專利名稱:一種編碼β-葡萄糖苷酶的基因及應用的制作方法
—種編碼β-葡萄糖苷酶的基因及應用技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及從未培養(yǎng)微生物中克隆的酶基因，尤其涉及通過構(gòu)建芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物的宏基因組DNA文庫而篩選得到的酶基因。
背景技術(shù)：
[0002]纖維素是地球上豐富且可再生的生物聚合物。由于其結(jié)構(gòu)復雜，所以纖維素降解過程依靠復雜的多酶體系即內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶與β -葡萄糖苷酶三種酶的協(xié)同作用才能完成，其中β_葡萄糖苷酶是此過程的限速酶。[0003]葡萄糖苷酶在自然界的分布較為廣泛。目前針對微生物中的葡萄糖苷酶的研究文獻主要集中在酵母、真菌、細菌中。夏永振應用表面表達技術(shù)將來自Trichoderma reesei的β -葡萄糖苷酶在釀酒酵母表面進行表達，并研究其酶學性質(zhì)，實驗結(jié)果表明酵母表面表達的酶有活性，產(chǎn)酶的最佳誘導時間為24 h,最適溫度是70°C。Shipkowski和 Brenchley在Paenibacillus sp. strain C7中發(fā)現(xiàn)一種耐低溫的β -葡萄糖苷酶,該酶屬于糖苷水解酶家族 3 (Shipkowski et al. , 2005)。Brunner 等從致病疫霉 Phytophthora infestans中獲得的基因bgxl,編碼一個具有木糖酶/ β -葡萄糖苷酶的雙功能酶。[0004]公開號為CN1778907的中國專利介紹了一種β -葡萄糖苷酶及其編碼基因與應用，公開了一種β_葡萄糖苷酶及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的β_葡萄糖苷酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID NO 2 ；2)將序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有 β_葡萄糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的β_葡萄糖苷酶及其編碼基因在纖維素的降解中具有廣泛的用途。[0005]公開號為CN1786171的中國專利介紹了一種嗜熱堿性β _葡萄糖苷酶及其編碼基因，涉及一種葡萄糖苷酶及其編碼基因。該酶具有在高溫、堿性條件下保持較高酶活性的特點，其最適反應溫度約為70°C，最適反應pH值約為8.0，該酶能催化水解β-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖，在食品、醫(yī)藥、紡織、能源等方面具有重要的應用價值。[0006]公開號為CN101050447的中國專利介紹了一種β _葡萄糖苷酶基因工程菌及其應用，公開了一種β-葡萄糖苷酶基因工程菌——大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No. 1626，以及該菌種在制備有效霉亞基胺A化合物中的應用。利用該工程菌轉(zhuǎn)化有效霉素 A可得到有效霉亞基胺A產(chǎn)物，具有轉(zhuǎn)化效率高、成本較低、反應條件溫和、產(chǎn)物純度高、分離純化容易、化學污染少等優(yōu)點。[0007]公開號為CN102268421A的中國專利介紹了一種β -葡萄糖苷酶基因的克隆、表達及應用，具體涉及一種能夠分解乳糖的在高溫和低溫條件下都具備很強活性的β-葡萄糖苷酶，并能夠高效表達的分泌型β_葡萄糖苷酶的基因工程菌。本發(fā)明公開了一種具有如 SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的β -葡萄糖苷酶，并構(gòu)建出能高效分泌所述β -葡萄糖苷酶的基因工程菌，并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCCNo. 4891。本發(fā)明所述方法生產(chǎn)的β _葡萄糖苷酶具有很強的半乳糖苷酶的活性，可應用于乳品工業(yè)，同時被發(fā)明所述的β_葡萄糖苷酶在較大的PH值范圍及溫度范圍內(nèi)具有穩(wěn)定的活性。[0008]公開號為CN102358898A的中國專利介紹了一種中溫β -葡萄糖苷酶BglAl及其基因和應用，涉及一種中溫葡萄糖苷酶BglAl及其基因和應用。