本發(fā)明涉及一種高效生產(chǎn)果糖軟骨素的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

硫酸軟骨素(chondroitinsulfate，cs)是一種由葡萄糖醛酸(d-glcua)與n-乙酰半乳糖胺(galnac)以β-1,3鍵和β-1,4鍵交替連接而成的直鏈酸性粘多糖，廣泛存在于人體軟骨、肌腱、椎間盤(pán)等結(jié)締組織中，與透明質(zhì)酸、肝素、硫酸角質(zhì)素組成了糖胺聚糖。硫酸軟骨素極其類(lèi)似物具有多種生物活性和藥用價(jià)值，在臨床上用于治療風(fēng)濕病和關(guān)節(jié)炎，可賦予軟骨凝膠樣特性和抗變形能力，享有人體“軟黃金”之稱(chēng)，同時(shí)硫酸軟骨素極其類(lèi)似物作為膳食補(bǔ)充劑和保濕劑，廣泛應(yīng)用于食品和化妝品領(lǐng)域。

目前，硫酸軟骨素極其類(lèi)似物工業(yè)化的主要生產(chǎn)方法為動(dòng)物組織提取法，即采用堿水解、蛋白酶酶解等工藝方法從豬、牛、鯊魚(yú)等動(dòng)物軟骨中制得。但是提取法自身存在諸多問(wèn)題，如原材料限制、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、產(chǎn)業(yè)水平不高、環(huán)境污染嚴(yán)重等，嚴(yán)重制約了硫酸軟骨素極其類(lèi)似物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者不斷探索尋求利用微生物發(fā)酵法高效生產(chǎn)硫酸軟骨素極其類(lèi)似物的方法。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員從生化工程和代謝工程兩個(gè)方面對(duì)微生物生產(chǎn)硫酸軟骨素及其類(lèi)似物進(jìn)行了系統(tǒng)性地研究。其中，1988年發(fā)現(xiàn)了e.colio10:k4:h4的莢膜多糖結(jié)構(gòu)為硫酸軟骨素類(lèi)似物果糖軟骨素，1996年利用k4菌株進(jìn)行發(fā)酵研究，采用rodriguez的發(fā)酵培養(yǎng)基，果糖軟骨素的產(chǎn)量達(dá)到了300mg/l，通過(guò)表達(dá)軟骨素合成酶基因kfoc，抗終止子rfah等策略提高果糖軟骨素的產(chǎn)量。進(jìn)一步提高果糖軟骨素產(chǎn)量成為亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)果糖軟骨素的大腸桿菌工程菌，以及應(yīng)用該工程菌生產(chǎn)果糖軟骨素的方法。本發(fā)明通過(guò)在大腸桿菌細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)合成果糖軟骨素途徑中的關(guān)鍵酶(磷酸葡萄糖胺變位酶glmm和氨基轉(zhuǎn)移酶glms)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了果糖軟骨素的高效生產(chǎn)，為果糖軟骨素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種高效生產(chǎn)果糖軟骨素的重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌是過(guò)表達(dá)了磷酸葡萄糖胺變位酶和氨基轉(zhuǎn)移酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述磷酸葡萄糖胺變位酶和氨基轉(zhuǎn)移酶是通過(guò)核糖體結(jié)合位點(diǎn)rbs1與表達(dá)載體相連；所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)rbs1的核苷酸序列如seqidno.5所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述磷酸葡萄糖胺變位酶和氨基轉(zhuǎn)移酶是通過(guò)融合表達(dá)方式進(jìn)行表達(dá)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述磷酸葡萄糖胺變位酶的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述的氨基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌是按照核糖體結(jié)合位點(diǎn)rbs1、磷酸葡萄糖胺變位酶glmm基因、寡肽連接子gggs和氨基轉(zhuǎn)移酶glms基因的順序融合后，整合到核苷酸序列如seqidno.7所示的表達(dá)載體上進(jìn)行表達(dá)；所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)rbs1的核苷酸序列如seqidno.5所示，所述寡肽連接子gggs的核苷酸序列如seqidno.6所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌的宿主為大腸桿菌k4atcc23502。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種所述重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法的步驟為：

