專利名稱：一種調(diào)控木質(zhì)素合成相關酶基因的啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物啟動子及其應用，特別是涉及一種調(diào)控木質(zhì)素合成相關酶基因C4H的啟動子及其應用。
背景技術：
木質(zhì)素是植物體中含量僅次于纖維素的一類高分子有機物質(zhì)，陸生植物的木質(zhì)素合成是適應陸地環(huán)境的重要進化特征之一。木質(zhì)素為植物提供機械支持，保護植物免受真菌入侵，其疏水性保證了水分在植物體內(nèi)的正常運輸。然而它的存在不利于生產(chǎn)應用，在制漿造紙中，為去除木質(zhì)素所采取的化學處理不僅費用昂貴，且對環(huán)境造成的危害極大；牧草中的木質(zhì)素含量與其對牲畜的消化性呈負相關。因此，通過基因工程降低植物木質(zhì)素含量具有重大的環(huán)保效益與經(jīng)濟意義(Douglas C J，etal.，1996，Trends Plant Sci，1171-178；Chemey，魏建華等.植物學報，2001，43(9)771-779.)。
我國森林資源匱乏，林木生產(chǎn)已經(jīng)遠遠不能滿足紙漿生產(chǎn)，至今我國造紙原料仍以草漿生產(chǎn)為主，這類原料加工容易，但產(chǎn)生的造紙廢水極難處理，只好排放到江河湖海中，污染后果觸目驚心，而且國家每年需消耗巨額外匯進口木漿。解決原料與生產(chǎn)的供需矛盾，維持原有生態(tài)平衡的關鍵，就是從林木育種開始，大力培育適用造紙的用材林。傳統(tǒng)育種技術周期長，性狀不易控制，不能在較短時間內(nèi)解決我國造紙原料問題，若將基因工程與常規(guī)育種技術相結合，定向改良林木品質(zhì)，則可大大縮短育種周期，同時也避免了大量人力和物力消耗，能更快更好地培育出適合造紙的新品種資源，以緩解我國林木供應和造紙生產(chǎn)間日趨突出的矛盾。此外，也會極大縮減用于治理污染的費用，達到經(jīng)濟、社會和環(huán)保效益相統(tǒng)一。因此利用生物技術手段調(diào)控植物中木質(zhì)素生物合成代謝途徑、培育低污染的造紙資源植物具有極大的應用前景。
目前人們從許多植物中分離了多種與木質(zhì)素合成相關酶的編碼基因及啟動子序列，且已開始進行木質(zhì)素合成調(diào)控的研究，并取得了一些進展(Higuchi T，et al.1994.J Biotechnol 37151-158；Lee D，et al.，1997，Plant Cell，9，1985-1998；Hu W J，et al，999，Nat Biotch.17，808-812；Guo D J，et al.，2001，Plant Cell，1373-88；Goujon T.，et al.，2003，Planta 217218-228.)。在此類研究中使用較多的仍是組成型啟動子CaMV35S啟動子，盡管該啟動子表達效率強，然而由于其表達不受時空限制，在調(diào)控木質(zhì)素合成代謝過程中，會驅動基因在一些非木質(zhì)化的部位表達，既消耗生物能源，同時會導致一些可能對植物生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響的代謝產(chǎn)物的合成。若選擇木質(zhì)部特異性啟動子，有助于定時定向調(diào)控木質(zhì)素合成途徑，既節(jié)約能源，保證了植物正常生理活動不受干擾，同時又能有效地服務于生產(chǎn)。
肉桂酸4-羥基化酶(C4H)是一種細胞色素P450單氧化物酶，催化苯丙酸途徑中的第一個氧化反應，即將反式-肉桂酸催化生成對-香豆酸。與苯丙氨酸裂解酶(PAL)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)一起，參與碳向木質(zhì)素、軟木脂、類黃酮等各種重要酚類物質(zhì)的轉換合成過程(Chapple C，1998.Annu Rev Plant Physiol PlantMol Biol，49311-343)。目前C4H基因已從許多植物中分離，多數(shù)基因編碼的氨基酸序列具有85％以上的同源性。該酶的表達受多種因子調(diào)控，如光、受傷、激發(fā)子、病原菌侵染等，同時它與植物的木質(zhì)化進程密切相關(Chapple C，1998.Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol，49311-343)。歐芹中C4H表達模式研究結果顯示，該酶在維管束發(fā)達的花梗中表達豐富，在幼葉和老葉中不表達(Koopmann E，et al，1999.Plant Physiol，11949-56)，擬南芥中C4H基因于正在木質(zhì)化的細胞中表達最強(Bell-Lelong DA，et al，1997.Plant Physiol 113729-738)。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種調(diào)控木質(zhì)素合成相關酶基因C4H的啟動子。