本發(fā)明提供了一種新的中溫葡萄糖苷酶BglAl，其具有如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列，且本發(fā)明還提供了編碼上述中溫β-葡萄糖苷酶BglAl的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應用。本發(fā)明提供的中溫β_葡萄糖苷酶BglAl最適pH 為6. 0，在pH 5. O 7. O都有較高的酶活性。最適溫度為50°C，其耐熱特性好，可使其在需求耐熱環(huán)境的工業(yè)生產(chǎn)上應用。[0009]公開號為CN102399803A的中國專利介紹了一種改進的β -葡萄糖苷酶基因及其重組酶的制備，改進的β-葡萄糖苷酶基因及其重組酶的制備，改進的β-葡萄糖苷酶基因核苷酸序列bglll如SEQIDN0. I所述。本發(fā)明同時提供了以基礎鹽為培養(yǎng)基的該重組菌表達β_葡萄糖苷酶的方法。通過對基因的人工進化和高密度發(fā)酵，改造后的黑曲霉β_葡萄糖苷酶基因bglll在畢氏酵母中的表達量較原始基因bgll提高了 36倍。本發(fā)明可用于 β-葡萄糖苷酶基因的分子改造及其重組畢赤酵母基因工程菌的高密度發(fā)酵，能顯著提高 β-葡萄糖苷酶的表達水平。[0010]公開號為CN102492710A的中國專利介紹了一種β -葡萄糖苷酶Cellb及其表達基因與應用，涉及β_葡萄糖苷酶Cellb及其表達基因與應用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明提供一種表達β -葡萄糖苷酶Cellb的基因cellb，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；本發(fā)明還提供一種葡萄糖苷酶Cellb，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本發(fā)明中的β -葡萄糖苷酶Cellb可以用于工業(yè)上合成價格昂貴的纖維寡糖，進而應用于研究纖維素酶水解機理、微生物對纖維素的利用過程等。另外這種體外生物法合成的纖維寡糖可作為功能性食品或食品添加劑，也可作為糖尿病患者的甜味劑，還可以應用于化妝品工業(yè)和制藥工業(yè)，其應用前景廣闊。[0011]公開號為CN1500872的中國專利介紹了一種高溫β-葡萄糖苷酶、其編碼基因及其用途，由嗜熱菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4總DNA獲得高溫β -葡萄糖苷酶基因(β-glucosidase gene),構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達β _葡萄糖苷酶。通過氨基酸序列比較，該酶為一新型葡萄糖苷酶。[0012]公開號為CN101100659的中國專利介紹了一種β -葡萄糖苷酶及其編碼基因與應用，公開了一種β_葡萄糖苷酶及其編碼基因與應用。該β_葡萄糖苷酶，是如下(a)或 (b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β _葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。在以纖維素為原料生產(chǎn)燃料酒精的同步糖化共發(fā)酵工藝中的發(fā)酵微生物酵母菌最適發(fā)酵條件下，該酶具有較高的酶活，可以應用于該工藝中以生產(chǎn)燃料酒精。[0013]公開號為CN101363026的中國專利介紹了一種編碼β _葡萄糖苷酶的基因，提供了一種編碼β_葡萄糖苷酶的基因，名稱為UnbgllB，它通過構(gòu)建堿性污染土壤未培養(yǎng)微生物的宏基因組DNA文庫和文庫克隆的β-葡萄糖苷酶活性檢測篩選法獲得，是下列核苷酸序列之一 1)序列表中序列I的DNA序列及其部分序列；2)與序列表中序列I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。序列表中序列I的DNA是克隆載體pGEM_3Zf(+)部分DNA序列和克隆在該載體上的外源未培養(yǎng)微生物的DNA，該外源DNA片段由838個堿基組成，該基因的GC含量為54.3%。該基因用于生產(chǎn)β_葡萄糖苷酶，以將纖維二糖解離成單個葡萄糖分子。
