專利名稱:鑒定阿膠真?zhèn)蔚囊?、試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥檢測領(lǐng)域，特別涉及鑒定阿膠真?zhèn)蔚囊镆约霸噭┖?，還包括該試劑盒的檢測方法。
背景技術(shù)：
膠類藥材是指用動物的皮、鱗、骨骼等，經(jīng)過熬制后以膠入藥的一類中藥，常用的有阿膠，黃明膠，龜甲膠，鹿角膠，新阿膠，魚鱗膠等。膠類藥材是中國所特有的，并有悠久的應(yīng)用歷史，多有補血止血，滋陰潤燥等補益功效。然而，各種膠類藥材原料來源不同，加之用藥部位的不同，因此各種膠類藥材在成分、藥理作用、臨床應(yīng)用上亦有各自的特點。然而目前不僅存在膠類藥材混用，還存在膠類藥材摻雜、摻假的現(xiàn)象，尤其以阿膠最為嚴重。
2002年2月28日，衛(wèi)生部發(fā)布了《關(guān)于進一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》，規(guī)定了阿膠被列為既是食品又是藥品。由此，在國家藥監(jiān)局進行注冊的藥品使用的阿膠類藥品有10種，而大大小小的阿膠類食品和保健品，也應(yīng)運而生，導(dǎo)致阿膠長久以來作為藥品的這一定位開始發(fā)生改變——作為食品。阿膠在《中國藥典2010》有相關(guān)質(zhì)量規(guī)定:以驢皮熬制的膠為阿膠正品，但作為食品和保健品，目前還沒有國家標準。
當前市場上阿膠的制備原料魚龍混雜，其中不乏使用驢的近親源物種馬及騾子的皮熬制的膠，加之由于保健品沒有相關(guān)國家標準，阿膠的監(jiān)管目前并不明朗，而作為食品阿膠的標準，則由企業(yè)自行制定，這也給阿膠造假提供了較大的空間。由于驢、馬、騾同是馬科動物，其皮成膠需經(jīng)過長時間的煮制，加之制作工藝中會加入其他輔料，導(dǎo)致這些使用驢近親源性動物皮冒充驢皮熬制的膠類藥材從外觀上較難辨認，造成檢測難度極大。另一方面，由于目前驢皮原料的短缺，并且騾子皮熬制的膠在外觀上與驢皮熬制的阿膠極為相近，騾子皮成為了許多阿膠產(chǎn)品的摻假原料。
近年來，公開號為CN1605868A的中國專利采用PCR-RFLP方法鑒定包括驢皮等動物皮，但該方法適合用于DNA保存完好，或者輕度破壞樣品的PCR鑒定。阿膠經(jīng)過高溫高壓長時間作用，其DNA含量極少，片段極短，很難擴增出長片段的PCR產(chǎn)物。另外，公開號為CN101974635A的中國專利公開了 PCR方法鑒別阿膠的真?zhèn)魏凸_號為CN101812509A的中國專利公開了鑒定中藥中馬種源性成分的PCR鑒定方法。但這些方法未能鑒別與驢親源性最近的騾子皮摻假的阿膠。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供鑒定阿膠真?zhèn)蔚囊锏囊?，其特異性好，靈敏度高，能適應(yīng)較寬的溫度范圍。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為:
鑒定阿膠真?zhèn)蔚囊?，所述引物由上游引物和下游引物組成，所述上游引物如SEQID N0.1所示核苷酸序列，所述下游引物如SEQ ID N0.2所示核苷酸序列。
本發(fā)明的目的之二在于提供鑒定阿膠真?zhèn)蔚脑噭┖?，技術(shù)方案為:[0010]含有所述引物為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所述核苷酸序列的PCR檢測試劑盒。
本發(fā)明的試劑盒中還包含有PCR聚合酶、dNTPs、緩沖液、MgCl2和雙蒸水。
本發(fā)明的目的之三在于提供鑒定阿膠真?zhèn)蔚姆椒?，鑒定方法簡單，技術(shù)方案為:
利用所述試劑盒鑒定阿膠真?zhèn)蔚姆椒?，包括如下步驟:
a.取阿膠樣品，提取DNA，備用；
b.根據(jù)馬線粒體DNA序列設(shè)計引物，然后以步驟a制備的DNA為模板進行PCR擴增，得PCR擴增產(chǎn)物；
c.將步驟b所得PCR擴增產(chǎn)物進行電泳鑒定，如果PCR擴增產(chǎn)物呈陽性，表明阿膠含有近親源性動物皮。
優(yōu)選的，所述步驟b中，所述引物由上游引物和下游引物組成，所述上游引物如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列，所述下游引物如SEQ ID N0.2所示核苷酸序列。
優(yōu)選的，所述步驟c中，所述近親源性動物皮為馬皮或騾子皮。
優(yōu)選的，所述步驟b中，所述PCR擴增的退火溫度為45_58°C。
更優(yōu)選的，所述PCR擴增的條件為:94 °C預(yù)變性6 min ；94 °C變性30 s, 45-58°C退火30 S，72 °C延伸30 S，35個循環(huán)；然后在72 °C后延伸7 min。