本發(fā)明所提供的調(diào)控木質(zhì)素合成相關酶基因C4H的啟動子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
序列表中SEQ ID №1的DNA序列由1117個堿基組成；序列表中序列1的自5′端第212-219位堿基為轉錄因子Myb26的結合位點GTTAGGTT，自5′端第910-917位堿基為轉錄因子MYB的結合位點CACCAACC。
含有所述木質(zhì)素合成相關酶基因C4H啟動子的表達盒、表達載體、細胞系和轉基因株系也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的發(fā)明人設計引物，以毛白楊基因組DNA為模板，利用PCR方法從毛白楊中分離了與木質(zhì)素合成酶相關基因C4H啟動子，并初步研究了其在植物中的表達特性。實驗證明本發(fā)明的啟動子使熒光素酶報道基因只在維管束部位特異性表達。本發(fā)明的啟動子分離及其功能的闡明，為將來應用于林木材性改良的研究奠定了基礎，在培育更適于造紙用資源樹種、低污染的造紙資源植物具有極大的應用前景。


圖1為從毛白楊基因組DNA中PCR擴增C4H啟動子的電泳圖譜圖2為C4H啟動子融合GUS基因的植物表達載體PC4H構建過程示意3為植物表達載體PC4H鑒定圖譜圖4為C4H啟動子與CCoAOMTcDNA融合的植物反義表達載體PC4HCOA構建過程示意5為植物反義表達載體PC4HCOA鑒定圖譜圖6a為轉化PC4H載體的煙草威斯康辛38的PCR鑒定圖譜圖6b為轉化PC4HCOA載體的煙草威斯康辛38的PCR鑒定圖譜圖7a為C4HGUS基因在轉基因煙草威斯康辛38葉柄中的GUS活性染色結果圖7b為C4HGUS基因在轉基因煙草威斯康辛38莖中的GUS活性染色結果圖8為C4HGUS基因在轉基因煙草威斯康辛38各組織GUS熒光活性測定的柱狀圖具體實施方式
實施例1、毛白楊C4H啟動子序列的分離1、啟動子引物設計依據(jù)文獻(Kawai S，et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.1996，60(10)，1586-1597)，設計啟動子引物，并在其上依次添加兩個酶切位點PstI和XbaI(下劃線所示)，以便于載體構建。該啟動子正向引物為5’-CTCTGCAGCC AAGTTAGCCAGACATG-3’(PstI)，反向引物為5’-CCCATCCAAC CATCACTCTCTAGAAC-3’(XbaI)。
2、PCR擴增C4H啟動子序列CTAB小量提取法從毛白楊中分離基因組DNA，引物如前設計，反應程序95℃5min；95℃1min，55℃1min，72℃2min，35個循環(huán)；72℃，7min。分離的目標條帶大約1kb，如圖1所示，測序結果表明木質(zhì)素合成相關酶基因C4H啟動子序列大小為1117bp。圖1中，泳道1為分子量標準，泳道2為C4H基因的啟動子。
對該序列進行序列分析，結果表明該啟動子包含轉錄因子MYB的結合位點CACCAACC(自5′端第910-917位堿基)和轉錄因子Myb26結合位點GTTAGGTT(自5′端第212-219位堿基)。前一序列在與苯丙氨酸代謝及木質(zhì)素生物合成相關酶的編碼基因啟動子序列中都有分布；后一序列推測可能是苯丙酸合成相關酶基因啟動子中的一個順式反應元件。這些保守序列的存在與C4H參與苯丙酸代謝合成途徑的生物學功能相吻合。
實施例2、毛白楊C4H啟動子融合GUS基因的植物表達載體構建C4H啟動子融合GUS基因的植物表達載體PC4H構建過程如圖2所示，具體步驟如下用PstI和XbaI酶切該啟動子片段后，插入經(jīng)相同酶消化的質(zhì)粒pSK中，獲得質(zhì)粒pSK-C4H。再用HindIII和XbaI同時酶切該質(zhì)粒以及PBI121，將包含C4H啟動子的酶切片段連入切除CaMV35S的PBI121中，構建成植物表達載體pC4H。對植物表達載體pC4H進行PCR及酶切鑒定，結果如圖3所示，表明PC4H載體構建準確無誤，圖3中，帶1是DL15000 Marker；帶2是以C4H正向和反向引物(見實施例1)擴增得到的片段，約1.1kb；帶3是XbaI和HindIII進行鑒定的酶切圖譜，切出1.1kb的目標條帶；帶4是PstI單酶切鑒定結果，切出約2.0kb，5.0kb和8.0kb三條目的條帶。