公開號為CN1014 18306的中國專利介紹了一種耐高溫β-葡萄糖苷酶基因在植物基因轉(zhuǎn)化中的應用，涉及一種通過基因體外定向分子進化和定點突變相結(jié)合獲得的耐高溫β_葡萄糖苷酶基因在植物基因轉(zhuǎn)化中作為報告基因的應用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明公開了該耐高溫β_葡萄糖苷酶基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化中使用方法和效果。耐高溫的β -葡萄糖苷酶基因可免除轉(zhuǎn)基因生物體中內(nèi)源背景的干擾，增加轉(zhuǎn)基因檢測的可靠性，使用耐高溫β_葡萄糖苷酸酶還將明顯提高轉(zhuǎn)基因檢測的靈敏度，使時空特異、生物或非生物環(huán)境誘導的表達調(diào)控研究結(jié)果差異更大、數(shù)據(jù)更準確，并且將大大降低底物的用量，降低檢測成本。
公開號為CN101492661的中國專利介紹了一種β -葡萄糖苷酶基因的克隆、表達及用于龍膽低聚糖的制備，一種β_葡萄糖苷酶基因的克隆、表達及用于龍膽低聚糖的制備，屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明由黑曲霉WX-07總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成β-葡萄糖苷酶基因(bgl)SEQ ID N0:1，bgl的cDNA以質(zhì)粒pPIC9K為表達載體，以畢赤酵母(P. pastoris)為表達宿主，實現(xiàn)bgl基因在胞外的可溶性表達；bgl的cDNA全長2523個核苷酸，編碼841個氨基酸，構(gòu)建的bgl/pPIC9K轉(zhuǎn)化P.pastoris KM71可表達BGL酶。BGL酶具有轉(zhuǎn)糖苷活性，能將葡萄糖轉(zhuǎn)糖苷生成龍膽低聚糖。優(yōu)化酶法制備龍膽低聚糖的工藝，并利用陽離子樹脂進行分離精制，達到較好效果。制得的龍膽低聚糖產(chǎn)品作為功能性食品配料，具有低熱量，低齲齒，整腸等生理功能。本發(fā)明為龍膽低聚糖的制備提供了具有商業(yè)化價值的新途徑。
公開號為CN101880680A的中國專利介紹了一種編碼β -葡萄糖苷酶的基因及其應用，一種編碼葡萄糖苷酶的基因bgl，含有SEQ ID NO: I的核苷酸序列或其功能等同變異體。本發(fā)明含涉及該基因或其功能等同變異體編碼的葡萄糖苷酶(SEQ ID Ν02)及該酶在降解纖維素中的應用。
公開號為CN102477417A的中國專利介紹了一種β -葡萄糖苷酶及其編碼基因與應用，公開了一種β_葡萄糖苷酶及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的β_葡萄糖苷酶是如下I)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β_葡萄糖苷酶活性的由I)衍生的蛋白質(zhì)。實驗證明該重組酶在畢赤酵母中高效分泌表達高達190. 2U/mL，該重組酶最適pH和最適溫度分別為pH6. O和55 °C，具有較寬的底物作用范圍和良好的熱穩(wěn)定性，且可水解纖維多糖、大麥葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖。該重組酶具有一定的轉(zhuǎn)糖苷能力，利用纖維二糖為底物，可以生成纖維三糖、龍膽二糖等，在食品、飼料、生物化工及醫(yī)藥行業(yè)中具有很大的應用潛力。
公開號為CN102321647A的中國專利介紹了一種β-葡萄糖苷酶、編碼基因、載體、工程菌及其應用，公開了一種葡萄糖苷酶、編碼基因、載體、工程菌及葡萄糖苷酶水解虎杖苷制備白藜蘆醇的應用，所述β -葡萄糖苷酶基因具有與SEQ ID NO 2所示的多核苷酸序列70-100%的同源性，所述β-葡萄糖苷酶基因編碼的葡萄糖苷酶具有與SEQ ID NO :1所示氨基酸序列95% -100%的同源性；本發(fā)明β _葡萄糖苷酶能夠水解虎杖苷制備白藜蘆醇，環(huán)境友好，產(chǎn)率高，應用前景廣闊。
公開號為CN101845426A的中國專利介紹了一種黑翅土白蟻β-葡萄糖苷酶、編碼基因、載體及應用，提供了一種黑翅土白蟻葡萄糖苷酶、編碼基因、載體及應用。所述β-葡萄糖苷酶具有與SEQ ID NO :2所示多肽同源性95%以上的氨基酸序列。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種編碼黑翅土白蟻β_葡萄糖苷酶的基因，該基因可在宿主細胞中大量表達以生產(chǎn)該β_葡萄糖苷酶，用于纖維素的降解，經(jīng)檢測本發(fā)明β_葡萄糖苷酶酶活達117U。本發(fā)明所提供的β_葡萄糖苷酶及其編碼基因可應用于纖維素的降解。
