本發(fā)明涉及微生物學(xué)及生物降解領(lǐng)域，具體地說，涉及黑曲霉菌株w35及其在降解赭曲霉毒素a中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

赭曲霉毒素a(ota)污染糧谷類、干果、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧克力、中草藥、調(diào)味料、罐頭食品、油、橄欖、豆制品、啤酒、茶葉等多種農(nóng)作物、食品及飼料，對人類的健康構(gòu)成了極大的威脅。是繼黃曲霉毒素后又一個引起世界廣泛關(guān)注的霉菌毒素。ota的脫毒方法主要有三種：物理方法，化學(xué)方法和生物方法。利用微生物或酶制劑降解的生物脫毒方法成為控制赭曲霉毒素污染的理想方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供黑曲霉菌株w35及其在降解赭曲霉毒素a中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的黑曲霉w35分離自落葉叢，并采用含ota的yes培養(yǎng)基進(jìn)行篩選得到的。

菌株w35的微生物學(xué)特征如下：黑曲霉屬于半知菌亞門，半知菌綱，殼霉目，杯霉科，黑曲霉屬真菌中的一個常見種。分生孢子梗自基質(zhì)中伸出，直徑15～20μm，長約1～3mm，黑曲霉壁厚而光滑。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層?；鸵粚有」?，小梗上長有成串褐黑色的球狀，直徑2.5～4.0μm。分生孢子頭球狀，直徑700～800μm，褐黑色。蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一。頂囊球形，雙層小梗。分生孢子褐色球形。

菌株w35的理化特征如下：廣泛分布于世界各地的糧食、植物性 產(chǎn)品和土壤中。是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，可生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等。有的菌株還可將羥基孕甾酮轉(zhuǎn)化為雄烯。生長適溫37℃，最低相對濕度為88％，能引致水分較高的糧食霉變和其他工業(yè)器材霉變。

菌株w35的18srdna序列如seqidno:1所示，將其18srdna序列在genbank中進(jìn)行比對，并構(gòu)建菌株w35的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。

基于以上信息，將菌株w35鑒定為黑曲霉(aspergillusniger)。該菌現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號cgmccno.12104，保藏日期2016年01月28日。

本發(fā)明還提供黑曲霉w35在降解赭曲霉毒素a中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述應(yīng)用包括以下步驟：

將含10⁵-10⁷個孢子的黑曲霉w35孢子懸液接種于含有1-6μg/ml赭曲霉毒素a的500mlyes培養(yǎng)基中，接種量為0.5-3v/v％，于27℃-29℃靜置培養(yǎng)13-19天；培養(yǎng)結(jié)束后，過濾去除菌絲體，所得上清再用0.45μm濾膜過濾，去除殘留霉菌孢子，將500μl所得上清加至離心管中，同時加入終濃度為10-60g/l的赭曲霉毒素a，然后將離心管置于搖床上，36℃-38℃140-160rpm避光保溫反應(yīng)11-13h。

優(yōu)選地，將含約10⁶個孢子的黑曲霉w35孢子懸液接種于含有1μg/ml赭曲霉毒素a的500mlyes培養(yǎng)基中，接種量為2v/v％，于28℃靜置培養(yǎng)14天；培養(yǎng)結(jié)束后，過濾去除菌絲體，所得上清再用0.45μm濾膜過濾，去除殘留霉菌孢子，將500μl所得上清加至離心管中，同時加入濃度為10g/l的赭曲霉毒素a1μl，然后將離心管置于搖床上，37℃150rpm避光保溫反應(yīng)12h。