本發(fā)明有益效果在于:本發(fā)明公開了鑒定阿膠真?zhèn)蔚囊?，特異性好，靈敏度高，PCR反應(yīng)體系中DNA終濃度為10_2ng/μ L能檢測到，并且能適應(yīng)較寬的溫度范圍，在45°C _48°C范圍內(nèi)均能特異擴增，使用方便，不需要特殊試劑，利用該引物與PCR試劑組成試劑盒，使用方便；準確度高，能夠準確快速的鑒定出阿膠商品中是否添加有近親源性動物皮，特別是馬皮和騾子皮，該方法即適用于新鮮熬制的樣品，也適合于久存的樣品。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中:
圖1是梯度PCR的擴增產(chǎn)物電泳圖(M =DNA標記物；1:45 °C、2:45.6 °C、3:47.6°C>4:50.1 °C>5:53.2 °C>6:55.8°C>7:57.3°C ；8:58°C )。
圖2是為PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖(M =DNA標記物；1:馬皮膠DNA ；2:驢皮膠DNA ；
3:騾子皮膠DNA ；4:陰性對照)。
圖3是不同DNA濃度擴增電泳圖(M:DNA標記物；1:10ng/μ L ;2:5 ng/μ L ；3:
2.5 ng/ μ L ；4:1 ng/ μ L ；5:10_1 ng/ μ L ；6:1CT2 ng/ μ L:7:1CT3 ng/ μ L ；8:1CT4 ng/ μ L ；9:1CT5 ng/ μ L)。
圖4是對不同產(chǎn)家阿膠產(chǎn)品提取DNA進行PCR反應(yīng)獲得的擴增產(chǎn)物的電泳圖(M:DNA標記物；a:陽性對照；b:陰性對照；c:太極天膠；1:產(chǎn)家一 ；2:產(chǎn)家二 ；3:產(chǎn)家三；
4:產(chǎn)家四；5:產(chǎn)家五；6:產(chǎn)家六；7:產(chǎn)家七；8:產(chǎn)家八；9:產(chǎn)家九；10:產(chǎn)家十；11:產(chǎn)家
i^一)。
具體實施方式

以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。[0028]實施例1
1.材料和試劑
試劑:Taq預(yù)混酶Premix Ex-Taq Hot Start Version試劑盒、DNA標記物為分子量標準20bp DNA Ladder Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA熒光染料GelRedTMNuleic Acid Gel Stain IOOOOXin water 購自 Biotium 公司(Cat.N0.41003);丙烯酸胺和N，N-甲叉雙丙烯酰胺購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；5XTBE緩沖液、上樣緩沖液6XGlycerol DNA Loading Buffer夠自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
材料:馬皮膠、驢皮膠和騾皮膠分別由馬皮、驢皮和騾子皮煮制獲得。
2.檢測方法
取馬皮膠、驢皮膠和騾皮膠分別提取DNA，得檢測用的DNA提取液，稀釋至濃度為0.5 μ g/ μ L 10 μ g/ μ L,為DNA稀釋液，備用。由于驟為馬和驢后代，因此根據(jù)馬的基因序列(GenBank N0.NC_001640 )設(shè)計能夠特異擴增馬和騾子的線粒體DNA，但不能擴增驢的線粒體DNA的引物序列。根據(jù)序列比對和篩選獲得檢測引物如下:上游引物為 5’ -tccacctagctggggtgtcc-3’ (SEQ ID N0.1),下游引物為:5’-gatcccctcctcctgcgggg-3’ (SEQ ID N0.2)。
以馬皮膠提取的DNA為模板(終濃度為IOng/μ L)，SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示核苷酸序列為引物進行梯度PCR，梯度PCR的退火溫度設(shè)置45-58°C梯度，溫度分別為45 0C >45.6 0C >47.6 °C >50.1 °C >53.2 °C、55.8°C、57.3°C 和 58°C，PCR 擴增具體條件為:94 °C預(yù)變性 6 min ；94 °C變性 30 s，45 °C _58°C退火 30 s，72 °C延伸 30 s，35 個循環(huán)；然后在72 C后延伸7 min ;最后于4 C保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后,用8%的聚丙稀酸胺凝月父(PAGE)電泳檢測，取 2.5 μ L PCR 產(chǎn)物與 0.5 μ L 6Χ Glycerol DNA Loading Buffer 混合均勻，上樣后，100 V電泳40 min，取出凝膠，置于10 mL Gel Red溶液(45 mL蒸餾水，力口入 5 mL lmol/L NaCl 溶液，加 10 μ LGe I Red Nuleic Acid Gel Stain 10000 X in water混合均勻)中在搖床上振搖30 min后，用蒸餾水沖洗凝膠，置于凝膠成像儀下觀察，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在退火溫度為45°C-58°C范圍內(nèi)均能擴增出目的條帶，表明了此引物能夠適應(yīng)較寬的溫度范圍。