而針對純培養(yǎng)技術(shù)未能涉及的另一巨大的微生物資源庫——未培養(yǎng)微生物，自從上世紀90年代末就吸引了越來越多研究者的目光。近年來通過宏基因組學技術(shù)，以獲得目的基因的方法已日趨成熟，在以草食性動物消化道系統(tǒng)未培養(yǎng)微生物為對象的研究中，新的有關(guān)纖維素降解功能基因的發(fā)現(xiàn)層出不窮。郭宏等構(gòu)建了水牛瘤胃總微生物的宏基因組文庫，篩選得到一個具有β_葡萄糖苷酶活性的克隆。馬淑華從兔盲腸微生物宏基因組文庫中得到一個具有葡萄糖苷酶，全長為282 bp的核苷酸序列編碼，其GC含量為60. 3%，編碼93個氨基酸。趙廣存通過構(gòu)建牛瘤胃宏基因組文庫，篩選得到10個具有β-葡萄糖苷酶活性以及10個具有β -I, 4-內(nèi)切葡聚糖酶活性的克隆。
本發(fā)明以芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物作為研究對象，因芒草莖桿中纖維素和半纖維的含量高達80%，故經(jīng)芒草馴養(yǎng)的牛瘤胃微生物具有更高的可獲得纖維素降解酶的潛力。通過對其瘤胃微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)，芒草馴養(yǎng)后牛瘤胃細菌中BacteiOidetes的比例從16. 33%提高到28. 15%，同時，在Firmicutes門，經(jīng)芒草馴養(yǎng)的牛瘤胃細菌文庫的比對信息中出現(xiàn)了 Ruminococcus fIavefaciens 和 Butyrivibrio fibrisolvens,這幾種細菌均是主要的纖維素降解菌，它們可以分泌大量的纖維素酶和半纖維素酶，促進宿主的食物消化和營養(yǎng)能量的吸收。我們進一步通過研究從芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物的宏基因組DNA文庫中發(fā)現(xiàn)了新的具有β -葡萄糖苷酶活性的基因，這將極大的促進纖維素資源的降解利用，對緩解世界范圍內(nèi)的能源緊張起到巨大的推動作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有高酶活力的葡萄糖苷酶基因·(Unglul35B12)，是通過構(gòu)建芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組DNA文庫和文庫克隆的β-葡萄糖苷酶活性檢測篩選法獲得，以此為β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)提供一條新的途徑和方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種編碼葡萄糖苷酶的基因，名稱為Unglul35B12，來源于芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物，是下列核苷酸序列之一
I)序列表中SEQ ID No: I的DNA序列及其部分序列；
2)與序列表中SEQ ID No: I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
序列表中SEQ ID No: I的DNA是克隆載體pUC19部分DNA序列和克隆在該載體上的外源未培養(yǎng)微生物的DNA，該外源DNA片段由3470個堿基組成，重組質(zhì)粒攜帶的外源DNA片段中包含完整的新基因Unglul35B12，該基因長2340 bp, GC含量為61. 15%。
序列從序列表中的SEQ ID No: I的DNA從5’端第700位核苷酸開始到3039位核苷酸結(jié)束，存在一個完整的開放閱讀框(ORF，Open Reading Frame)。其中，自5’端的第700位至702位核苷酸為Unglul35B12的起始密碼子ATG，自5’端的第3037位至3039位核苷酸為Unglul35B12的終止密碼子TAG。
開放閱讀框共2340個核苷酸，可編碼序列SEQ ID No:2中780個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
本發(fā)·明提供了一種葡萄糖苷酶的氨基酸序列，名稱為SEQ ID Νο:2，來源于芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物，是下列氨基酸序列之一
I)與序列表中SEQ ID No:2限定的氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列。
2)與序列表中SEQ ID No:3限定的氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列。
3)與序列表中SEQ ID Νο:4限定的氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種葡萄糖苷酶基因的克隆方法，包括以下步驟