在本發(fā)明的另一個具體實施方式中，所述應(yīng)用包括以下步驟：

將含10⁵-10⁷個孢子的黑曲霉w35孢子懸液接種于含有1-6μg/ml赭曲霉毒素a的500mlyes培養(yǎng)基中，接種量為0.5-3v/v％，于27℃-29 ℃靜置培養(yǎng)13-19天；培養(yǎng)結(jié)束后，過濾去除菌絲體，向所得上清中加入硫酸銨固體，使硫酸銨的飽和度達(dá)到40％，4℃放置2h，12000rpm離心30min，沉淀用pbs溶液溶解，得溶液i；向溶液i中繼續(xù)加入硫酸銨固體至硫酸銨飽和度達(dá)到60％，4℃放置2h，12000rpm離心30min，沉淀用pbs溶液溶解，得溶液ii；向溶液ii中繼續(xù)加入硫酸銨固體至硫酸銨飽和度達(dá)到80％，4℃放置2h，12000rpm離心30min，沉淀用pbs溶液溶解，得粗酶液；將500μl粗酶液加至離心管中，同時加入終濃度為10-60g/l的赭曲霉毒素a，然后將離心管置于搖床上，36℃-38℃140-160rpm避光保溫反應(yīng)11-13h。

優(yōu)選地，將含約10⁶個孢子的黑曲霉w35孢子懸液接種于含有1μg/ml赭曲霉毒素a的500mlyes培養(yǎng)基中，接種量為2v/v％，于28℃靜置培養(yǎng)14天；培養(yǎng)結(jié)束后，過濾去除菌絲體，向所得上清中加入硫酸銨固體，使硫酸銨的飽和度達(dá)到40％，4℃放置2h，12000rpm離心30min，沉淀用pbs溶液溶解，得溶液i；向溶液i中繼續(xù)加入硫酸銨固體至硫酸銨飽和度達(dá)到60％，4℃放置2h，12000rpm離心30min，沉淀用pbs溶液溶解，得溶液ii；向溶液ii中繼續(xù)加入硫酸銨固體至硫酸銨飽和度達(dá)到80％，4℃放置2h，12000rpm離心30min，沉淀用pbs溶液溶解，得粗酶液；將500μl粗酶液加至離心管中，同時加入終濃度為10g/l的赭曲霉毒素a，然后將離心管置于搖床上，37℃150rpm避光保溫反應(yīng)12h。

本發(fā)明還提供黑曲霉w35在制備赭曲霉毒素a生物降解劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供由黑曲霉w35制備的赭曲霉毒素a生物降解劑，其活性成分為黑曲霉w35的發(fā)酵液、由其發(fā)酵液制備的粗酶液、菌體裂解液或孢子懸液。

本發(fā)明還提供由黑曲霉w35制備的酶制劑。

本發(fā)明進(jìn)一步提供黑曲霉w35在受到赭曲霉毒素a污染的環(huán)境修 復(fù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了能夠降解赭曲霉毒素a的黑曲霉菌株w35，利用該菌的生物代謝、酶系統(tǒng)的作用，可簡單、高效、快速地降解環(huán)境及水體中的赭曲霉毒素a。具體優(yōu)點如下：

(一)黑曲霉w35降解赭曲霉毒素a的效率高、特異性強，且本解毒反應(yīng)為不可逆降解。

(二)利用黑曲霉w35降解赭曲霉毒素a，解毒活性高，作用專一，作用效果溫和。

(三)為后續(xù)研究黑曲霉w35的降解物質(zhì)，以及降解酶的分離、純化、鑒定提供了可能。

(四)提供一種寶貴的可高效降解赭曲霉毒素a的微生物資源。

附圖說明

圖1為本發(fā)明根據(jù)黑曲霉w35的18srdna序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

圖2為本發(fā)明實施例1中菌株w35培養(yǎng)基中ota的含量變化。

圖3為本發(fā)明實施例5中不同反應(yīng)時間對ota降解率的影響。

圖4為本發(fā)明實施例5中不同ph值對ota降解率的影響。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