實施例2
以提取的馬皮膠、驢皮膠和騾皮膠分別提取DNA為模板(終濃度為IOng/ μ L)，SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示核苷酸序列為引物進行PCR擴增。上、下游引物均用無菌水稀釋至100 μ Μ,分裝為5 μ L/管,于-20 °C保存,用之前稀釋至10 μ M。加樣前將上、下游引物制成混合液，具體為4 μ L 10 μ M上游引物和4 μ L 10 μ M下游引物,加入52 μ L無菌水，混勻。PCR反應(yīng)體系為10 μ L,具體加樣情況如下:Premix Εχ-Taq Hot StartVersion:2.5 μ L，引物混合液:1.5 μ L，提取DNA稀釋液I μ L。PCR擴增條件為:94 V預(yù)變性6 min ；94 °C變性30 s，45 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，35個循環(huán)；然后在72 V后延伸7 min ;最后于4 C保存。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，用8%的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳檢測，取2.5 μ L PCR產(chǎn)物與 0.5 μ L 6X Glycerol DNA Loading Buffer 混合均勻，上樣后，100 V 電泳 40 min,取出凝膠，置于10 mL Gel Red溶液(45 mL蒸懼水,加入5 mL lmol/L NaCl溶液,加10μ LGe I Red Nuleic Acid Gel Stain 10000 X in water 混合均勻)中在搖床上振搖 30 min后，用蒸餾水沖洗凝膠，置于凝膠成像儀下觀察，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，泳道I和泳道3有兩條帶(命長片段為I號條帶，短片段為II號條帶)，泳道I和泳道3分別為馬皮膠和騾皮膠的PCR擴增產(chǎn)物，為陽性。泳道2號為驢皮膠的PCR擴增產(chǎn)物，未見條帶，因此為陰性；泳道4為陰性對照(以蒸餾水為模板)。
由PCR檢測結(jié)果可知，SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2能夠特異擴增馬皮膠和騾皮膠的線粒體DNA，而不能擴增驢皮膠的線粒體DNA，因此可以用此引物檢測中藥阿膠中是否摻雜有馬皮和騾子皮。
將擴增獲得I號條帶和II號條帶，切膠回收，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司，測序結(jié)果表明，I號條帶含有234bp的核苷酸序列，序列如SEQ ID N0.3所示。II號條帶長度為120-130bp的核苷酸序列，其測序結(jié)果表明為混合物，該條帶為非特異性擴增條帶，因此只要電泳檢測結(jié)果出現(xiàn)I號條則為陽性。
實施例3
以馬皮膠提取的DNA為模板，終濃度分別為lOng/yLj ng/yL,2.5 ng/yLUng/ μ LUCT1 ng/ μ L、1CT2 ng/ μ L、1CT3 ng/ μ L、1CT4 ng/ μ L和 ICT5 ng/ μ L,將 PCR 的退火溫度設(shè)置為45°C，其余條 件同實施例2，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用8%的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳檢測，取2.5 μ L PCR產(chǎn)物與0.5 μ L 6Χ Glycerol DNA Loading Buffer混合均勻，上樣后，100 V電泳40 min，取出凝膠，置于10 mL Gel Red溶液(45 mL蒸餾水，加入 5 mL lmol/L NaCl 溶液，加 10 μ LGe I Red Nuleic Acid Gel Stain 10000 X in water混合均勻)中在搖床上振搖30 min后，用蒸餾水沖洗凝膠，置于凝膠成像儀下觀察，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在DNA模板的濃度大于10_2 ng/yL都能檢測到，表明該引物用于檢測靈敏度高。
實施例4
1.材料和試劑