(1)獲得氨基酸序列如seqidno.1的磷酸葡萄糖胺變位酶glmm和氨基酸序列如seqidno.2氨基轉(zhuǎn)移酶glms基因；

(2)獲得核苷酸序列如seqidno.5的核糖體結(jié)合位點(diǎn)rbs1和核苷酸序列如seqidno.6的寡肽連接子gggs基因；

(3)獲得核苷酸序列如seqidno.7所示的表達(dá)載體petm6r1；

(4)將步驟(1)和(2)所得的基因，按照核糖體結(jié)合位點(diǎn)rbs1、磷酸葡萄糖胺變位酶glmm基因、寡肽連接子gggs基因和氨基轉(zhuǎn)移酶glms基因的順序，連接到步驟(3)的表達(dá)載體上，得到重組質(zhì)粒petm6r1-rbs1-glmm-gggs-glms；

(5)將步驟(4)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌k4atcc23502中，得到大腸桿菌重組菌。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述大腸桿菌在生產(chǎn)果糖軟骨素中的應(yīng)用，所述應(yīng)用發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油10g/l，大豆蛋白胨1g/l，kh2po42g/l，k2hpo410g/l，mgcl20.1g/l，(nh4)2so41g/l，檸檬酸鈉0.5g/l；補(bǔ)料培養(yǎng)基：甘油400g/l，大豆蛋白胨40g/l；37℃下補(bǔ)料分批發(fā)酵。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用是按5-15％的接種量接種至發(fā)酵罐中，培養(yǎng)5-10h添加0.05-0.15mmol/l的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為35-38℃。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用是在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)溶氧陡然上升，開(kāi)始進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料策略為ph-stat，當(dāng)ph超過(guò)7.0時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)料，當(dāng)ph低于7.0時(shí)，停止補(bǔ)料。

本發(fā)明有益效果

本發(fā)明采用融合表達(dá)磷酸葡萄糖胺變位酶和氨基轉(zhuǎn)移酶，實(shí)現(xiàn)了基因的高效表達(dá)；在大腸桿菌k4中過(guò)表達(dá)，有效提高了果糖軟骨素的產(chǎn)量，相比于未過(guò)表達(dá)磷酸葡萄糖胺變位酶和氨基轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌k4，果糖軟骨素產(chǎn)量從1.91g/l提高至3.99g/l，提高了108.9％。本發(fā)明方法在工業(yè)上用于提高果糖軟骨素的產(chǎn)量具有潛在且非常廣泛的價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1所示為磷酸葡萄糖胺變位酶與氨基轉(zhuǎn)移酶串聯(lián)表達(dá)融合片段的構(gòu)建示意圖；

圖2所示為表達(dá)磷酸葡萄糖胺變位酶和氨基轉(zhuǎn)移酶融合片段重組載體的結(jié)構(gòu)圖；

圖3所示為含有磷酸葡萄糖胺變位酶和氨基轉(zhuǎn)移酶重組載體的重組菌株在搖瓶發(fā)酵中的果糖軟骨素產(chǎn)量；

圖4所示為含有磷酸葡萄糖胺變位酶和氨基轉(zhuǎn)移酶重組載體的重組菌株在5l發(fā)酵罐上補(bǔ)料發(fā)酵的果糖軟骨素產(chǎn)量。

具體實(shí)施方式

序列表中未相關(guān)核苷酸序列信息：

(1)seqidno.1序列信息為大腸桿菌來(lái)源的磷酸葡萄糖胺變位酶glmm氨基酸序列；

(2)seqidno.2序列信息為大腸桿菌來(lái)源的氨基轉(zhuǎn)移酶glms氨基酸序列；

(3)seqidno.3序列信息為人工構(gòu)建融合片段rbs1-glmm-gggs-glms的基因序列；

(4)seqidno.4序列信息為大腸桿菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子ptrc的基因序列；

(5)seqidno.5序列信息為rbs1基因序列；

(6)seqidno.6序列信息為gggs基因序列；

(7)seqidno.7序列信息為人工構(gòu)建質(zhì)粒petm6r1的基因序列；

采用硫酸咔唑比色法測(cè)定果糖軟骨素中的葡萄糖醛酸含量，再乘以2.88倍即獲得果糖軟骨素的含量。

實(shí)施例1：融合片段rbs1-glmm-gggs-glms的構(gòu)建

本發(fā)明所用的磷酸葡萄糖胺變位酶glmm基因和氨基轉(zhuǎn)移酶glms基因來(lái)源于大腸桿菌k4(atcc23502)，大腸桿菌k4接種于25mlluria-bertani(lb)液體培養(yǎng)基，在37℃，200rpm培養(yǎng)12h，收集菌體，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取大腸桿菌菌株的基因組dna。