本發(fā)明中使用的yes培養(yǎng)基中含有15％蔗糖和2％酵母提取物。

實施例1黑曲霉w35的篩選與鑒定

1、赭曲霉毒素a脫毒菌株的篩選

(1)在yes培養(yǎng)基中加入ota標(biāo)準(zhǔn)品，使得培養(yǎng)基中ota的濃度為2μg/ml。

(2)從落葉叢中分離出的霉菌，制備孢子懸液，將含約10⁶個孢子的孢子懸液1ml接種于5ml上述含ota的yes培養(yǎng)基中，在10ml離心管中進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)置兩組平行。對照組接種1ml無菌水。28℃靜置培養(yǎng)10天。

(3)從第4天起，每隔2天提取5ml培養(yǎng)基中的ota，hplc測定ota的含量。

(4)ota提取及hplc檢測：通過離心去除真菌菌落，培養(yǎng)基用2m的鹽酸1ml酸化處理，調(diào)ph至1～2，加入2ml的三氯甲烷，充分振蕩，5000rpm離心10min，取下層三氯甲烷層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。重復(fù)抽提兩次，抽提液50℃氮吹干，4℃儲存用于hplc檢測。

hplc檢測條件為流動相乙腈：水：乙酸＝100:100:1(體積比)；流動相流速1ml/min；c18色譜柱；激發(fā)波長333nm，檢測波長460nm；上樣量為15μl；檢出限為0.02ng。

篩選獲得對ota降解能力最好的菌株，命名為w35。菌株w35培養(yǎng)基中ota的含量變化見圖2。

2、高效降解ota霉菌的鑒定

(1)18srdna鑒定

提取菌株w35的總dna，以其為模板，利用its1、its4為引物進(jìn)行pcr擴增，得到長度為600bp左右的擴增產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物測序，結(jié)果如seqidno:1所示。

將測得的序列與genbank中的序列進(jìn)行比對，菌株w35與黑曲霉(aspergillusniger)菌株s5p3、f5a1等有100％的同源性。從genbank數(shù)據(jù)庫檢索出與所測its片段序列同源性較高的序列，使用mega6.0.6軟件分別構(gòu)建菌株w35的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。

(2)菌株w35的微生物學(xué)特征如下：

黑曲霉屬于半知菌亞門，半知菌綱，殼霉目，杯霉科，黑曲霉屬真菌中的一個常見種。分生孢子梗自基質(zhì)中伸出，直徑15～20μm，長 約1～3mm，黑曲霉壁厚而光滑。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長有成串褐黑色的球狀，直徑2.5～4.0μm。分生孢子頭球狀，直徑700～800μm，褐黑色。蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一。頂囊球形，雙層小梗。分生孢子褐色球形。

(3)菌株w35的理化特征如下：

廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中。是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，可生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等。有的菌株還可將羥基孕甾酮轉(zhuǎn)化為雄烯。生長適溫37℃，最低相對濕度為88％，能引致水分較高的糧食霉變和其他工業(yè)器材霉變。

基于以上信息，將高效降解ota的菌株w35鑒定為黑曲霉。

實施例2黑曲霉w35的培養(yǎng)及其胞外代謝上清的獲得

將含約10⁶個孢子的黑曲霉w35孢子懸液接種于含有1μg/ml赭曲霉毒素a的500mlyes培養(yǎng)基中，接種量為2v/v％，于28℃靜置培養(yǎng)14天。培養(yǎng)結(jié)束后，用4層紗布過濾去除菌絲體，所得上清再用0.45μm濾膜過濾，去除殘留霉菌孢子，所得上清用于赭曲霉毒素降解實驗及硫酸銨分級沉淀。

實施例3黑曲霉w35的胞外上清對赭曲霉毒素a的降解作用

將500μl實施例2所得上清加至2ml離心管中，同時加入終濃度為1μg/ml的赭曲霉毒素a，然后將離心管用錫箔紙包裹，置于搖床上，37℃150rpm避光保溫反應(yīng)12h。以500μl的yes培養(yǎng)基加入同等的ota作為對照組。