實施例3、毛白楊C4H啟動子與CCoAOMTcDNA反向連接的植物反義表達載體構建C4H啟動子與CCoAOMTcDNA融合的植物反義表達載體PC4HCOA構建過程如圖4所示，具體過程如下將CCoAOMTcDNA片段用XbaI和平端酶Hinc II從載體質(zhì)粒PMD-COA(魏建華，等。植物學報，2001，43(11)1179-1183)。中切下，然后連入用XbaI和平端酶EcoICRI切除GUS基因的質(zhì)粒pC4H中，完成植物反義表達載體PC4HCOA的構建。對植物反義表達載體PC4HCOA進行PCR及酶切鑒定，結果如圖5所示，圖5中，帶1是Marker；帶2是以CCoAOMTcDNA正向引物和反向引物(魏建華，等。植物學報，2001，43(11)1179-1183)。
PCR擴增結果，得到一條約0.75kb目的片段；帶3是以C4H啟動子正向和反向引物(見實施例1)PCR擴增得到的目的片段約1.1kb；帶4是用XbaI和HindIII進行鑒定的酶切圖譜，切出0.5kb和1.1kb的目標條帶；帶5是EcoRI酶切鑒定結果，得到一條目的片段約2.1kb，這些結果表明表達載體PC4HCOA載體構建正確。
實施例4、轉化植株的PCR鑒定結果用凍融法將實施例2和實施例3構建的表達載體導入農(nóng)桿菌中轉化煙草威斯康辛38，以SDS小量提取法提取的轉化植株的DNA為模板進行PCR鑒定，其中轉化PC4H載體的煙草威斯康辛38鑒定所用引物為GUS正向引物5’-GTGGAATTGATCAGCGTTGGTG-3’和反向引物5’-GGTCGCGAGTGAAGATCCCT-3’，鑒定轉化PC4HCOA載體的煙草威斯康辛38使用的引物為C4H5’正向引物5’-TCTGCAGCCAAGTTAGCCAGACATG-3’和CCoAOMTcDNA正向引物(魏建華，等。植物學報，2001，43(11)1179-1183)。結果如圖6a和圖6b所示，圖6a表明轉化PC4H載體的煙草威斯康辛38擴增出一約1.8kb的片段，圖6b表明轉化PC4HCOA載體的煙草威斯康辛38擴增出一約為1.8kb片段；說明轉化植株擴增出與陽性質(zhì)粒同樣片段，陰性對照中無特異片段出現(xiàn)，初步表明已獲得轉基因植株。圖6a和圖6b中，帶1是marker，帶2是陽性質(zhì)粒，帶3是未轉化植株；帶4-8是轉化植株。
實施例5、轉基因煙草威斯康辛38的組織化學分析鑒定將PCR呈陽性的植株進行組織化學染色。具體步驟將植物材料投入GUS染液(100mmol/L Na3PO4(PH7.0)；0.1％ritonX-100；10mmol/L EDTA；0.5mmol/L鐵氰化鉀；0.5mmol/L亞鐵氰化鉀；1mg/ml X-Gluc)中，抽氣5分鐘，然后置于37℃溫育過夜，觀察藍色反應。染色后的組織用FAA固定液脫色。結果如圖7a和圖7b所示，圖7a表明木質(zhì)部中導管和射線薄壁細胞均產(chǎn)生很強信號，其他部位如形成層、韌皮部和髓均未著色；圖7b表明轉基因煙草威斯康辛38莖的木質(zhì)部均染成蘭色，其他部位未產(chǎn)生信號。說明該啟動子表達具有一定的組織特異性，主要在木質(zhì)部表達。
實施例6、轉基因煙草威斯康辛38各組織GUS熒光活性測定按常規(guī)方法將成熟的轉基因煙草威斯康辛38各部位進行熒光活性測定分析。結果如圖8所示，表明木質(zhì)化的組織中GUS表達活性高，如莖、根和花柱；在花瓣和去除主脈的葉中表達量低。其中在莖中，C4H啟動子的表達隨組織木質(zhì)化程度的增高呈逐漸上升的趨勢，表明該啟動子的表達與植物木質(zhì)化進程密切相關。圖8中，1s，3s，5s，7s和9s分別表示從莖的頂端向下依次為第一、三、五、七、九節(jié)莖的莖間。
