本發(fā)明屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煤層厭氧產(chǎn)甲烷菌群的菌種保藏方法。

背景技術(shù)：

菌種作為從事微生物學(xué)研究的基本材料，是國家的重要資源。特別是對于利用微生物進行相關(guān)的生產(chǎn)，更是離不開菌種。故菌種保藏在微生物學(xué)研究及實際應(yīng)用中必不可少。

目前，菌種保藏的方法主要有：甘油冷凍保藏法、液體石蠟保藏法、真空冷凍干燥保藏法、冷凍保藏法及載體保藏法等。生物煤層氣的產(chǎn)生是由多種厭氧混合菌共同作用代謝煤基質(zhì)產(chǎn)生的，故需保藏的作用混合菌群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定性非常重要。

煤層氣(coalbedmethane,cbm)是儲存在煤層中、自發(fā)產(chǎn)生的一種非常規(guī)天然氣，其主要成分為甲烷，并含有少量的co、co2、n2、h2s、h2等氣體，以吸附態(tài)為主、游離態(tài)為輔儲存在煤層基質(zhì)表面或空隙中，是一種非常優(yōu)質(zhì)的清潔能源。目前，煤層氣的開發(fā)及利用都受到了世界各國的重視，我國也大力提倡開發(fā)及利用煤層氣。煤層氣可分為熱成因煤層氣和生物成因煤層氣。生物成因煤層氣又可分為原生生物成因煤層氣和次生生物成因煤層氣，原生生物成因煤層氣形成于煤化作用的早期階段，難于大量保存，目前探測到的生物成因煤層氣多為次生生物煤層氣，次生生物煤層氣是由產(chǎn)甲烷菌等厭氧菌（包括細菌及古菌等）代謝煤或煤層物質(zhì)產(chǎn)生的以甲烷為主要成分的氣體。目前，次生生物煤層氣的基礎(chǔ)地質(zhì)研究及勘探開發(fā)已經(jīng)成為煤層氣地質(zhì)界的研究熱點。在微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，實驗?zāi)M次生生物煤層氣的產(chǎn)生被廣泛應(yīng)用于研究生物成因煤層氣生成的機理中。大量煤層本源菌群的生物氣生成模擬實驗都證實了煤層氣井中存在完整的產(chǎn)甲烷菌群生態(tài)系統(tǒng)。但煤層中貧瘠的營養(yǎng)條件限制了它們的活性，直接保藏煤層中的產(chǎn)甲烷菌群，其用于后續(xù)的生物產(chǎn)氣模擬實驗，產(chǎn)氣效果不理想?，F(xiàn)有的生物產(chǎn)氣研究實驗大都建立在對本源產(chǎn)甲烷菌群的富集馴化試驗基礎(chǔ)之上，即煤層本源菌群經(jīng)厭氧富集馴化培養(yǎng)后，利用培養(yǎng)到的本源微生物進行生物產(chǎn)氣模擬實驗。如何對富集馴化到的厭氧產(chǎn)甲烷菌群進行菌種保藏對于后續(xù)模擬產(chǎn)氣實驗中研究生物成因煤層氣的產(chǎn)氣機理及獲得較穩(wěn)定的高甲烷產(chǎn)量具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有菌種保藏方法無法滿足煤層氣生成的產(chǎn)甲烷菌群的菌種短期和長期保藏，且能夠保持菌種高產(chǎn)甲烷氣的活性，提供了一種煤層厭氧產(chǎn)甲烷菌群的菌種保藏方法。

本發(fā)明由如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種煤層厭氧產(chǎn)甲烷菌群的菌種保藏方法，包括如下步驟：

（1）篩選待保藏菌種：在煤層氣產(chǎn)氣井排水口采集煤層產(chǎn)出水，對產(chǎn)出水進行產(chǎn)甲烷菌群富集馴化培養(yǎng)，甲烷生成量達到30%以上的菌種培養(yǎng)液作為待保藏菌液；

（2）短期保藏：步驟（1）中獲得的待保藏菌液加入到5ml的厭氧管中，然后加入等體積的滅菌甘油/除氧l-半胱氨酸溶液，將其混勻后保藏；

（3）長期保藏：100l的保藏罐中加入1/5容積的無煙煤塊煤和50l滅菌的保藏營養(yǎng)液，保藏營養(yǎng)液在加入保藏罐前加入100ml濃度為20%的無菌l-半胱氨酸和50.6mg的刃天青，然后向保藏罐中加入500ml步驟（1）中獲得的經(jīng)富集馴化培養(yǎng)的菌液，保藏罐中持續(xù)通入純n2，2h后間斷取樣，直至培養(yǎng)基顏色接近無色停止通入n2；室溫密閉保藏，每周利用排水集氣法收集保藏罐頂空的氣體進行氣相色譜分析，當氣相色譜檢測分析甲烷相對含量降低至7%-15%時，向保藏罐內(nèi)取出25l的培養(yǎng)液，然后再向罐內(nèi)加入25l含終濃度為0.04%的l-半胱氨酸和0.0001%的刃天青的保藏營養(yǎng)液。