(I)從芒草馴養(yǎng)牛瘤胃內(nèi)容物中直接提取未培養(yǎng)微生物的宏基因組DNA ；
(2)構(gòu)建芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組DNA文庫；
(3)從芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組DNA文庫中篩選表達β -葡萄糖苷酶的克??；
(4) β -葡萄糖苷酶基因的克隆及表達分析。
步驟⑴包括
(1-1)從芒草馴養(yǎng)牛瘤胃內(nèi)容物樣品中直接抽提宏基因組DNA;
(1-2)采取脈沖場電泳和電洗脫法回收純化粗制宏基因組DNA。
步驟⑵包括
(2-1)將回收的DNA連接到pcc2F0S vector上，包裝，轉(zhuǎn)導至ΕΡΙ300宿主細胞中，構(gòu)建成Fosmid文庫；
(2-2)檢測Fosmid文庫的覆蓋度
步驟(3)包括
(3-1)獲得具有β -葡萄糖苷酶活性的克??；
(3-2)酶切插入片段，回收1-5 kb長度的DNA片段；
(3-3)以pUC19為載體構(gòu)建亞克隆文庫，并用β _葡萄糖苷酶活性檢測篩選進行活性克隆的篩選。
步驟⑷包括
(4-1)獲得表達Unglul35B12基因的陽性克?。?br>(4-2)設計合適特異引物，用PCR的方法擴增Unglul35B12基因；
(4-3)用合適的限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物和表達載體pET28a(+)，酶切回收產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒PET135B12。
基因克隆的步驟還包括對重組質(zhì)粒pET135B12表達的β -葡萄糖苷酶基因進行測序和分析，對重組質(zhì)粒ΡΕΤ135Β12進行表達，對β -葡萄糖苷酶基因表達的蛋白質(zhì)Unglul35B12的氨基酸序列進行分析。并且初步進行了該β _葡萄糖苷酶酶學性質(zhì)的研究，包括溫度、pH對酶活力的影響。
在一個具體實施中，重組表達載體所用宿主細胞可以是重組表達載體中的任意一種。
在一個具體實施中，Unglul35B12基因可應用于纖維素降解生產(chǎn)方面。
本發(fā)明通過構(gòu)建芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組DNA文庫和文庫克隆的β -葡萄糖苷酶活性檢測篩選法，得到新的β -葡萄糖苷酶基因，可在宿主細胞中大量表達該基因以生產(chǎn)葡萄糖苷酶，酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)該葡萄糖苷酶對pH的適應范圍較寬，因此更利于工業(yè)生產(chǎn)過程的應用，為推動纖維素資源利用開辟了一條新的途徑。

圖I為從芒草馴養(yǎng)牛瘤胃內(nèi)容物樣品中直接提取未培養(yǎng)微生物的宏基因組DNA及電洗脫回收用于Fosmid文庫構(gòu)建的DNA，其中I :電洗脫回收的DNA ；2 :粗提DNA ；M =LambdaMix Marker 19。
圖2為芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組文庫克隆的限制性內(nèi)切酶EcoR I與Hind III酶切分析以判斷文庫質(zhì)量，其中 10 : λ/Hind III digestive marker ;1_9及11-17 :文庫克隆質(zhì)粒酶切譜帶。
圖3為芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組文庫克隆的篩選；
圖4為亞克隆文庫的篩選；
圖5為Unglul35B12基因DNA序列分析圖；
圖6為重組質(zhì)粒pET135B12經(jīng)EcoR I、Not I酶切帶型，其中M : λ/Hind IIIdigestive marker ；1 :空載體酶切譜帶；2 :重組質(zhì)粒pET135B12酶切譜帶。
圖7為驗證重組質(zhì)粒pET135B12攜帶的Unglul35B12基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliBL21后得到的轉(zhuǎn)化子依然具有β -葡萄糖苷酶活性；
圖8為溫度對該β -葡萄糖苷酶活力的影響；
圖9為pH對該β -葡萄糖苷酶活力的影響。
具體實施方式
本發(fā)明提供的一種編碼β -葡萄糖苷酶的基因，名稱為Unglul35B12，是下列核苷酸序列之一
I)序列表中序列I的DNA序列及其部分序列；