序列表<160>1<210>1<211>1117<212>DNA<213>楊屬毛白楊(Populus tomentosa Carr)<400>1ctctgcagcc aagttagcca gacatgaaaa ggtgagaaaa acattttttg acataagaaa 60ctaacgttgc ttggatttaa gatagaatta ttgaccttgt aagaagacaa acgtattctt 120ggaaattaac atgtattaat aaatgcaaag tagtttgtca cactatggga taaaatctct 180aataaaaagt aagaccttat agtttcaaga ggttaggttg atatttaaag agagatttct 240tttataactt tttaggttga aatcttgaaa ttaatattaa aaagatttgt taatcatttt 300cttttaaata ctttggattg atgccagggg tttacattta aaattattct taaatgaaac 360ttgatggtgt gtgtttgata ttgtattttc acatgttttt aaaatgaatt tgtttttaaa 420aaatatcaaa ttaataattt ttttattttt tttcaaagat tttaatgtat taattttaaa 480aataaaataa aaattatttt aatatatttt taaataaaaa atattttcaa ataaaaaaat 540taaaaaataa aaagatagga aaaaaacttt cttggttgag ggcctcattc cttgaaattt 600aagaaagcgt ttgggaactc ggtgcaaacc gtgttcctat taaatttgaa tttttttttg 660ttaaaattta atgcggttta tattttttgg atcgttttga tgtgctgata tcaaaaataa 720ttttaaaaaa ataaaaaaaa ttattaatat gtatttcaac acgaaaagtt atttgaaaaa 780caatcaccac cccattgatt cacacgttct aaattatcat aaattagtgg cgcccacatt 840acatcttgaa tagaaataca aaaaggccag gcaaattaat taatatggtg accatatgac 900attttcagcc accaacccgc cttacctact actatccatg attatcaata acagtctcct 960accacctcaa atgtaacgcc gttaactctc tctctctccc ccacacacac aacccaacgc1020gtgaaattca acttcatttc ctctctaatt tttgcagctt ataaaaccca agctctcctc1080atcctgttgc tcccatccaa ccatcactct ctagaac 111權利要求
1.一種調(diào)控木質(zhì)素合成相關酶基因C4H的啟動子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的啟動子，其特征在于所述木質(zhì)素合成相關酶基因C4H啟動子是序列表中的SEQ ID №1。
3.根據(jù)權利要求2所述的啟動子，其特征在于所述序列表中序列1的自5′端第212-219位堿基為轉錄因子Myb26的結合位點。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的啟動子，其特征在于所述序列表中序列1的自5′端第910-917位堿基為轉錄因子MYB的結合位點。
5.含有權利要求1所述的木質(zhì)素合成相關酶基因C4H啟動子的表達盒。
6.含有權利要求1所述的木質(zhì)素合成相關酶基因C4H啟動子的表達載體。
7.含有權利要求1所述的木質(zhì)素合成相關酶基因C4H啟動子的細胞系。
8.含有權利要求1所述的木質(zhì)素合成相關酶基因C4H啟動子的轉基因株系。
9.權利要求1所述的木質(zhì)素合成相關酶基因C4H啟動子在培育造紙用資源植物中的應用。
10.權利要求1所述的木質(zhì)素合成相關酶基因C4H啟動子在培育造紙用資源樹種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木質(zhì)素合成相關酶基因啟動子及其應用。本發(fā)明所提供的木質(zhì)素合成相關酶基因C4H啟動子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。本發(fā)明的啟動子分離及其功能的闡明，為將來應用于林木材性改良的研究奠定了基礎，在培育更適于造紙用資源樹種、低污染的造紙用資源植物具有極大的應用前景。
文檔編號C12N15/63GK1626660SQ20031011829
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月11日 優(yōu)先權日2003年12月11日
發(fā)明者宋艷茹, 趙華燕, 路靜 申請人:中國科學院植物研究所