步驟（2）中所述甘油/l-半胱氨酸溶液中：甘油的質(zhì)量分數(shù)為30%，l-半胱氨酸的終濃度為0.04%；

步驟（3）中保藏營養(yǎng)液配方為：（g/l）：酵母粉2g，k2hpo42.9g，kh2po41.5g，nh4cl1.8g，mgcl20.4g。

步驟（3）中l(wèi)-半胱氨酸的終濃度為0.04%，刃天青的終濃度為0.0001%。步驟（2）中短期保藏溫度為4℃或25℃，保藏時間為15-30天；步驟（3）的保藏溫度為室溫。

本發(fā)明采用甘油/l-半胱氨酸進行短期保藏，適合小量短期保藏；長期保藏適合大量長期保藏，且保藏效果較短期保藏好，保藏的菌種能長時間保持活性；長期保藏中用到的無煙煤塊可以為保藏的菌種提供生長必需的碳源、可以作為產(chǎn)甲烷的底物及可作為菌種的粘附介質(zhì)；l-半胱氨酸可以為保藏的菌種提供厭氧環(huán)境；刃天青的加入可以幫助觀察培養(yǎng)基內(nèi)的厭氧情況；用到的保藏營養(yǎng)液及據(jù)甲烷相對含量降低補加的保藏營養(yǎng)液可以使保藏的菌種維持在較高的活性。

本發(fā)明在長期保藏時，菌種保藏體系中加入無煙煤塊煤，可以為所要保藏的菌種提供生長必須的碳源，同時也作為產(chǎn)甲烷的底物，也可以作為菌種粘附介質(zhì)；而保藏營養(yǎng)液的加入，能夠使得菌種活性維持在較高水平，而間歇性檢測菌種所產(chǎn)甲烷的相對含量，當含量降低后繼續(xù)補加保藏營養(yǎng)液，使得菌種活性隨著保藏時間的延長而不降低，l-半胱氨酸可以為菌種提供厭氧環(huán)境，利于其生長繁殖。

本發(fā)明模擬煤層環(huán)境條件，優(yōu)化保藏厭氧產(chǎn)甲烷菌群的方法，使得保藏的產(chǎn)甲烷菌群在后續(xù)的生物產(chǎn)氣模擬實驗中始終保持較高的活性及較穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)，以得到較理想的甲烷產(chǎn)量。同時本發(fā)明短期保藏所需溫度為4℃或25℃，長期保藏溫度為室溫即可，因此不需要超低溫設(shè)備等，不需特殊設(shè)備，方便快捷，適合不同量菌種長短期保藏，同時使菌種的活性保持相對穩(wěn)定且較高，菌體保藏后存活率高，活性恢復(fù)迅速，對于大量菌體保藏經(jīng)濟方便，為生產(chǎn)、試驗節(jié)約成本。

具體實施方式

實施例1：一種煤層厭氧產(chǎn)甲烷菌群的菌種保藏方法，包括如下步驟：

（1）篩選待保藏菌種：根據(jù)山西晉城無煙煤礦業(yè)集團有限責任公司煤與煤層氣共采國家重點實驗室前期實驗經(jīng)驗，在煤層氣產(chǎn)氣井排水口采集煤層產(chǎn)出水，對產(chǎn)出水進行產(chǎn)甲烷菌群富集馴化培養(yǎng)，甲烷生成量達到30%以上的菌種培養(yǎng)液作為待保藏菌液；

（2）短期保藏：步驟（1）中獲得的待保藏菌液加入到5ml的厭氧管中，然后加入等體積的滅菌甘油/除氧l-半胱氨酸溶液，甘油/l-半胱氨酸溶液中：甘油的質(zhì)量分數(shù)為30%，l-半胱氨酸的終濃度為0.04%；將其混勻后置于-80℃低溫保藏，15-30天后活化復(fù)蘇，觀察結(jié)果；

（3）復(fù)蘇方法：從-80℃冰箱中取出厭氧管，立即放置38℃-40℃水浴中快速復(fù)蘇并適當搖動，直到內(nèi)部冰晶全部溶解為止，約需50-100秒。溶解后的菌液直接用作接種劑進行生物氣產(chǎn)氣實驗。

實施例2：保藏方法同實施例1所述保藏方法，置于4℃保藏，15-30天后直接作為接種劑進行生物氣產(chǎn)氣實驗，觀察結(jié)果。

實施例3：保藏方法同實施例1所述保藏方法，置于25℃保藏，15-30天后直接作為接種劑進行生物氣產(chǎn)氣實驗，觀察結(jié)果。

實施例4：一種煤層厭氧產(chǎn)甲烷菌群的菌種保藏方法，篩選待保藏菌種方法同實施例1所述方法；獲得的待保藏菌液加入到5ml的厭氧管中，然后加入等體積滅菌的保藏營養(yǎng)液、再加入終濃度為0.04%的除氧l-半胱氨酸，其中保藏營養(yǎng)液配方為：（g/l）：酵母粉2g，k2hpo42.9g，kh2po41.5g，nh4cl1.8g，mgcl20.4g；上述混合均勻后25℃保藏，15-30天后直接作為接種劑進行生物氣產(chǎn)氣實驗，觀察結(jié)果。

