專(zhuān)利名稱(chēng):細(xì)胞色素p450bm-3(d168l/e435t)變體酶及其編碼基因和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種變體酶，尤其涉及ー種細(xì)胞色素P450BM-3(D168L/E435T)變體酶及其編碼基因和用途。
背景技術(shù)：
靛藍(lán)是ー種具有悠久歷史的天然染料，無(wú)論是古埃及木乃伊穿著的ー些服裝，還是我國(guó)馬王堆漢墓出土的藍(lán)色麻織物，它們的顔色都來(lái)自靛藍(lán)。靛藍(lán)之所以得到人們長(zhǎng)期、 廣泛的青睞，最關(guān)鍵的一點(diǎn)在于它具有其它染料無(wú)法比擬的染著牢固度和耐光堅(jiān)牢度，因此，靛藍(lán)也被稱(chēng)為“染料之王”。
在遠(yuǎn)古時(shí)代，靛藍(lán)主要從含有靛藍(lán)的植物(如菘藍(lán)、寥藍(lán)、木藍(lán)等)中獲得。到了19世紀(jì)中葉，由于天然靛藍(lán)的生產(chǎn)無(wú)法滿(mǎn)足紡織エ業(yè)迅猛發(fā)展的需求，人們開(kāi)始嘗試采用化學(xué)方法合成靛藍(lán)。1897年，德國(guó)巴斯夫生產(chǎn)的合成靛藍(lán)問(wèn)世，并以生產(chǎn)簡(jiǎn)便、原料充足、純度高、易貯運(yùn)、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，得以迅速普及，最終使得應(yīng)用了幾千年歷史的植物靛藍(lán)黯然失色，于20世紀(jì)60年代退出了歷史舞臺(tái)。20世紀(jì)80年代后，隨著社會(huì)文明程度的提高和環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，天然靛藍(lán)重新獲得了人們的關(guān)注和重視。
采用化學(xué)方法合成靛藍(lán)吋，需要使用對(duì)呼吸道、中樞神經(jīng)及肝臟均有毒害、可導(dǎo)致人體中毒的苯胺和鄰苯ニ甲酸酐。這不僅影響了所合成的靛藍(lán)的安全性，而且也對(duì)環(huán)境具有污染。由于而今不可能再大量種植與糧食作物爭(zhēng)地的產(chǎn)靛藍(lán)植物，人們把生產(chǎn)天然靛藍(lán)的希望寄托于靛藍(lán)的生物制備技術(shù)，試圖通過(guò)那些能催化吲哚轉(zhuǎn)化為靛藍(lán)的生物催化劑實(shí)現(xiàn)靛藍(lán)的緑色制備。利用生物催化劑進(jìn)行靛藍(lán)的生物制備具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)條件溫和、能耗低、產(chǎn)生的有害廢物少、產(chǎn)品安全等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)保護(hù)環(huán)境、維持生態(tài)平衡等具有明顯優(yōu)勢(shì)，所以，生物法生產(chǎn)靛藍(lán)取代靛藍(lán)的化學(xué)合成得到了很多研究者的認(rèn)同和重視。
目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一系列能催化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)的生物催化劑，其中最受關(guān)注的是一種細(xì)胞色素P450BM-3酶。在P450酶系中，細(xì)胞色素P450BM-3酶是從巨大芽孢桿菌(B. megaterium)中發(fā)現(xiàn)的具有中長(zhǎng)鏈脂肪酸羥基化活性的P450酶，在NADPH和分子氧的存在條件下，可以迅速催化鏈長(zhǎng)為C12 C18的飽和脂肪酸末位羥基化，將單個(gè)氧插入到不活潑的碳?xì)滏I中。
2000年，德國(guó)斯圖加特大學(xué)技術(shù)生化研究所R. D. Schmid領(lǐng)導(dǎo)的科研小組，通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)獲得了具有三個(gè)突變位點(diǎn)、能夠催化吲哚生成靛藍(lán)的細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶，這使細(xì)胞色素P450 BM-3酶第一次獲得了催化靛藍(lán)產(chǎn)生的能力(“Directed evolution of the fatty-acid hydroxylase P450 BM-3 into anindoIe-hydroxylating catalyst，，Chemistry-A European Journal,Li Q S,SchwanebergU，F(xiàn)ischer P，Schmid R D. 2000,6 :1531 1536)。但是，該變體酶催化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)的活カ還較低，因此有必要通過(guò)進(jìn)一歩的蛋白質(zhì)改造，提高細(xì)胞色素P450BM-3酶對(duì)吲哚的親和力和催化活力，提高靛藍(lán)生物制備的效率。[0007]公開(kāi)號(hào)分別為“CN1900285A”、“CN 1900286A”、“CN 1900287A”的中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)了三種細(xì)胞色素P450BM-3酶的變體基因，該三種變體基因分別將第168位天冬氨酸的密碼子突變?yōu)榻M氨酸的密碼子、將168位天冬氨酸的密碼子突變?yōu)榱涟彼岬拿艽a子、將435位谷氨酸的密碼子突變?yōu)樘K氨酸的密碼子，該三種變體基因編碼的細(xì)胞色素P450BM-3酶與底物親和能力較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞色素P450BM-3變體酶，解決了傳統(tǒng)變體酶與底物親和カ較小，催化吲哚生產(chǎn)靛藍(lán)的效率較小的問(wèn)題。
