本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種高產(chǎn)高光學(xué)純l-丙氨酸的大腸桿菌。
背景技術(shù)：
l-丙氨酸已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及食品領(lǐng)域，并作為大宗氨基酸產(chǎn)品中的一種。目前工業(yè)上生產(chǎn)l-丙氨酸有發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法，滿足市場(chǎng)不同需求。
酶法制備l-丙氨酸原理是l-天門冬氨酸在脫羧酶作用下生產(chǎn)l-丙氨酸。l-天門冬氨酸通常是由天門冬氨酸酶催化底物富馬酸制備。在酶法制備過(guò)程中釋放出二氧化碳，從環(huán)保及原料損耗的角度，酶法既不環(huán)保又不經(jīng)濟(jì)。酶法制備高光學(xué)純l-丙氨酸產(chǎn)品可應(yīng)用于手性藥物合成領(lǐng)域，并且市場(chǎng)價(jià)格也高于發(fā)酵法生產(chǎn)的l-丙氨酸產(chǎn)品。
應(yīng)用l-丙氨酸生產(chǎn)領(lǐng)域發(fā)酵法技術(shù)來(lái)源于zhang等報(bào)道(zhangx.etal.，applmicrobiolbiotechnol，2007，77：355-366；張學(xué)禮等，中國(guó)專利cn102329765a，2012，01，25；付剛等，湖北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，32(1)；周哲敏等，微生物學(xué)通報(bào)，2015，42，2272-2281；周哲敏等，中國(guó)專利cn104774790a，2015，07，15)。在大腸桿菌厭氧發(fā)酵過(guò)程中，利用l-丙氨酸脫氫酶的逆反應(yīng)，把丙酮酸轉(zhuǎn)化成l-丙氨酸，同時(shí)阻斷厭氧過(guò)程中合成丁二酸、乙醇、乳酸、乙酸及甲酸合成代謝途徑，獲得生產(chǎn)高濃度l-丙氨酸大腸桿菌工程菌。從生產(chǎn)成本和原料利用率角度，發(fā)酵法優(yōu)于酶法生產(chǎn)工藝。
高光學(xué)純l-丙氨酸(ee值需達(dá)到99.98％)應(yīng)用于手性藥物合成領(lǐng)域，如合成手性藥物左氧氟沙星。高光學(xué)純l-丙氨酸來(lái)源于酶法生產(chǎn)l-丙氨酸工藝，高光學(xué)純l-丙氨酸售價(jià)高于發(fā)酵法l-丙氨酸產(chǎn)品。已報(bào)道的發(fā)酵法生產(chǎn)l-丙氨酸光學(xué)純度(ee值)達(dá)到99.5％(周哲敏等，中國(guó)專利cn104774790a，2015，07，15，zhangx.etal.，applmicrobiolbiotechnol，2007，77：355-366)。
然而，現(xiàn)有技術(shù)在提高了所產(chǎn)l-丙氨酸純度的同時(shí)，l-丙氨酸的產(chǎn)量并未取得良好的進(jìn)步。因此，亟需提供一種可高產(chǎn)高光學(xué)純l-丙氨酸的微生物，以實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)高光學(xué)純l-丙氨酸的目標(biāo)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種用于生產(chǎn)高光學(xué)純l-丙氨酸的大腸桿菌及其制備方法與應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供一種經(jīng)誘變篩選得到的發(fā)生基因突變的大腸桿菌，經(jīng)鑒定為大腸埃希氏菌(escherichiacoli)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101)，保藏日期為2017年4月24日，保藏編號(hào)為cgmccno.14067。
本發(fā)明所提供的大腸桿菌是由大腸桿菌atcc55124經(jīng)誘變后篩選得到的。具體為：取37℃培養(yǎng)16h大腸桿菌atcc55124的lb斜面，加無(wú)菌生理鹽水10ml，刮下菌落，反復(fù)吹打并置搖床上振蕩10min，打散成單個(gè)細(xì)菌，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌體濃度至106個(gè)/ml即成菌體懸液。取菌體懸液5ml置輻照皿中，利用12c+6離子束，按照0gy、30gy、40gy、50gy、60gy及70gy的輻照劑量對(duì)上述大腸桿菌菌體懸浮液分別進(jìn)行輻照處理。將不同劑量輻照后的單個(gè)細(xì)菌懸液梯度稀釋后涂布在lb平板培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-3天。然后轉(zhuǎn)入搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)，篩選產(chǎn)l-丙氨酸濃度高、純度高的菌株。
后經(jīng)過(guò)一系列試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，所篩選的菌株不僅可生產(chǎn)高光學(xué)純度的l-丙氨酸，還顯著提高了l-丙氨酸的產(chǎn)量。
本發(fā)明進(jìn)一步地提供了所述大腸桿菌在生產(chǎn)高光學(xué)純l-丙氨酸方面的應(yīng)用。
所述大腸桿菌生產(chǎn)的l-丙氨酸的光學(xué)純度(ee值)可達(dá)到99.99％以上。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述大腸桿菌生產(chǎn)l-丙氨酸的產(chǎn)量可達(dá)141g/l。