實施例5：一種煤層厭氧產(chǎn)甲烷菌群的菌種保藏方法，包括如下步驟：

（1）篩選待保藏菌種：在煤層氣產(chǎn)氣井排水口采集煤層產(chǎn)出水，對產(chǎn)出水進行產(chǎn)甲烷菌群富集馴化培養(yǎng)，甲烷生成量達到30%以上的菌種培養(yǎng)液作為待保藏菌液；

（2）長期保藏：100l的保藏罐中加入1/5容積的無煙煤塊煤、50l滅菌的保藏營養(yǎng)液，保藏營養(yǎng)液加入保藏罐前于保藏營養(yǎng)液中加入100ml的濃度為20%的l-半胱氨酸及50.6mg的刃天青，向保藏罐中加入500ml步驟（1）中獲得的經(jīng)富集馴化培養(yǎng)的菌液，向保藏罐中持續(xù)通入高純n2，2h后間斷取樣，直至培養(yǎng)基顏色接近無色停止通入n2。室溫密閉保藏罐保藏2年；保藏營養(yǎng)液配方為：（g/l）：酵母粉2g，k2hpo42.9g，kh2po41.5g，nh4cl1.8g，mgcl20.4g；l-半胱氨酸的終濃度為0.04%。

在密閉保藏的2年內(nèi)，每周利用排水集氣法收集保藏罐頂空的氣體進行氣相色譜分析，當氣相色譜檢測分析甲烷相對含量降低至7%-15%時，向保藏罐內(nèi)取出25l的培養(yǎng)液，然后再向罐內(nèi)加入25l的保藏營養(yǎng)液（含終濃度為0.04%的l-半胱氨酸和0.0001%的刃天青）。

實驗例1：各保藏方法保藏的菌種進行活力檢測：

培養(yǎng)基準備：向1l密閉培養(yǎng)瓶中加入250g小塊無煙煤、350ml保藏營養(yǎng)液及0.408mg刃天青，121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘。

在yqx-п型厭氧手套箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）內(nèi)向1l密閉培養(yǎng)瓶中加入800μl無菌的20%l-半胱氨酸，然后向密閉培養(yǎng)瓶中持續(xù)通入高純n2，直至培養(yǎng)基顏色近無色。

在厭氧手套箱中，上述密閉培養(yǎng)瓶內(nèi)直接接種保藏15-30天后的實施例1-4所述保藏菌種，接種量為50ml菌液；實施例5所述保藏菌種，先用無菌培養(yǎng)瓶在保藏罐內(nèi)接取50ml菌液，然后以此為接種劑在厭氧手套箱內(nèi)將其接種于1l的密閉培養(yǎng)瓶內(nèi)。

接種好的密閉培養(yǎng)瓶于室溫下靜置培養(yǎng)1-2個月，期間每周抽取培養(yǎng)瓶頂空的氣體進行氣相色譜分析，在測樣品甲烷含量時，進行甲烷標樣測定。根據(jù)標樣甲烷的保留時間進行定性，根據(jù)甲烷標樣濃度已知，標樣及樣品甲烷的峰面積由氣相色譜測得，根據(jù)公式：甲烷標樣濃度/峰面積=樣品中甲烷濃度/峰面積，從而計算樣品中甲烷氣的濃度，依此來獲得甲烷生成相對含量，以甲烷相對含量作為混合菌群保藏活力的衡量指標，即甲烷生成量越高，保藏的菌種活性越高。

所有實驗均在山西晉城無煙煤礦業(yè)集團有限責任公司煤與煤層氣共采國家重點實驗室進行，實驗結(jié)果見表1，由表1結(jié)果可知，4℃及25℃條件下進行的短期甘油菌種保藏，保藏的菌種活性較低，產(chǎn)氣實驗中有甲烷氣生成。-80℃保藏的菌種不利于后續(xù)的產(chǎn)氣實驗。實施例4所述方法保藏的菌種在產(chǎn)氣實驗中沒有甲烷生成，只生成h2。實施例5所述方法保藏的菌種在產(chǎn)氣實驗中甲烷產(chǎn)氣量最高，是最適合保存厭氧產(chǎn)甲烷菌群的一種菌種保藏方法。

顯然，采用甘油/l-半胱氨酸進行短期保藏，適合小量短期保藏；而實施例5所述方法進行菌種中長期保藏，適合大量進行長期保藏，并且可長時間維持微生物的活力，具有較長的保藏期。