材料:取市售12個阿膠商品(其中一個樣品為重慶太極實業(yè)(集團)股份有限公司生產(chǎn)的太極天膠)，分別提取DNA后，稀釋5倍得DNA稀釋液(均稀釋5倍)。
本實施例中試劑的購買途徑與實施例1相同。
2.檢測方法
取12個阿膠商品的DNA液稀釋為模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列為引物，進行PCR擴增。引物稀釋、加樣體系和PCR擴增條件同實施例1。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，用8 %的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳檢測，2.5 μ L PCR產(chǎn)物與 0.5 μ L 6X Glycerol DNA Loading Buffer 混合均勻，上樣后，100 V 電泳 40 min,取出凝膠，置于10 mL Gel Red溶液(45 mL蒸懼水,加入5 mL lmol/L NaCl溶液,加10 μ LGelRedTM Nuleic Acid Gel Stain 10000 X in water 混合均勻)中在搖床上振搖 30 min后，用蒸餾水沖洗凝膠，置于凝膠成像儀下觀察PCR產(chǎn)物的情況，如果結(jié)果呈陰性，為正品阿膠，結(jié)果呈陽性，表明阿膠中摻雜有馬皮膠和騾皮膠。
結(jié)果如圖4所示。由圖4 (A和B)可知，除太極天膠外，市售的阿膠產(chǎn)品中均呈陽性，表明市售的阿膠產(chǎn)品中含有馬皮膠或騾皮膠。
利用本發(fā)明公開的以馬的保守序列設(shè)計特異引物，通過PCR的方法能夠檢測出阿膠是否由馬皮膠或騾皮膠，或者添加有馬皮膠或騾皮膠，因此能夠鑒別阿膠中是否摻雜有親源性近的動物皮，能夠鑒別阿膠的真?zhèn)巍?br>最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變， 而不偏離所附權(quán)利要求
書所限定的本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.鑒定阿膠真?zhèn)蔚囊?，所述引物由上游引物和下游引物組成，其特征在于:所述上游引物為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，所述下游引物為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求
1所述引物的PCR檢測試劑盒。
3.鑒定阿膠真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于，包括如下步驟: a.取阿膠樣品，提取DNA，備用； b.根據(jù)馬線粒體DNA序列設(shè)計上游引物和下游引物，然后以步驟a制備的DNA為模板進行PCR擴增，得PCR擴增產(chǎn)物；所述上游引物為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，所述下游引物為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列； c.將步驟b所得PCR擴增產(chǎn)物進行電泳鑒定，如果PCR擴增產(chǎn)物呈陽性，表明阿膠含有近親源性動物皮。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于:所述步驟c中，所述近親源性動物皮為馬皮或騾子皮。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3-4任一項所述的方法，其特征在于:所述步驟b中，所述PCR擴增的退火溫度為45-58 °C。
6.根據(jù)權(quán)利 要求5所述的方法，其特征在于:所述PCR擴增的條件為:94°C預(yù)變性6min ；94 °C變性30 s，45_58°C退火30 S，72 °C延伸30 S，35個循環(huán)；然后在72 °C后延伸7 min。
專利摘要
本發(fā)明公開了鑒定阿膠真?zhèn)蔚囊铮唧w鑒定阿膠中是否摻雜近親源性動物皮，引物由上游引物和下游引物組成，上游引物如SEQIDNO.1所示核苷酸序列，下游引物如SEQIDNO.2所示核苷酸序列；該引物特異性好，靈敏度高，并且能適應(yīng)較寬的溫度范圍，該引物能夠鑒定阿膠中是否摻雜有近親源性動物皮，如馬皮和騾皮，方法簡單，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/11GKCN102747167 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201210271014
公開日2013年8月28日 申請日期2012年7月31日
發(fā)明者趙潔, 左華麗, 白禮西 申請人:重慶太極實業(yè)(集團)股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3),