2)與序列表中序列I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
本發(fā)明提供的Unglul35B12基因是通過以下克隆方法的步驟獲得的
(I)從芒草馴養(yǎng)牛瘤胃內(nèi)容物中直接提取未培養(yǎng)微生物的宏基因組DNA ;
(2)構(gòu)建芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組DNA文庫；
(3)從芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組DNA文庫中篩選表達β-葡萄糖苷酶的克?。?br>(4) 葡萄糖苷酶基因的克隆及表達分析。
以下將通過實施例和附圖詳細解釋本發(fā)明的技術(shù)方案。在本發(fā)明實施例中所用到的主要材料包括限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III、T4 DNA連接酶、pMD_18 T載體、購自大連寶生物公司；Fosmid文庫構(gòu)建試劑盒、高拷貝誘導劑、Fosmid DNA提取試劑盒購自美國 Epicentre 公司；Lamb da Mix Marker 19 購自 Fermentas 公司。
實施例I、從芒草馴養(yǎng)牛瘤胃內(nèi)容物中直接提取微生物宏基因組DNA。
I)從_80°C冰箱取出50g/管樣品，室溫解凍，放入250 mL三角瓶，并加入50粒直徑50 mm的玻璃珠，向三角瓶中倒入已滅菌的磷酸緩沖液100 mL,200 rpm震蕩15 min,靜置I min，取懸浮液置于滅菌50 mL離心管中，500 g離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管，再次8000 g離心10 min，收集菌體，用此樣品進行總DNA的提取。2)向沉淀的菌體加入 6. 3 mL 提取緩沖液(Sodium Phosphate :100 mmol/L, pH8. 0 ；Tris-HCl 100 mmol/L, pH 8. 0 ；EDTA 100 mmol/L,pH 8. 0 ；NaCl: :1.5 mol/L ；CTAB 2%)，反復吹打充分懸浮菌體，加入2%酸洗PVPP，100 μ L溶菌酶(10 mg/mL)，充分渦旋；
3) 37 O 水浴 30 min ；
4)加入蛋白酶 K (20mg/mL) 50 μ L，37°C水浴 30 min ;
5)加入 0. 7 mL SDS (20%，w/v)，65°C水浴 90 min，每隔 10-15 min 顛倒一次；
6) 8000 g離心15 min,吸出上清液；
7)剩余沉淀再次加入2. 7 mL提取緩沖液和0.3 mL 20%的SDS，65°C水浴10 min ；
8) 8000 g離心15 min，吸出上清液與5中上清液合并；
9)加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)溶液，8000g離心15 min，吸出上層水相；
10)重復上個步驟；
11)向上清液加入0. 6倍體積的異丙醇，室溫放置I h ；
12)常溫下，12000 g 離心 20 min,收集 DNA ；
13) 75%乙醇溶液洗滌2遍，室溫晾干，加水溶解。
實施例2、采用脈沖場電泳和電洗脫法純化粗提宏基因組DNA
I)脈沖場電泳
①將DNA樣品制成低熔點瓊脂糖凝膠的包埋塊，4°C放置45 min方可上樣；
②脈沖場電泳凝膠的配置
a. I g瓊脂糖加入100 ml 0· 5XTBE，配置1%瓊脂糖凝膠；
b.徹底清洗制膠槽、梳子，吹干；
c.充分溶解瓊脂糖，冷卻至50°C左右，灌膠，插好梳子，室溫放置至少45 min可使用。
③封膠
將①中制備的包埋塊放入梳孔中，用少量的液態(tài)瓊脂糖封口，室溫放置5 min左右，即可開始電泳。
④電泳槽和恒溫系統(tǒng)的準備
a.向電泳槽中倒入2 L左右的0. 5 X TBE ；
b.打開低溫循環(huán)水浴，設定溫度12°C，待電泳槽內(nèi)緩沖液溫度保持在12°C即可開始電泳；
c.設定脈沖場電泳條件，時間15 h,脈沖范圍1-12 s,電壓4. 5 V/cm。
注意觀察整個電泳過程溫度必須維持在15°C以下。[0102]2)電洗脫純化DNA
a.取長 10-20 cm 長的透析袋，在 2% NaHCO3,1 mM EDTA (pH 8. O)溶液中煮沸 10min，蒸餾水徹底沖洗；再次于I mM EDTA溶液煮沸10 min,自然冷卻，浸泡于I mM EDTA溶液，4°C貯存，直至使用。使用前，取出透析袋用蒸餾水反復沖洗其內(nèi)外壁；