根據(jù)已公布的基因組信息序列，分別設(shè)計(jì)序列如seqidno.8/seqidno.9引物對(duì)rh-glmm-s1/rh-glmm-a、序列如seqidno.10/seqidno.11引物對(duì)rh-glms-s/rh-glms-a，以提取的基因組dna為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的pcr擴(kuò)增體系和程序，擴(kuò)增獲取glmm和glms基因，然后以rh-glmm-s1/rh-glms-a為引物對(duì)，已經(jīng)獲取的glmm和glms基因片段為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的融合pcr擴(kuò)增體系和程序，獲得融合片段rbs1-glmm-gggs-glms。

引物序列信息：5’→3’方向

rh-glmm-s1:gctctagaaagagggcgcggcagagaaggaggaggtaagaaatgagtaatcgtaaatatttcggt

rh-glmm-a:cgccaacaattccacacatagaaccaccaccaacggcttttactgcatcg

rh-glms-s:cgatgcagtaaaagccgttggtggtggttctatgtgtggaattgttggcg

rh-glms-a:ccgctcgagttactcaaccgtaaccgattttg

pcr擴(kuò)增獲取的融合片段rbs1-glmm-gggs-glms，采用瓊脂糖凝膠核酸電泳切膠回收，回收產(chǎn)物連接pmd19t載體，體系10μl：5μlsolution連接酶，4μl目的片段，1μlpmd19t載體，16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化jm109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落pcr驗(yàn)證，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)正確，證明融合片段rbs1-glmm-gggs-glms構(gòu)建成功，質(zhì)粒命名為pmd19-rbs1-glmm-gggs-glms。

實(shí)施例2：融合片段rbs2-glmm-gggs-glms的構(gòu)建

將實(shí)施例1中rh-glmm-s1序列替換為序列如seqidno.12的rh-glmm-s2、序列如seqidno.13的rh-glmm-s3序列，其他方法與實(shí)施例1一致，構(gòu)建得到融合片段rbs2-glmm-gggs-glms、rbs3-glmm-gggs-glms。

引物序列信息：5’→3’方向

rh-glmm-s2:gctagatatttaaactatcacgacataaggaggtcagggatgagtaatcgtaaatatttcggt

rh-glmm-s3:gctctagacgacataacgttagaaaagaataaggtagtttcatgagtaatcgtaaatatttcggt

實(shí)施例3：表達(dá)載體petm6r1的構(gòu)建

根據(jù)ptrchisa質(zhì)粒公布的序列，分別設(shè)計(jì)序列如seqidno.14/seqidno.15引物對(duì)ptrchisa-s/ptrchisa-a，以質(zhì)粒ptrchisa為模板，采用標(biāo)準(zhǔn)的pcr擴(kuò)增體系和程序，擴(kuò)增獲取ptrc啟動(dòng)子基因序列。

引物序列信息：5’→3’方向

ptrchisa-s:ccctaggatcgagatcgatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatattgacaattaatcatccgg

ptrchisa-a:gctctagaggtaatttttaataataaagttaatcg

在上下游引物兩端分別引入avrii和xbai限制性酶切位點(diǎn)。pcr擴(kuò)增獲取的ptrc片段和質(zhì)粒petm6分別采用avrii和xbai進(jìn)行雙酶切，采用瓊脂糖凝膠核酸電泳進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，體系10μl：6μl雙酶切目的片段，2μl雙酶切載體，1μlt4dnaligasebuffer，1μlt4dnaligase，16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化jm109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落pcr驗(yàn)證，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)正確，證明重組質(zhì)粒petm6r1構(gòu)建成功。

實(shí)施例4：重組質(zhì)粒petm6r1-rbs1-glmm-gggs-glms的構(gòu)建

jm109(帶有質(zhì)粒pmd19-rbs1-glmm-gggs-glms)菌株接種于25mllb液體培養(yǎng)基，在37℃，200rpm培養(yǎng)12h，收集菌體，采用細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒提取大腸桿菌菌株的質(zhì)粒pmd19-rbs1-glmm-gggs-glms。實(shí)施案例1中，在glmm上游引物rh-glmm-s1和glms下游引物rh-glms-a分別引入了xbai和xhoi限制性酶切位點(diǎn)。質(zhì)粒petm6r1和pmd19-rbs1-glmm-gggs-glms分別采用xbai和xhoi進(jìn)行雙酶切，采用瓊脂糖核酸電泳進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，體系10μl：6μl雙酶切目的片段，2μl雙酶切載體，1μlt4dnaligasebuffer，1μlt4dnaligase，16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化jm109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落pcr驗(yàn)證，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)正確，證明重組質(zhì)粒petm6r1-rbs1-glmm-gggs-glms構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化escherichiacolik4，以100mg/ml的氨芐青霉素平板篩選，并對(duì)重組菌株進(jìn)行pcr驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)成功轉(zhuǎn)入petm6r1-rbs1-glmm-gggs-glms的大腸桿菌菌株命名為zq33。

實(shí)施例5：重組質(zhì)粒petm6r1-rbs2-glmm-gggs-glms、petm6r1-rbs3-glmm-gggs-glms的構(gòu)建

按照實(shí)施例4的方法將實(shí)施例2所得融合片段rbs2-glmm-gggs-glms、rbs3-glmm-gggs-glms連接到質(zhì)粒petm6r1，再轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌k4內(nèi)，得到重組大腸桿菌zq32、zq31。

實(shí)施例6：重組菌株zq31、zq32、zq33搖瓶發(fā)酵

挑取zq31、zq32、zq33重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。單克隆接種于50ml(500ml搖瓶)含有10mg/mlamp的lb培養(yǎng)基作為搖瓶發(fā)酵的種子液，置于37℃200rpm培養(yǎng)10h。搖瓶發(fā)酵的接種量為1％，發(fā)酵條件為：轉(zhuǎn)速200rpm，溫度37℃，初始ph控制在7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基為：甘油10g/l，大豆蛋白胨1g/l，kh2po42g/l，k2hpo410g/l，mgcl20.1g/l，(nh4)2so41g/l，檸檬酸鈉0.5g/l。培養(yǎng)5h添加1mmol/l的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為37℃，每4h取樣一次測(cè)定果糖軟骨素的產(chǎn)量。為測(cè)定果糖軟骨素的產(chǎn)量，收集發(fā)酵液，10000rpm下室溫離心15min，上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入3倍體積的無(wú)水乙醇充分混勻至4℃冰箱醇沉過(guò)夜。10000rpm離心10min，去除液體，白色沉淀置于65℃10min，然后用超純水復(fù)溶，用于下一步產(chǎn)量的測(cè)定。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程以大腸桿菌k4為對(duì)照，但不加入氨芐青霉素。

根據(jù)果糖軟骨素的產(chǎn)量測(cè)定，結(jié)果如圖3所示，發(fā)酵37h，原始菌株k4、重組菌株zq31、zq32、zq33果糖軟骨素產(chǎn)量分別為0.106、0.115、0.206、0.418g/l，較原菌產(chǎn)量均有所提高，其中zq33較原菌提高了294.3％。

實(shí)施例7：重組菌株zq33在5l發(fā)酵罐進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵

挑取zq33重組菌株進(jìn)行上罐發(fā)酵。單克隆接種于50ml(500ml搖瓶)含有10mg/mlamp的lb培養(yǎng)基作為上罐的種子液，置于37℃200rpm培養(yǎng)10h。發(fā)酵罐裝液量為2.5l，發(fā)酵培養(yǎng)基為：甘油10g/l，大豆蛋白胨1g/l，kh2po42g/l，k2hpo410g/l，mgcl20.1g/l，(nh4)2so41g/l，檸檬酸鈉0.5g/l；補(bǔ)料培養(yǎng)基：甘油400g/l，大豆蛋白胨40g/l；37℃下補(bǔ)料分批發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基的ph控制為7.0。按10％的接種量接種至發(fā)酵罐中，培養(yǎng)5h添加1mmol/l的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)溶氧陡然上升，開(kāi)始進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料策略為ph-stat，當(dāng)ph超過(guò)7.0時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)料，當(dāng)ph低于7.0時(shí)，停止補(bǔ)料，補(bǔ)料周期為5s，補(bǔ)料持續(xù)至發(fā)酵結(jié)束，每4h取樣一次測(cè)定果糖軟骨素的產(chǎn)量。果糖軟骨素處理及測(cè)定方法同實(shí)施例6。

根據(jù)果糖軟骨素的產(chǎn)量測(cè)定，結(jié)果如圖4所示，發(fā)酵36h，重組菌株zq33和未過(guò)表達(dá)磷酸葡萄糖胺變位酶和氨基轉(zhuǎn)移酶的野生型菌株產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為3.99g/l和1.91g/l。

以上結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明技術(shù)采用基因工程技術(shù)，過(guò)量表達(dá)果糖軟骨素合成路徑上的葡萄糖胺變位酶glmm和氨基轉(zhuǎn)移酶glms能夠有效提高果糖軟骨素的產(chǎn)量。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110>江南大學(xué)

<120>一種高效生產(chǎn)果糖軟骨素的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法

<160>15

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>445

<212>prt

<213>大腸桿菌k4(escherichiacolik4atcc23502)

<400>1

metserasnarglystyrpheglythraspglyileargglyargval

151015

glyaspalaproilethrproaspphevalleulysleuglytrpala

202530

alaglylysvalleualaarghisglyserarglysileileilegly

354045

lysaspthrargileserglytyrmetleugluseralaleugluala

505560

glyleualaalaalaglyleuseralaleuphethrglyprometpro

65707580

thrproalavalalatyrleuthrargthrpheargalaglualagly

859095

ilevalileseralaserhisasnprophetyraspasnglyilelys

100105110

phepheserileaspglythrlysleuproaspalavalglugluala

115120125

ileglualaglumetglulysgluilesercysvalaspseralaglu

130135140

leuglylysalaserargilevalaspalaalaglyargtyrileglu

145150155160

phecyslysalathrpheproasngluleuserleusergluleulys

165170175

ilevalvalaspcysalaasnglyalathrtyrhisilealaproasn

180185190

valleuarggluleuglyalaasnvalilealaileglycysglupro

195200205

asnglyvalasnileasnalagluvalglyalathraspvalargala

210215220

leuglnalaargvalleualaglulysalaaspleuglyilealaphe

225230235240

aspglyaspglyaspargvalilemetvalasphisgluglyasnlys

245250255

valaspglyaspglnilemettyrileilealaarggluglyleuarg

260265270

glnglyglnleuargglyglyalavalglythrleumetserasnmet

275280285

glyleugluleualaleulysglnleuglyileprophealaargala

290295300

lysvalglyaspargtyrvalleuglulysmetglnglulysglytrp

305310315320

argileglyalagluasnserglyhisvalileleuleuasplysthr

325330335

thrthrglyaspglyilevalalaglyleuglnvalleualaalamet

340345350

alaargasnhismetserleuhisaspleucysserglymetlysmet

355360365

pheproglnileleuvalasnvalargtyrthralaglyserglyasp

370375380

proleugluhisgluservallysalavalthralagluvalgluala

385390395400

alaleuglyasnargglyargvalleuleuarglysserglythrglu

405410415

proleuileargvalmetvalgluglygluaspglualaglnvalthr

420425430

gluphealahisargilealaaspalavallysalaval

435440445

<210>2

<211>608

<212>prt

<213>大腸桿菌k4(escherichiacolik4atcc23502)

<400>2

metcysglyilevalglyalailealaglnargaspvalalagluile

151015

leuleugluglyleuargargleuglutyrargglytyraspserala

202530

glyleualavalvalaspalagluglyhismetthrargleuargarg

354045

leuglylysvalglnmetleualaglnalaalaglugluhisproleu

505560

hisglyglythrglyilealahisthrargtrpalathrhisglyglu

65707580

prosergluvalasnalahisprohisvalsergluhisilevalval

859095

valhisasnglyileilegluasnhisgluproleuargglugluleu

100105110

lysalaargglytyrthrphevalsergluthraspthrgluvalile

115120125

alahisleuvalasntrpgluleulysglnglyglythrleuargglu

130135140

alavalleuargalaileproglnleuargglyalatyrglythrval

145150155160

ilemetaspserarghisproaspthrleuleualaalaargsergly

165170175

serproleuvalileglyleuglymetglygluasnpheilealaser

180185190

aspglnleualaleuleuprovalthrargargpheilepheleuglu

195200205

gluglyaspilealagluilethrargargservalasnilepheasp

210215220

lysthrglyalagluvallysargglnaspilegluserasnleugln

225230235240

tyraspalaglyasplysglyiletyrarghistyrmetglnlysglu

245250255

iletyrgluglnproasnalailelysasnthrleuthrglyargile

260265270

serhisglyglnvalaspleusergluleuglyproasnalaaspglu

275280285

leuleuserlysvalgluhisileglnileleualacysglythrser

290295300

tyrasnserglymetvalserargtyrtrpphegluserleualagly

305310315320

ileprocysaspvalgluilealaserglupheargtyrarglysser

325330335

alavalargargasnserleumetilethrleuserglnserglyglu

340345350

thralaaspthrleualaglyleuargleuserlysgluleuglytyr

355360365

leuglyserleualailecysasnvalproglyserserleuvalarg

370375380

gluseraspleualaleumetthrasnalaglythrgluileglyval

385390395400

serthrlysalaphethrthrglnleuthrvalleuleumetleuval

405410415

alalysleuserargleulysglyleuaspalaserilegluhisasp

420425430

ilevalhisglyleuglnalaleuproserargilegluglnmetleu

435440445

serglnasplysargileglualaleualagluasppheserasplys

450455460

hishisalaleupheleuglyargglyaspglntyrproilealaleu

465470475480

gluglyalaleulysleulysgluilesertyrilehisalagluala

485490495

tyralaalaglygluleulyshisglyproleualaleuileaspala

500505510

aspmetprovalilevalvalalaproasnasngluleuleuglulys

515520525

leulysserasnileglugluvalargalaargglyglyglnleutyr

530535540

valphealaaspglnaspalaglyphevalserseraspasnmethis

545550555560

ileileglumetprohisvalglugluvalilealaproilephetyr

565570575

thrvalproleuglnleuleualatyrhisvalalaleuilelysgly

580585590

thraspvalaspglnproargasnleualalysservalthrvalglu

595600605

<210>3

<211>3217

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

tctagaaagagggcgcggcagagaaggaggaggtaagaaatgagtaatcgtaaatatttc60

ggtaccgatgggattcgtggtcgtgtaggggatgcgccgatcacacctgattttgtgctt120

aagctgggttgggccgcgggtaaagtgctggcgcgccacggctcccgtaagatcattatt180

ggtaaagacacgcgtatttctggctatatgctggagtcagcactggaagcgggtctggcg240

gcagcgggcctttccgcactcttcactggcccgatgccaacaccggccgtggcttatctg300

acgcgtaccttccgcgcagaggccggaattgtgatatctgcatcgcataacccgttctac360

gataatggcattaaattcttctctatcgacggcaccaaactgccggatgcggtagaagag420

gccatcgaagcggaaatggaaaaggagatcagctgcgttgattcggcagaactgggtaaa480

gccagccgtatcgttgatgccgcgggtcgctatatcgagttttgcaaagccacgttcccg540

aacgaacttagcctcagtgaactgaagattgtggtggattgtgcaaacggtgcgacttat600

cacatcgcgccgaacgtgctgcgcgaactgggggcgaacgttatcgctatcggttgtgag660

ccaaacggtgtaaacatcaatgccgaagtgggggctaccgacgttcgcgcgctccaggct720

cgtgtgctggctgaaaaagcggatctcggtattgccttcgacggcgatggcgatcgcgtg780

attatggttgaccatgaaggcaataaagtcgatggcgatcagatcatgtatatcatcgcg840

cgtgaaggtcttcgtcagggccagctgcgtggtggcgctgtgggtacattgatgagcaac900

atggggcttgaactggcgctgaaacagttaggaattccatttgcgcgcgcgaaagtgggt960

gaccgctacgtactggaaaaaatgcaggagaaaggctggcgtatcggtgcagagaattcc1020

ggtcatgtgatcctgctggataaaactactaccggtgacggcatcgttgctggcttgcag1080

gtgctggcggctatggcacgtaaccatatgagcctgcacgacctttgcagcggcatgaaa1140

atgttcccgcagattctggttaacgtacgttacaccgcaggtagcggcgatccacttgag1200

catgagtcagttaaagccgtgaccgcagaggttgaagctgcgctgggcaaccgtggacgc1260

gtgttgctgcgtaaatccggcaccgaaccgttaattcgcgtgatggtggaaggcgaagac1320

gaagcgcaggtgactgaatttgcacaccgcatcgccgatgcagtaaaagccgttggtggt1380

ggttctatgtgtggaattgttggcgcgatcgcgcaacgtgatgtagcagaaatccttctt1440

gaaggtttacgtcgtctggaataccgcggatatgactctgccggtctggccgttgttgat1500

gcggaaggtcatatgacccgcctgcgtcgcctcggtaaagtccagatgctggctcaggca1560

gcggaagaacatcctctgcatggcggcaccggtattgctcatactcgctgggcgacacac1620

ggtgaaccttcagaagtgaatgcgcatccgcatgtttctgaacacattgtggtggtgcat1680

aacggcatcatcgaaaaccatgaaccgctgcgtgaagagctaaaagcgcgtggctatacc1740

ttcgtttctgaaaccgacaccgaagtgattgcccatctggtgaactgggagctgaaacaa1800

ggcgggactctgcgtgaggccgttctgcgtgctatcccgcagctgcgtggtgcgtacggt1860

acagtgatcatggactcccgtcacccggataccctgctggcggcacgttctggtagtccg1920

ctggtgattggcctggggatgggcgaaaactttatcgcttctgaccagctggcgctgttg1980

ccggtgacccgtcgctttatcttccttgaagagggcgatattgcggaaatcactcgccgt2040

tcggtaaacatcttcgataaaactggcgcggaagtaaaacgtcaggatatcgaatccaat2100

ctgcaatatgacgcgggcgataaaggcatttaccgtcactacatgcagaaagagatctac2160

gaacagccgaacgcgatcaaaaacacccttaccggacgcatcagccacggtcaggttgat2220

ttaagcgagctgggaccgaacgccgacgaactgttgtcgaaggttgagcatattcagatc2280

ctcgcctgtggtacttcttataactccggtatggtttcccgctactggtttgaatcgcta2340

gcaggtattccgtgcgacgtcgaaatcgcctctgaattccgctatcgcaaatctgccgtg2400

cgtcgtaacagcctgatgatcaccttgtcacagtctggcgaaaccgcggataccctggct2460

ggcctgcgtctgtcgaaagagctgggttaccttggttcactggcaatctgtaacgttccg2520

ggttcttctctggtgcgcgaatccgatctggcgctaatgaccaacgcgggtacagaaatc2580

ggcgtggcatccactaaagcattcaccactcagttaactgtgctgttgatgctggtggcg2640

aagctgtctcgcctgaaaggtctggatgcctccattgaacatgacattgtgcatggtctg2700

caggcgttgccgagccgtattgagcagatgctgtctcaggacaaacgcattgaagctctg2760

gcagaagatttctctgacaaacatcacgcgctgttcctgggccgtggcgatcagtaccca2820

atcgcgctggaaggcgcattgaagctgaaagagatctcttacattcacgctgaagcctac2880

gctgcaggtgaactgaaacacggtccgctggcgctgattgatgccgatatgccggttatc2940

gtcgttgcaccgaacaacgaattgctggaaaaactaaaatccaacattgaagaagttcgc3000

gcgcgtggcggtcagttgtatgtcttcgccgatcaggatgcgggttttgtaagtagcgat3060

aacatgcacatcatcgagatgccgcatgtggaagaggtgattgcaccaatcttctacacc3120

gttccgctgcagctactggcttatcacgtcgcgctgatcaaaggtaccgacgttgaccag3180

ccgcgtaacctggcaaaatcggttacggttgagtaac3217

<210>4

<211>234

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

cctaggatcgagatcgatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatattgacaatt60

aatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaac120

agcgccgctgagaaaaagcgaagcggcactgctctttaacaatttatcagacaatctgtg180

tgggcactcgaccggaattatcgattaactttattattaaaaattacctctaga234

<210>5

<211>33

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

aagagggcgcggcagagaaggaggaggtaagaa33

<210>6

<211>12

<212>dna

<213>人工合成

<400>6

ggtggtggttct12

<210>7

<211>5351

<212>dna

<213>人工合成

<400>7

ttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcac60

acaggaaacagcgccgctgagaaaaagcgaagcggcactgctctttaacaatttatcaga120

caatctgtgtgggcactcgaccggaattatcgattaactttattattaaaaattacctct180

agaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatggcagatctcaattggata240

tcggccggccacgcgatcgctgacgtcggtaccctcgagtctggtaaagaaaccgctgct300

gcgaaatttgaacgccagcacatggactcgtctactagtcgcagcttaattaacctaaac360

tgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgag420

gggttttttgctagcgaaaggaggagtcgactatatccggattggcgaatgggacgcgcc480

ctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacact540

tgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgc600

cggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgcttt660

acggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgcc720

ctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactctt780

gttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggat840

tttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaa900

ttttaacaaaatattaacgtttacaatttctggcggcacgatggcatgagattatcaaaa960

aggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtata1020

tatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcg1080

atctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgata1140

cgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccg1200

gctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcct1260

gcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagt1320

tcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgc1380

tcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatga1440

tcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagt1500

aagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtc1560

atgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaa1620

tagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgcca1680

catagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctca1740

aggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatct1800

tcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgcc1860

gcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaa1920

tcatgattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtat1980

ttagaaaaataaacaaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccact2040

gagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg2100

taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatc2160

aagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaata2220

ctgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgccta2280

catacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtc2340

ttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacgg2400

ggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctac2460

agcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccgg2520

taagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggt2580

atctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgct2640

cgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctgg2700

ccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggata2760

accgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgca2820

gcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatc2880

tgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgc2940

atagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccga3000

cacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttac3060

agacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccg3120

aaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatg3180

tctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggctt3240

ctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtg3300

taagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacg3360

atacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactg3420

gcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgtt3480

aatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaac3540

ataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaag3600

accattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgc3660

tcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtc3720

ctcaacgacaggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgact3780

gggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaactt3840

acattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctg3900

cattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggt3960

ttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgaga4020

gagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggt4080

ggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagat4140

gtccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctg4200

atcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttg4260

ttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgatt4320

gcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgg4380

gcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcg4440

cgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaag4500

aaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccag4560

cggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgcttt4620

acaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatc4680

ggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggt4740

ggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaat4800

gtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggct4860

ggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatc4920

gtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatca4980

tgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctccct5040

tatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccg5100

ccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctg5160

ccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccc5220

catcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccgg5280

ccacgatgcgtccggcgtagcctaggatcgagatcgatctcgatcccgcgaaattaatac5340

gactcactata5351

<210>8

<211>65

<212>dna

<213>人工合成

<400>8

gctctagaaagagggcgcggcagagaaggaggaggtaagaaatgagtaatcgtaaatatt60

tcggt65

<210>9

<211>50

<212>dna

<213>人工合成

<400>9

cgccaacaattccacacatagaaccaccaccaacggcttttactgcatcg50

<210>10

<211>50

<212>dna

<213>人工合成

<400>10

cgatgcagtaaaagccgttggtggtggttctatgtgtggaattgttggcg50

<210>11

<211>32

<212>dna

<213>人工合成

<400>11

ccgctcgagttactcaaccgtaaccgattttg32

<210>12

<211>63

<212>dna

<213>人工合成

<400>12

gctagatatttaaactatcacgacataaggaggtcagggatgagtaatcgtaaatatttc60

ggt63

<210>13

<211>65

<212>dna

<213>人工合成

<400>13

gctctagacgacataacgttagaaaagaataaggtagtttcatgagtaatcgtaaatatt60

tcggt65

<210>14

<211>71

<212>dna

<213>人工合成

<400>14

ccctaggatcgagatcgatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatattgacaat60

taatcatccgg71

<210>15

<211>35

<212>dna

<213>人工合成

<400>15

gctctagaggtaatttttaataataaagttaatcg35