需要說(shuō)明的是，含有本發(fā)明所述大腸桿菌或其代謝產(chǎn)物/發(fā)酵產(chǎn)物的試劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明提供了一種可高效生產(chǎn)高光學(xué)純l-丙氨酸的大腸桿菌，應(yīng)用本發(fā)明所述菌株生產(chǎn)的l-丙氨酸的光學(xué)純度(ee值)可達(dá)99.99％。不僅如此，本發(fā)明所述菌株還實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)l-丙氨酸的目標(biāo)，為工業(yè)生產(chǎn)高光學(xué)純的l-丙氨酸提供了良好的途徑。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做進(jìn)一步詳細(xì)描述，以大腸桿菌工程菌具體改造過(guò)程為例說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實(shí)施例中：
lb培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，配制體積至1l。
實(shí)施例1
本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明大腸桿菌菌株在50升發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸，具體如下：
將本發(fā)明提供的大腸桿菌菌株劃線lb瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18小時(shí)。
將平板培養(yǎng)的l-丙氨酸生產(chǎn)菌接種至搖瓶培養(yǎng)基(200ml)中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，氯化鈉10g/l，滅菌前使用10％氫氧化鈉溶液(w/t)調(diào)至ph7.2，37℃下120rpm培養(yǎng)至od600達(dá)3.0。
將上述搖瓶種子按種子罐培養(yǎng)基體積的1％的接種量接入到種子罐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，50升種子罐種后培養(yǎng)基體積20升。種子罐培養(yǎng)基含玉米漿10g/l，酵母浸粉10g/l，甘油5g/l，滅菌前使用10％氫氧化鈉溶液(w/t)調(diào)至ph7.2。在50升種子罐內(nèi)培養(yǎng)種子，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)通風(fēng)比為1：0.3，控制罐壓為0.03mpa，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，培養(yǎng)至od600達(dá)7.0。
將上述種子罐種液按發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的10％的接種量接入到發(fā)酵罐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，50升發(fā)酵罐種后培養(yǎng)基體積35升。發(fā)酵罐培養(yǎng)基含磷酸氫二鉀3.5g/l，磷酸二氫鉀2.5g/l，一水合氯化鈣0.05g/l，七水合硫酸鎂0.5g/l，硫酸銨0.8g/l，氯化鋅0.0003g/l，二水合鉬酸鈉0.0002g/l，二水合氯化銅0.0003g/l，硼酸0.0005g/l，四水合氯化錳0.0002g/l，六水合氯化鈷0.0003g/l，七水合硫酸亞鐵0.005g/l，葡萄糖145g/l。接種前用氨水調(diào)發(fā)酵液ph值至7.0。發(fā)酵通風(fēng)比為1：0.15，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)溫度37℃，控制罐壓為0.03mpa，使用氨水維持發(fā)酵液ph7.0。當(dāng)發(fā)酵od600至5.0時(shí)停止通風(fēng)，當(dāng)殘存葡萄糖低于0.5g/l時(shí)停止發(fā)酵。
分析方法：使用安捷倫(agilent-1200)高效液相色譜儀對(duì)發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸進(jìn)行測(cè)定。發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸的定量使用安捷倫c18色譜柱檢測(cè)，l-丙氨酸光學(xué)純度(ee值)使用日本住友oa6000色譜柱進(jìn)行測(cè)定。發(fā)酵液中葡萄糖含量使用sba生物傳感儀測(cè)定。
結(jié)果：發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸含量為141g/l，光學(xué)純度(ee值)為99.99％。
實(shí)施例2
本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明大腸桿菌菌株在10立方米發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸，具體如下：
將本發(fā)明提供的大腸桿菌菌株劃線lb瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18小時(shí)。
將平板培養(yǎng)的l-丙氨酸生產(chǎn)菌接種至搖瓶培養(yǎng)基(700ml)中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，氯化鈉10g/l。滅菌前使用10％氫氧化鈉溶液(w/t)調(diào)至ph7.2，37℃下120rpm培養(yǎng)至od600達(dá)3.0。
將上述搖瓶種子按一級(jí)種子罐培養(yǎng)基體積的1％的接種量接入到種子罐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，200升種子罐種后培養(yǎng)基體積70升。種子罐培養(yǎng)基含玉米漿10g/l，酵母浸粉10g/l，甘油3g/l，滅菌前使用10％氫氧化鈉溶液(w/t)調(diào)至ph7.2。在一級(jí)種子罐內(nèi)培養(yǎng)種子，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)通風(fēng)比為1：0.3，控制罐壓為0.03mpa，攪拌轉(zhuǎn)速為350rpm，培養(yǎng)至od600達(dá)3.0。