首先，向離心管中加入1滴1m的hcl，調(diào)ph至1～2。加入500μl三氯甲烷，5000rpm離心10min，取出下層三氯甲烷層。為避免取出中間層，取出400μl的三氯甲烷。50℃空氣浴氮吹至干，加入500μl100％ 分析純甲醇，過0.22μm的有機系濾膜，避光保存于-20℃。最后，用hplc檢測ota的殘留量。hplc檢測條件同實施例2所述。

赭曲霉毒素a的降解率計算：

以對照中的ota含量為100％，則降解率計算公式為：

降解率(％)＝(1-對照峰面積/樣品峰面積)×100

結(jié)果表明，培養(yǎng)上清中的ota降解率達(dá)78％。

實施例4黑曲霉w35胞外上清硫酸銨分級沉淀產(chǎn)物的獲得

向?qū)嵤├?所得上清中加入硫酸銨固體，使硫酸銨的飽和度達(dá)到40％，4℃放置2h，12000rpm離心30min，沉淀用pbs溶液溶解，得溶液i。

向溶液i中繼續(xù)加入硫酸銨固體至硫酸銨飽和度達(dá)到60％，4℃放置2h，12000rpm離心30min，沉淀用pbs溶液溶解，得溶液ii。

向溶液ii中繼續(xù)加入硫酸銨固體至硫酸銨飽和度達(dá)到80％，4℃放置2h，12000rpm離心30min，沉淀用pbs溶液溶解，得粗酶液。

實施例5黑曲霉w35胞外上清硫酸銨分級沉淀產(chǎn)物對赭曲霉毒素a的降解作用

將500μl粗酶液加至2ml離心管中，同時加入終濃度為1μg/ml的赭曲霉毒素a，然后將離心管置于搖床上，37℃150rpm避光保溫反應(yīng)12h。以500μl的yes培養(yǎng)基加入同等的ota作為對照組。

首先，向離心管中加入1滴1m的hcl，調(diào)ph至1～2。加入500μl三氯甲烷，5000rpm離心10min，取出下層三氯甲烷層。為避免取出中間層，取出400μl的三氯甲烷。50℃空氣浴氮吹至干，加入500μl100％分析純甲醇，過0.22μm的有機系濾膜，避光保存于-20℃。最后，用hplc檢測ota的殘留量。hplc檢測條件同實施例2所述。

赭曲霉毒素a的降解率計算：

以對照中的ota含量為100％，則降解率計算公式為：

降解率(％)＝(1-對照峰面積/樣品峰面積)×100

結(jié)果表明，與對照組相比，粗酶液能降解77.8％的ota。

實施例5不同反應(yīng)時間、ph值對ota降解率的影響以及活性蛋白的初步分離純化

實驗方法：

1.不同反應(yīng)時間對ota降解率的影響

(1)將菌株w35的發(fā)酵液透析以除去培養(yǎng)基中的蔗糖等物質(zhì)。

(2)在500μl發(fā)酵液中，加入ota標(biāo)準(zhǔn)液使ota終濃度為6μg/ml。37℃，200rpm孵育12、24、36、48、60、72h。設(shè)置兩個平行。

(3)加鹽酸調(diào)節(jié)體系的ph值為1～2，加入500μl的三氯甲烷，5000rpm離心10min，取下層三氯甲烷層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

(4)氮吹至干加入40％的甲醇溶液，適當(dāng)稀釋至elisa試劑盒檢測濃度范圍內(nèi)。

2.不同ph值對ota降解率的影響

(1)將菌株w35的發(fā)酵液透析以除去培養(yǎng)基中的蔗糖等物質(zhì)。

(2)設(shè)置體積為500μlph值為6.5、7.5、8.5、9.5的四個不同反應(yīng)體系，加入ota標(biāo)準(zhǔn)液使ota終濃度為6μg/ml。37℃，200rpm孵育48h。設(shè)置兩個平行。

(3)加鹽酸調(diào)節(jié)體系的ph值為1～2，加入500μl的三氯甲烷，5000rpm離心10min，取下層三氯甲烷層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