一種細(xì)胞色素P450BM-3變體酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，命名為細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶，本發(fā)明簡(jiǎn)寫(xiě)為細(xì)胞色素P450BM-3 (D168L/E435T)變體酶。本發(fā)明通過(guò)定點(diǎn)突變，在細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶基礎(chǔ)上引入了兩個(gè)突變位點(diǎn)，即168位點(diǎn)由天冬氨酸(D)突變?yōu)榱涟彼?L)，435位點(diǎn)由谷氨酸(E)突變?yōu)樘K氨酸⑴。
本發(fā)明還提供了一種編碼所述細(xì)胞色素P450BM-3變體酶的基因，其堿基序列可以如SEQ ID NO. 2所示。
所述基因通過(guò)如下方法獲得
首先，本發(fā)明根據(jù)細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶基因的血紅素域部分設(shè)計(jì)兩對(duì)定點(diǎn)突變引物，以質(zhì)粒pET-28a(+)-P450 BM-3 (F87V/A74G/L188Q)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后，用Dpn I消化模板質(zhì)粒，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli)BL21中，篩選獲得突變體；
抽取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序可知，細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶基因上的編碼第168位氨基酸的堿基由“ GAT”突變?yōu)椤癈TG”，編碼第435位氨基酸的堿基由“ GAA”突變?yōu)?“ACG”，同時(shí)該質(zhì)粒命名為質(zhì)粒 pET-28a+P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)。該突變位置序號(hào)為蛋白不包括起始密碼子編碼氨基酸的順序號(hào)。
本發(fā)明又提供了包含所述基因的表達(dá)盒、重組載體以及轉(zhuǎn)化子。
所述重組載體的原始載體為pET-28a (+)、pET_29、pET_30、pET-34 或 pRSET。
所述轉(zhuǎn)化子的宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E. coli)BL21、大腸桿菌(E. coli)BLR、大腸桿菌(E. coli)Origami、大腸桿菌(E. coli)NovaBlue 或大腸桿菌(E. coli)Rosetta。
本發(fā)明提供了所述細(xì)胞色素P450BM-3變體酶在催化吲哚轉(zhuǎn)化生成靛藍(lán)中的應(yīng)用。
本發(fā)明所變體酶的酶學(xué)參數(shù)較父本細(xì)胞色素P450 BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶有顯著改善，轉(zhuǎn)化數(shù)(Kcat)相對(duì)父本提高了 7. 0倍，Km值由父本的2. 09mM降低至I. 72mM,使得催化效率(KMt/KM)提高了 8. 5倍，說(shuō)明本發(fā)明變體酶對(duì)底物吲哚的親和カ明顯提高，對(duì)吲哚具有更高的催化活力。
具體實(shí)施方式
一、質(zhì)粒 pET-28a (+) -P450BM-3 (F87V/A74G/L 188Q)[0021]本發(fā)明所使用的質(zhì)粒pET-28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)由德國(guó)斯圖加特大學(xué)R. D. Schmid教授惠贈(zèng)，它是將細(xì)胞色素P450 BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶基因插入原始載體pET-28a (+)的啟動(dòng)子下游制得，其中突變基因的序列和重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)已記載在中國(guó)專(zhuān)利 00810943. 5、中國(guó)專(zhuān)利 200610052588. 0 和文獻(xiàn)(“Directed Evolution ofthe Fatty-Acid Hydroxylase P450 BM-3 into an Indole-Hydroxylating Catalyst.Chemistry-A European Journal. 2000,6 (9) :153ト 1536”)中。重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法可以參考現(xiàn)有的一般質(zhì)粒構(gòu)建方法，利用該質(zhì)粒的目的是為了得到細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶基因，對(duì)載體無(wú)特異性要求。
ニ、定點(diǎn)突變PCR引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得
根據(jù)細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶基因的血紅素域部分設(shè)計(jì)如下兩對(duì)定點(diǎn)突變引物，分別在基因第168位點(diǎn)引入亮氨酸突變，在第435位定點(diǎn)引入蘇氨酸突變 第一對(duì)引物