將上述一級(jí)種子罐種液按二級(jí)種子罐培養(yǎng)基體積的10％的接種量接入到二級(jí)種子罐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2000升二級(jí)種子罐種后培養(yǎng)基體積700升。二級(jí)種子罐培養(yǎng)基含玉米漿10g/l，酵母浸粉10g/l，甘油5g/l，滅菌前使用10％氫氧化鈉溶液(w/t)調(diào)至ph7.2。在二級(jí)種子罐內(nèi)培養(yǎng)種子，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)通風(fēng)比為1：0.3，控制罐壓為0.03mpa，攪拌轉(zhuǎn)速為250rpm，培養(yǎng)至od600達(dá)7.0。
將上述二級(jí)種子罐種液按發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的10％的接種量接入到發(fā)酵罐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10立方米發(fā)酵罐種后培養(yǎng)基體積7立方米。發(fā)酵罐培養(yǎng)基含磷酸氫二鉀3.5g/l，磷酸二氫鉀2.5g/l，一水合氯化鈣0.05g/l，七水合硫酸鎂0.5g/l，硫酸銨0.8g/l，氯化鋅0.0003g/l，二水合鉬酸鈉0.0002g/l，二水合氯化銅0.0003g/l，硼酸0.0005g/l，四水合氯化錳0.0002g/l，六水合氯化鈷0.0003g/l，七水合硫酸亞鐵0.005g/l，葡萄糖145g/l。接種前用氨水調(diào)發(fā)酵液ph值至7.0。發(fā)酵通風(fēng)比為1：0.15，攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，發(fā)酵培養(yǎng)溫度37℃，控制罐壓為0.03mpa，使用氨水維持發(fā)酵液ph7.0。當(dāng)發(fā)酵od600至5.0時(shí)停止通風(fēng)，當(dāng)殘存葡萄糖低于0.5g/l時(shí)停止發(fā)酵。
分析方法：使用安捷倫(agilent-1200)高效液相色譜儀對(duì)發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸進(jìn)行測(cè)定。發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸的定量使用安捷倫c18色譜柱檢測(cè)，l-丙氨酸光學(xué)純度(ee值)使用日本住友oa6000色譜柱進(jìn)行測(cè)定。發(fā)酵液中葡萄糖含量使用sba生物傳感儀測(cè)定。
結(jié)果：發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸含量為141.7g/l，光學(xué)純度(ee值)為99.99％。
實(shí)施例3
本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明大腸桿菌菌株在cn102329765a公開的發(fā)酵條件下發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸，具體如下：
種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖120g/l，氯化銨5g/l，nah2po45g/l，na2hpo45g/l，mgso4·7h2o1g/l，cacl22h2o0.1g/l，微量無(wú)機(jī)鹽5ml/l，培養(yǎng)基ph6.5。
微量無(wú)機(jī)鹽組成為：fecl3·6h2o1.5mg，cocl2·6h2o0.1mg，cucl2·2h2o0.1mg，zncl20.1mg，na2moo4·2h2o0.1mg，mncl2·4h2o0.2mg，蒸餾水定容至1l，過(guò)濾除菌。
250ml三角瓶中種子培養(yǎng)基為150ml，121℃滅菌15min。冷卻后接入本發(fā)明菌株cgmccno.14067，培養(yǎng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為50r/min，培養(yǎng)18h，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種。
3l發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基體積為2.4l，121℃滅菌15min。接種量為0.1％(v/v)，發(fā)酵溫度為30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm。發(fā)酵過(guò)程采用氨水控制ph在6.5，發(fā)酵時(shí)間為48h。hplc分析發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸和有機(jī)酸含量：l-丙氨酸為117.9g/l，l-丙氨酸的光學(xué)純度(ee值)為99.99％；乳酸、乙酸、乙醇、丁二酸含量均低于0.1g/l。
實(shí)施例4
本對(duì)比例用于說(shuō)明cn102329765a公開的大腸桿菌菌株在本發(fā)明發(fā)酵條件下發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸。
本對(duì)比例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于，所使用的微生物為保藏號(hào)為cgmccno.4036的大腸桿菌。
結(jié)果：發(fā)酵液中l(wèi)-丙氨酸含量為115.3g/l，光學(xué)純度(ee值)為99.5％。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。