(4)氮吹至干加入40％的甲醇溶液，適當(dāng)稀釋至elisa試劑盒檢測濃度范圍內(nèi)。

3.降解物質(zhì)的初步分離純化

(1)上柱樣品的準(zhǔn)備

①將菌株w35的發(fā)酵液經(jīng)超濾管或凍干濃縮一定倍數(shù)。

②將發(fā)酵液使用50mm，ph值為7.5磷酸鹽緩沖液多次透析，使發(fā)酵液的培養(yǎng)基完全置換成磷酸鹽緩沖液。

(2)離子交換層析

①首先使系統(tǒng)中充滿濃度為50mm，ph值為7.5的磷酸鹽緩沖液，連接柱子。使用gehealthcare公司生產(chǎn)的q-sepharosefastflow強陰離子交換柱，填料為sepharose。

②用5倍柱體積的上述磷酸鹽緩沖液沖洗柱子，流速為5ml/min。

③用5倍柱體積的洗脫液沖洗柱子，以除去柱子上的雜質(zhì)。

④再用5～10倍柱體積的磷酸鹽緩沖液平衡。

⑤將準(zhǔn)備好的樣品上柱，流速為5ml/min。

⑥使用至少5倍柱體積的磷酸鹽緩沖液沖洗，以去除沒有吸附于柱子的雜蛋白。

⑦線性梯度洗脫：將磷酸鹽緩沖液和洗脫液分別置于梯度混合器的右、左兩側(cè)量杯中，打開閥門，使左、右兩個量杯中的液體在右邊的量杯中混合均勻，混合后的氯化鈉呈線性梯度，終濃度為0.75mol/l。用10～20個柱體積洗脫柱子，分步收集器收集洗脫液。

⑧柱子重生：用5倍柱體積的洗脫液沖洗柱子，然后用5～10倍柱體積的磷酸鹽緩沖液沖洗，封存柱子，4℃保存。

4.分離物質(zhì)的活性驗證

(1)取出分布收集到的每管液體各500μl，加入ota標(biāo)準(zhǔn)液使ota終濃度為6μg/ml。37℃，200rpm孵育48h。

(2)加鹽酸調(diào)節(jié)體系的ph值為1～2，加入500μl的三氯甲烷，5000rpm離心10min，取下層三氯甲烷層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

(3)氮吹至干加入40％的甲醇溶液，適當(dāng)稀釋至elisa試劑盒檢測濃度范圍內(nèi)。

結(jié)果分析：

1、不同反應(yīng)時間對ota降解率的影響

從結(jié)果可以看出，隨著時間的變化，ota的濃度逐漸降低，降解率隨之升高。與ck相比，12h內(nèi)發(fā)酵液可以降解37.6％的ota，24h 內(nèi)可以降解60.9％的ota，36h內(nèi)可以降解68.9％的ota，48h內(nèi)可以降解75.5％的ota，60h內(nèi)可以降解81.2％的ota，72h內(nèi)可以降解83.6％的ota，ota的濃度及降解率如圖3所示。ota濃度也隨時間的變化不斷減少，從0h的4.22μg/ml降低到72h的0.69μg/ml，48h后ota濃度趨于平穩(wěn)。

2、不同ph值對ota降解的影響

ph值為6.5、7.5、8.5、9.5的四個不同反應(yīng)體系中的ota均有不同程度地減少，降解率的結(jié)果如圖4所示。從結(jié)果可以看出，ph值為6.5時，降解率為56.0％；ph值為7.5時，降解率最高，達(dá)到93.53％；ph值為8.5時，降解率為90.6％；ph值為9.5時，降解率為73.9％。整體來看，該在偏堿性條件下降解活性較高。

以上實驗結(jié)果表明，黑曲霉菌株w35對赭曲霉毒素a具有良好的降解作用，對于商品化飼料中赭曲霉毒素a的降解以及在食品、農(nóng)業(yè)的商業(yè)化ota脫毒方面應(yīng)用前景廣闊。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。