上游引物5’-TTTTACCGACTGCAGCCTCATCC-3’
下游引物5，-GAGGCTGCAGTCGGTAAAAGCTG-3，
第二對(duì)引物
上游引物5’-CGAGCTGGATATTAAAACGACTTTAACG-3’
下游引物5，-CGTTAAAGTCGTTTTAATATCCAGCTCG-3，
PCR反應(yīng)體系為50 ill :
即向250 ii I的eppendorf管中加入IOOpmol的dNTPs,各15pmol的上游引物和下游引物，大約 2ng 的模板質(zhì)粒 pET-28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)，2. 5U 高保真 pfu聚合酶，終濃度7mM的MgCl2溶液，Pfu緩沖液5 ill，最后用無(wú)菌蒸餾水加至總體積50 yl。
PCR 程序?yàn)?br>95°C預(yù)變性2min后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，即在95°C變性30s，57°C退火30s，72 °C延長(zhǎng)5min，共循環(huán)20次，然后72°C延伸5min，得到定點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物。
三、突變文庫(kù)的構(gòu)建
將上述獲得的定點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)Dpn I消化模板基因，獲得突變基因文庫(kù)；將所獲突變基因文庫(kù)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E. coli)BL21化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含有50ng/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)得到相應(yīng)的突變體庫(kù)。
四、突變體文庫(kù)的篩選及質(zhì)粒測(cè)序
從平板上挑取單菌落，接種于5ml含50ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)過(guò)夜，然后按UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒的使用說(shuō)明提取和純化目標(biāo)質(zhì)粒。
結(jié)果從待測(cè)基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)突變基因，該基因編碼第168位氨基酸殘基的密碼子由編碼天冬氨酸(GAT)突變?yōu)榫幋a亮氨酸(CTT)，第435位氨基酸殘基的密碼子由編碼谷氨酸(GAA)突變?yōu)榫幋a蘇氨酸(ACG)，因此該基因編碼的細(xì)胞色素P450BM-3酶為五位點(diǎn)突變酶細(xì)胞色素 P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶。
五、細(xì)胞色素P450BM-3變體酶的分離純化
將攜帶有細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶基因的大腸桿菌(E. coli)BL21接種到5ml含50ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)過(guò)夜；
取上述過(guò)夜培養(yǎng)物接種到IOOml新鮮的含50ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，接種量為2%，于溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為180rpm條件下培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6 0. 8時(shí)，加入終濃度0. 5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，繼續(xù)誘導(dǎo)8小時(shí)后結(jié)束誘導(dǎo)；
將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)液于轉(zhuǎn)速為5000rpm離心IOmin,棄去上清,菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌2遍，在冰浴條件下超聲破胞，破胞條件為功率300瓦，3s工作，6s間歇，90個(gè)循環(huán)；超聲破胞后的破胞液在轉(zhuǎn)速為15000rpm，溫度為4°C下離心30min，上清即為粗酶液。
粗酶液用金屬螯合親和層析(IMAC)純化，其中金屬螯合介質(zhì)為Ni-NTA介質(zhì)，純化所得酶在去除咪唑之后，可以進(jìn)行比活力測(cè)定及酶學(xué)參數(shù)的測(cè)定。
父本細(xì)胞色素P450 BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶的制備方法同上，區(qū)別在于采 用攜帶質(zhì)粒pET-28a(+)-P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)的大腸桿菌(E. coli)BL21 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
六、催化吲哚生成靛藍(lán)比活力及酶學(xué)參數(shù)的測(cè)定
比活力定義為毎分鐘每納摩蛋白催化底物吲哚所得到靛藍(lán)的量，單位為U mol靛藍(lán) /(nmol 蛋白 min)。