b.透析袋一端用透析袋夾封口，注滿I X TAE，將切下的膠條小心裝入上述處理好的透析袋中，擠出大部分緩沖液，但剩余液體要始終包圍凝膠塊，取另一透析袋夾夾緊，注意不要殘留氣泡；
c.透析袋置于電泳槽中，設置電壓為4 V/cm，時間3 h，使DNA結(jié)合在透析袋內(nèi)壁；倒轉(zhuǎn)電流電泳I min，DNA進入袋內(nèi)緩沖液。打開透析袋一端，吸出袋內(nèi)所有液體，轉(zhuǎn)移至一無菌離心管中，再次用緩沖液洗透析袋，收集到同一離心管中。
請參見圖1，其中泳道I是電洗脫回收的DNA，2為粗提宏基因組DNA，M為LambdaMix Marker 19。
實施例3、芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組文庫的構(gòu)建
選用Epicentre公司Fosmid文庫構(gòu)建試劑盒進行宏基因組文庫的構(gòu)建
I)宏基因組DNA的準備用I mL注射器反復吹吸純化好的高分子量DNA，將經(jīng)過注射器打斷20次，50次，100次的產(chǎn)物分別在O. 8%的瓊脂糖凝膠上電泳，與control DNA和Mix Marker進行比較,選取大小最接近40 kb的DNA進行文庫的構(gòu)建。
2)按照如下體系進行插入DNA的末端修復
權(quán)利要求
1.一種編碼β-葡萄糖苷酶的基因其核苷酸序列從序列表中的SEQID No: I的5’端第700位核苷酸開始到3039位核苷酸結(jié)束；其中，起始密碼子ATG為自5’端的第700位至702位核苷酸，終止密碼子TAG為自5’端的第3037位至3039位核苷酸；所述基因Unglul35B12的GC含量為61. 15%。
2.一種編碼葡萄糖苷酶基因，其特征在于為下述核苷酸序列之一的基因
(1)SEQ ID No: I ; (2)與SEQID No: I限定的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列； (3)在高嚴謹條件下可與SEQID No: I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列； (4)在高嚴謹條件下可與SEQID No: I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3.—種葡萄糖苷酶的氨基酸序列，其特征在于為下述氨基酸序列之一的氨基酸
(1)SEQ ID No: 3 或 SEQ ID No: 4 ; (2)與SEQID No: 3或SEQ ID No:4限定的氨基酸序列具有60%以上同源性的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I的方法，重組表達載體所用宿主細胞可以是重組表達載體中的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求
I的方法，基因可應用于纖維素降解生產(chǎn)方面。
專利摘要
本發(fā)明提供一種編碼β-葡萄糖苷酶的基因，名稱為Unglu135B12，是通過構(gòu)建芒草馴養(yǎng)牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組DNA文庫和文庫克隆的β-葡萄糖苷酶活性檢測篩選法獲得，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列及其部分序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。序列表中序列1的DNA是克隆載體pUC19部分DNA序列和克隆在該載體上的外源未培養(yǎng)微生物的DNA，該外源DNA片段由3470個堿基組成，包含基因Unglu135B12長2340bp，該基因的GC含量為61.15%。該基因用于生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶。本發(fā)明亦提供Unglu135B12編碼氨基酸序列1)序列表中序列2的氨基酸序列；2)與序列表中序列2限定的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列。該β-葡萄糖苷酶具有很好的穩(wěn)定性，具有應用降解纖維素工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/42GKCN102925469SQ201210347203
公開日2013年2月13日 申請日期2012年9月18日
發(fā)明者田云, 盧向陽, 李亞丹 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan