程序為94℃30s，70℃30s，72℃1min，共35個循環(huán)。
1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收DNA。
(二)試驗結(jié)果1、采用丙烯酰胺凝膠電泳鑒定降解產(chǎn)物的結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，AOX1啟動子DNA片段經(jīng)DNase I降解后，形成長度為30-50bp的彌散小片段。
2、采用瓊脂糖凝膠電泳檢測降解產(chǎn)物的無引物PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，降解產(chǎn)物經(jīng)無引物PCR擴(kuò)增后，形成長度為200-400bp的彌散片段。
3、用瓊脂糖凝膠電泳檢測引物PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，無引物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過引物PCR擴(kuò)增后，得到長度為938bp的片段。此片段即為AOX1啟動子的突變體庫。
實施例3含AOX1啟動子DNA片段的突變體庫的甲醇酵母表達(dá)載體pYPX99M質(zhì)粒及突變體庫轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建1、pYPX99質(zhì)粒的構(gòu)建按Sambrook分子生物學(xué)基本操作(Sambrook J，F(xiàn)rets E F，Mannsdes T et al.InMolecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.)，先通過XhoI和NotI將將甲醇酵母表達(dá)載體pPIC9酶切，用T4DNA連接酶連接將酸性植酸酶基因AF542235(查閱網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov)連接進(jìn)去，在AOX1啟動子的突變體庫DNA片段和甲醇酵母表達(dá)載體pPIC9質(zhì)粒分別用BglII和HindIII酶切，透吸袋法回收酶切產(chǎn)物，其中回收AOX1啟動子的突變體庫DNA片段酶切產(chǎn)物長度為938bp，pPIC9酶切產(chǎn)物長度為9kb左右，用T4DNA連接酶連接，所得到的連接產(chǎn)物即為含AOX1啟動子DNA片段的突變體庫的甲醇酵母表達(dá)載體pYPX99質(zhì)粒。其質(zhì)粒構(gòu)建策略圖見圖8。
2、突變體庫轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建將構(gòu)建好的pYPX99質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，轉(zhuǎn)化物涂布在含有氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，待長出克隆后，刮取全部的克隆進(jìn)行質(zhì)粒堿法抽提獲得含改組突變的AOX1啟動子，以酸性植酸酶為報告基因的突變體庫轉(zhuǎn)化子，本步驟中得到的轉(zhuǎn)化子數(shù)量多達(dá)108個。
實施例4陽性酵母菌的篩選
1、宿主酵母的預(yù)處理將活化的畢赤酵母置于500mL YPD培養(yǎng)基(配方20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、20g/L葡糖糖)中30℃培養(yǎng)18小時，至A值達(dá)到1.7，5 000r/min離心10分鐘收集菌體，先后用0℃預(yù)冷的500mL、250mL無菌水洗菌體，離心10分鐘，去上清液，用20mL0℃預(yù)冷的1mol/L山梨醇懸浮菌體。5 000r/min離心10分鐘離心后菌體再用0.5mL0℃預(yù)冷的山梨醇懸浮，用于電擊備用。
2、轉(zhuǎn)化子培育大量抽提酵母表達(dá)質(zhì)粒，BglII酶切回收小片段，取2μg線性化片段加入50μL感受態(tài)細(xì)胞，冰浴5min，用Bio-Red GenePulser電擊儀電擊，參數(shù)為2.5kV，25μF。電擊結(jié)束后，立即加入1.0mL 0℃預(yù)冷的1.0mol/L山梨醇，取200μL涂布于固體選擇培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。培養(yǎng)基的組成為186g/L山梨醇、20g/L葡萄糖、13.4g/L酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基(YNB)、0.05g/L谷氨酸、0.05g/L甲硫氨酸、0.05g/L賴氨酸、0.05g/L亮氨酸、0.05g/L異亮氨酸、20g/L瓊脂糖。
3、陽性酵母菌的篩選(在本步驟中如何體現(xiàn)甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵？將大量的轉(zhuǎn)化子接種到以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基(13.4g/L YNB、0.4mg/L生物素、200g/L葡萄糖)中進(jìn)行生長，30℃，200rpm，經(jīng)過2天培養(yǎng)至OD600達(dá)到2.0左右。通過5 000r/min離心10分鐘離心收集菌體，在去除葡萄糖的培養(yǎng)基(13.4g/L YNB、0.4mg/L生物素)中進(jìn)行2天30℃，200rpm，培養(yǎng)表達(dá)。經(jīng)過對108個轉(zhuǎn)化子植酸酶酶活的測定，從中得到一株酸性植酸酶表達(dá)最好的陽性菌株，編號為ps-1，其酶活在試管中達(dá)到150FTU/mL。將陽性菌株ps-1接種200ml YPD培養(yǎng)基YPD(蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡糖糖20g/L)，30℃，200rpm，經(jīng)過2天培養(yǎng)至OD600達(dá)到2.0左右，轉(zhuǎn)入B.Braun 5L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵，以YPD培養(yǎng)重組酵母，利用氨水控制pH值為5.5，發(fā)酵過程中含氧量控制在20％，培養(yǎng)過程中補(bǔ)加40％葡萄糖溶液，培養(yǎng)140h，測定酸性植酸酶的表達(dá)量為3900U/mL。
實施例5畢赤酵母的酸性植酸酶表達(dá)試驗(一)試驗方法1、試驗組對照組含有原始AOX1啟動子的畢赤酵母本發(fā)明試驗組實施例4篩選得到的陽性菌株ps-12、操作步驟1)對照組菌株的構(gòu)建通過XhoI和NotI將購得的含有原始AOX1啟動子的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9酶切，用T4DNA連接酶連接將酸性植酸酶基因AF542235(查閱網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov)連接進(jìn)去構(gòu)建完成含有原始原始AOX1啟動子和酸性磷酸酶報告基因的表達(dá)載體pPIC9。
2)將構(gòu)建好的pPIC9質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，轉(zhuǎn)化物涂布在含有氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，待長出克隆后，刮取菌落，通過堿法抽提質(zhì)粒，參照實施例4的步驟1-2的方法獲得含有原始AOX1啟動子的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子。
3)對照組菌株的發(fā)酵與表達(dá)對照組的培養(yǎng)條件是先將轉(zhuǎn)化子接種到以甘油為碳源的培養(yǎng)基(13.4g/L YNB、0.4mg/L生物素、200g/L甘油)中進(jìn)行生長，30℃，200rpm，經(jīng)過2天培養(yǎng)至OD600達(dá)到2.0左右，轉(zhuǎn)入B.Braun 5L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵，以以甘油為碳源的培養(yǎng)基(13.4g/L YNB、0.4mg/L生物素、200g/L甘油)培養(yǎng)重組酵母，利用氨水控制pH值為5.5，發(fā)酵過程中含氧量控制在20％，培養(yǎng)90h，甘油耗盡，再加入0.5％甲醇，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)時間為60小時，總的發(fā)酵時間為140小時。對照組的酸性植酸酶表達(dá)量為5600U/mL。
試驗組的發(fā)酵與表達(dá)同實施例4。
(二)試驗結(jié)果酸性植酸酶的表達(dá)結(jié)果見圖9。如圖9所示，對照組的酸性植酸酶表達(dá)量為5600U/mL；本發(fā)明試驗組的酸性植酸酶的表達(dá)量為3900U/mL，利用前期用葡萄糖進(jìn)行菌體生長，后期通過去除培養(yǎng)基中的葡萄糖成分進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的方式，本發(fā)明提供的畢赤酵母陽性菌株對酸性植酸酶的表達(dá)量為常規(guī)方法的69.6％?？梢?，本發(fā)明提供的含有改組乙醇氧化酶啟動子的畢赤酵母植酸酶表達(dá)系統(tǒng)能夠利用葡萄糖替代甘油作為碳源，節(jié)約了發(fā)酵成本，縮短發(fā)酵周期，而對酸性植酸酶有良好的表達(dá)性。
實施例6改組AOX1啟動子的測序與分析1)酵母DNA抽提通過酵母DNA抽提方法(參照Adams，A.，Gottschling，D.E.，Kaiser，C.A.and Stearns，T.(1998)Methods in yeast geneticsA Cold Spring Harbor laboratory course manual.Cold Spring Harbor laboratory press.)獲得含有改組AOX1啟動子的陽性菌株的DNA。
2)克隆入PMD-18載體將抽提得到的改組AOX1啟動子基因片段10μl，PMD-18載體1μl，T4DNA連接酶1μl，buffer 3μl，無菌水15μl混合后存放于4℃冰箱過夜。
通過化學(xué)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(參照分子克隆文獻(xiàn)Sambrook J，F(xiàn)rets E F，MannsdesT et al.InMolecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.)。
3)堿法抽提質(zhì)粒，通過BglII和HindIII酶切鑒定，得到載體為2.8kb左右，片段為950bp左右的正確克隆。測序結(jié)果見圖2。
比較圖1和圖2可見，本發(fā)明提供的改組AOX1啟動子核苷酸序列與原始AOX1啟動子相比，具有94.9％的同源性，改動的核苷酸達(dá)48個。
序列表<110>上海永業(yè)農(nóng)科生物工程有限公司<120>一種含有改組乙醇氧化酶啟動子的畢赤酵母植酸酶表達(dá)系統(tǒng)<130>ZP041084<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>938<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>promoter<222>(1)..(938)<223>雙鏈DNA分子，啟動子作用，通過DNA改組而來，含有A、T、G、C四種常規(guī)堿基<400>1ctgaagaata atagttaata ttcgagatgt aacatccaca gacgaaaggt tgaatgaaac 60ctttttgcca tacgacatcc acacgtccat tctcacaaat aagtgccaaa cgcaactgga120ggggatacgc tagcagcaga cctttgcaaa cgcaggacct ccactcctct tctgctcaac180acccactttt gccgtcgaaa aaccagccca gttattgggc ttgattggag ttcgctcgtt240ccaattcctt ctattaagct actaacatta tgactttatt agcctgtcta tcctggctcc300cctggcgagg ttcatgtttg tatatttccg aatgcaacaa gctccgcatt agacccgaac360atcactccag gtgagggctt tctgagtgtg gggtcaaata gtctcatgtt ccccaaatgg420tccaaaactg acagtttaca cgctgtcttg caacctaata tgtcaaaagc gtgatctcat480acaagatgaa ctaagtttgg ttcgttgaaa tgccaacggc cagttggtca ataagaaact540tccaaaagtc gccataccgt atgtcttgtt tgatattgat tgacgaatga tcaggaataa600tctcattaat gcttagcgca gtctctctag cgcttctgaa ccccggtgca cctgtgccga660aacgcaaatg gcgaaacacc cgctttttgc atgattatgc attagctcca cattgtatgc720ttccaagatt ctggtgggaa tactcgtgat agcctaacgt tcatgatcat aatttaactg780ttctaacccc tacttgacag caatatataa acataaggaa gctgccctgt cttaaacctt840tttttttatc atctttatta gcttactttc ataattgaga ctggttccaa ttgacaagct900tttgatttta acgacactta acgacaactt gagaagat938
權(quán)利要求
1.一種含有改組乙醇氧化酶啟動子的畢赤酵母植酸酶表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于包括(1)含有改組乙醇氧化酶啟動子的甲醇酵母表達(dá)載體pYPX99質(zhì)粒；(2)宿主畢赤酵母[Pichiapastoris(His-Mut+)]。
2.根掘權(quán)利要求1所述的含有改組乙醇氧化酶啟動子的畢赤酵母植酸酶表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于改組乙醇氧化酶啟動子的核苷酸序列與原始乙醇氧化酶啟動子相比，具有94.9％的同源性，改動的核苷酸達(dá)48個，改組啟動子具有如下序列ctgaagaataatagttaatattcgagatgtaacatccacagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatacgacatccacacgtccattctcacaaataagtgccaaacgcaactggaggggatacgctagcagcagacctttgcaaacgcaggacctccactcctcttctgctcaacacccacttttgccgtcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagttcgctcgttccaattccttctattaagctactaacattatgactttattagcctgtctatcctggctcccctggcgaggttcatgtttgtatatttccgaatgcaacaagctccgcattagacccgaacatcactccaggtgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtctcatgttccccaaatggtccaaaactgacagtttacacgctgtcttgcaacctaatatgtcaaaagcgtgatctcatacaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgccaacggccagttggtcaataagaaacttccaaaagtcgccataccgtatgtcttgtttgatattgattgacgaatgatcaggaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctagcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggcgaaacacccgctttttgcatgattatgcattagctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactcgtgatagcctaacgttcatgatcataatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacataaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatctttattagcttactttcataattgagactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacacttaacgacaacttgagaagat。
3.一種甲醇酵母表達(dá)載體pYPX99質(zhì)粒，其特征在于含有酸性磷酸酶報告基因和乙醇氧化酶啟動子DNA片段的突變體庫。
4.一種畢赤酵母菌株，其特征在于含有權(quán)利要求2所述的改組乙醇氧化酶啟動子。
5.權(quán)利要求1所述的畢赤酵母植酸酶表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，由下列步驟組成(1)、乙醇氧化酶啟動子(AOX1)突變體庫的構(gòu)建通過DNA突變過程，包括AOX1啟動子DNA片段的擴(kuò)增，AOX1啟動子DNA片段PCR產(chǎn)物用DNA酶降解得到30-50bp的小片段，小片段進(jìn)行無引物的PCR擴(kuò)增得到200-400bp的片段以及取無引物PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行引物PCR擴(kuò)增四步，獲得AOX1啟動子DNA片段的突變體庫；(2)、含AOX1啟動子DNA片段的突變體庫的甲醇酵母表達(dá)載體pYPX99質(zhì)粒的構(gòu)建將回收的AOX1啟動子DNA片段的突變體庫經(jīng)過BglII和HindIII雙酶切后，植入含有報告基因酸性植酸酶的甲醇酵母表達(dá)載體pPCI9中，構(gòu)建形成pYPX99質(zhì)粒；(3)、陽性酵母菌的篩選將構(gòu)建好的含有報告基因酸性植酸酶的及突變的AOX1啟動子庫的表達(dá)載體pYPX99質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，轉(zhuǎn)化物涂布在含有氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，進(jìn)行建庫，獲得大于108個轉(zhuǎn)化子，然后將庫進(jìn)行質(zhì)粒抽提、電泳鑒定，之后，在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用限制性內(nèi)切酶BglII對抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌株[Pichia pastoris(His-Mut+)]，將轉(zhuǎn)化子在含有葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心去除培養(yǎng)基中的葡萄糖成分，進(jìn)行表達(dá)篩選，獲得良好表達(dá)酸性植酸酶的陽性菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有改組乙醇氧化酶啟動子的畢赤酵母植酸酶表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)中采用經(jīng)過DNA改組突變和篩選得到的AOX1啟動子，能夠利用匍萄糖作為碳源，在簡便的發(fā)酵條件獲得酸性植酸酶的高效表達(dá)，從整體上降低生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N9/16GK1749399SQ20041006635
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月14日
發(fā)明者姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生, 吳偉, 劉承訓(xùn) 申請人:上海永業(yè)農(nóng)科生物工程有限公司