測(cè)定方法于Iml的IOOmM pH8. 2的Tris-Cl反應(yīng)體系中加入Inmol的純酶、終濃度5mM的吲哚，置于37°C保溫IOmin后，加入0. 4mg NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)于溫度為37°C水浴，轉(zhuǎn)速為150rpm避光條件下進(jìn)行，反應(yīng)IOmin后立即取出，迅速加入6M KOH終止反應(yīng)，于分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)為670nm下的光吸收值即為靛藍(lán)的光吸收情況，井根據(jù)靛藍(lán)摩爾消光系數(shù)e = 3900M^ CnT1計(jì)算出靛藍(lán)的濃度。
由此計(jì)算出的細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶對(duì)靛藍(lán)的比活力為21. 7 ii mo V (nmol ^min)，父本細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶對(duì)靛藍(lán)的比活力為2. 8 ii mol/(nmol min),比活力提高7. 0倍。
其他酶學(xué)參數(shù)通過(guò)對(duì)酶動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定獲得，反應(yīng)條件為于Iml的IOOmMpH8. 2的Tris-Cl反應(yīng)體系中加入Inmol的純酶、終濃度I 8mM的吲哚，置于37°C保溫lOmin，加入0. 4mg NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)在溫度為37°C水浴，轉(zhuǎn)速為150rpm避光條件下進(jìn)行，反應(yīng)IOmin后立即取出，迅速加入6M KOH終止反應(yīng)，于分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)為670nm處的光吸收值即為靛藍(lán)的光吸收情況，根據(jù)靛藍(lán)摩爾消光系數(shù)e = 3900M—1 ^nT1計(jì)算出靛藍(lán)的濃度。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)
(I)細(xì)胞色素 P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶對(duì)靛藍(lán)的 Km 值為
I.72mM，顯著低于父本細(xì)胞色素P450BM-3 (F87V/A74G/L188Q)變體酶的2. 09mM，表明本發(fā)明變體酶對(duì)底物具有更高的親和カ。
(2)細(xì)胞色素 P450BM_3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T)變體酶的轉(zhuǎn)化數(shù)(Kcat)為 28. ISmirT1,是父本(4. (MmirT1)的 7. 0 倍。
(3)本發(fā)明變體酶的催化效率(Keat/KM)為16. 37mM^ mirT1，是父本(I. 93mM 1 min 的 8. 5 倍。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞色素P450 BM-3變體酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—種編碼權(quán)利要求
I所述細(xì)胞色素P450BM-3變體酶的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述基因，其特征在于，堿基序列如SEQID NO. 2所示。
4.一種包含如權(quán)利要求
2或3所述基因的表達(dá)盒。
5.一種包含如權(quán)利要求
2或3所述基因的重組載體。
6.如權(quán)利要求
5所述的重組載體，其特征在于，原始載體為pET-28a(+)、pET-29、pET-30、pET-34 或pRSET。
7.一種包含如權(quán)利要求
2或3所述基因的轉(zhuǎn)化子。
8.如權(quán)利要求
7所述的轉(zhuǎn)化子，其特征在于，宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E.coli)BL21、大腸桿菌(E. coli)BLR、大腸桿菌(E. coli)Origami、大腸桿菌(E. coli)NovaBlue或大腸桿菌(E. coli)Rosetta。
9.如權(quán)利要求
I所述的細(xì)胞色素P450BM-3變體酶在催化吲哚生成靛藍(lán)中的應(yīng)用。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞色素P450BM-3(D168L/E435T)變體酶及其編碼基因和用途，該變體酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，它在細(xì)胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)變體酶基礎(chǔ)上增加了兩個(gè)突變位點(diǎn)，即第168位的天冬氨酸(GAT)突變?yōu)榱涟彼?CTT)，第435位的谷氨酸(GAA)突變?yōu)樘K氨酸(ACG)。與父本相比較，本發(fā)明變體酶具有與底物更大的親和力，催化吲哚生成靛藍(lán)的效率更高。
文檔編號(hào)C12N1/21GKCN102757944SQ201210256860
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年7月24日
發(fā)明者張澎湃, 梅樂(lè)和, 胡升, 胡桂香, 雷引林 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan