本發(fā)明涉及一種糞便類樣本的保存方法、保存用溶液、制備方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

人體微生物是人體的有機(jī)組成部分，數(shù)量龐大，干重約占人體總重1％至2％，且種類多樣(包括細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌和病毒等)，定植于胃腸道、口腔、皮膚、泌尿生殖道等，所編碼的基因數(shù)量是人體自身基因數(shù)量的50～100倍，相當(dāng)于人體的“第二個基因組”。人身上有100萬億個細(xì)菌，重約3斤。

我們生活在被細(xì)菌環(huán)繞的環(huán)境中，每天與細(xì)菌打交道。人體正常的菌群種類有1000余種，數(shù)量100萬億個(人體細(xì)胞僅10萬億個)，平均重約1.5千克，相當(dāng)于肝臟重量。這些細(xì)菌主要分布于腸道、皮膚、口腔、呼吸道、泌尿生殖系統(tǒng)等部位，其中絕大多數(shù)定值腸道。腸道微生物主要有細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌及病毒，其中99％以上為細(xì)菌，數(shù)量約有100億—10000億個。

《科學(xué)》雜志曾經(jīng)發(fā)表文章，指出腸道微生物是提供人體營養(yǎng)調(diào)控腸道上皮細(xì)胞、先天性隱約的不可缺少的器官。把腸道微生物當(dāng)作人體器官，所以它是我們的朋友，是人體重要的組成部分。

許多學(xué)者認(rèn)為人本身就是人體細(xì)胞和細(xì)菌共同組合而成的共生生物體。它們與人體共生，以人體攝入的食物以及腸道分泌物為食，合成必需氨基酸，維生素，短鏈脂肪酸等重要物質(zhì)進(jìn)入人體，促進(jìn)宿主健康；相反，其中一些病原菌也分泌有害物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)，損害宿主的健康。由于腸道菌群的復(fù)雜和多樣性，人類對其結(jié)構(gòu)多樣性和功能重要性一直缺乏足夠的認(rèn)知。直至近幾年，隨著第二代測序等技術(shù)的進(jìn)步，微生物組的黑盒才得以打開，并借助無菌動物的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了腸道微生物與大量的疾病密切相關(guān)，甚至在許多疾病中扮演了病因的角色。

事實(shí)上僅腸道就有超過100萬億個不同種類的細(xì)菌,這些細(xì)菌中很多幫助我們降解食物和發(fā)揮重要的免疫作用。腸道的大多數(shù)微生物(包括細(xì)菌)來自于出生時(shí)母親的產(chǎn)道；如果是剖腹產(chǎn)出生的，微生物來自于你的皮膚和周圍環(huán)境。飲食、抗生素、遺傳和應(yīng)激等多種因素都會對微生物有影響。很早人們就知道，大腦能夠影響腸道的功能，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明大腦和腸道是雙向作用的。近來的研究證明腸道微生物能夠影響宿主的狀態(tài)：肥胖、社會行為缺陷、帕金森病和焦慮。也就是說微生物可以影響人的情緒。

人體腸道內(nèi)的微生物中，超過99％都是細(xì)菌，存活著的數(shù)量大約有100兆個，有500～1000個不同的種類。這些數(shù)目龐大的細(xì)菌大致可以分為三個大類：有益菌、有害菌和中性菌。

①主要(優(yōu)勢)菌群：指腸道菌群中數(shù)量大或種群密集度大的細(xì)菌，包括類桿菌屬、優(yōu)桿菌屬、雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬和梭菌屬等專性厭氧菌，通常屬于原籍菌群。優(yōu)勢菌群是對宿主發(fā)揮生理功能的菌群，在很大程度上影響著整個菌群的功能，決定著菌群對宿主的生理病理意義。

②次要菌群：主要為需氧菌或兼性厭氧菌，如大腸桿菌和鏈球菌等，流動性大，有潛在致病性，大部分屬于外籍菌群或過路菌群。乳桿菌在數(shù)量上歸為次要菌群，在回腸中含量較高，但是其具有較為重要的功能，因此在功能上歸屬于優(yōu)勢菌群。

優(yōu)勢菌群與微生境的特征密切相關(guān)，以厭氧菌為主的優(yōu)勢菌群，一般生存在清除速率較低、營養(yǎng)豐富的微生境，如結(jié)腸，所以菌群密集度和多樣性高；而兼性或需氧菌群一般生活在清除速率高的微生境，如小腸近端，其菌群密集度和菌群多樣性較低，由于菌群密集度低，很難稱得上是“優(yōu)勢菌群”；在酸性微生境中，耐酸、產(chǎn)酸的細(xì)菌成為優(yōu)勢菌群。微生境的改變，可使菌群中的優(yōu)勢菌群發(fā)生替換，如便秘時(shí)大便優(yōu)勢菌群主要是革蘭陰性厭氧菌，慢性腹瀉時(shí)常見革蘭陽性桿菌為優(yōu)勢菌群，而在嚴(yán)重急性腹瀉時(shí)大便中的優(yōu)勢菌群為致病性細(xì)菌或某些兼性/需氧細(xì)菌。在腸道中，盡管專性厭氧菌是主要菌群，占據(jù)優(yōu)勢，但這些菌群又依賴于需氧菌或兼性厭氧菌等次要菌群的存在，因?yàn)楹笳咴谠鲋尺^程中消耗氧氣，保證前者的生長條件。一個生理性組合的腸道菌群是有益的，而病理性組合的腸道菌群是有害的。

由于腸道微生物存在于人的腸道內(nèi)，因此最便捷，也是目前采用的最常規(guī)的方式是研究人體排出的糞便中的微生物，以此代表大腸內(nèi)的共生微生物。糞便采集之后，通過提取細(xì)菌的總dna，pcr擴(kuò)增出核糖體16srrna可變區(qū)，測序，然后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可以了解糞便中的細(xì)菌構(gòu)成，進(jìn)一步研究其和人體疾病之間的相關(guān)性。

由于糞便離體后，其環(huán)境也發(fā)生了變化，主要是從無氧環(huán)境轉(zhuǎn)變成有氧環(huán)境，其中提供微生物代謝的能量來源也進(jìn)入只消耗而不補(bǔ)充的狀態(tài)。與此同時(shí)，其中的部分細(xì)菌還保持了部分活性，繼續(xù)代謝和生長，而由于環(huán)境的變化，不同細(xì)菌其增長與死亡的速率已經(jīng)不同于排便前。因此，需要對糞便進(jìn)行一些保存措施，盡量將其中微生物的構(gòu)成穩(wěn)定在剛剛離體時(shí)的狀態(tài)，從而最好的代表大腸中的共生微生物。目前采用的保存方法為采集糞便后立即凍存在-20℃或者更低的溫度中。由于細(xì)菌在低溫狀態(tài)下代謝速率極大的降低，因此可以在一段的時(shí)間內(nèi)維持糞便中細(xì)菌的構(gòu)成。

就效果而言，將糞便樣的樣品凍存在-20℃或者更低的溫度中是可以在一段時(shí)間內(nèi)(一周左右)保持糞便內(nèi)的細(xì)菌構(gòu)成不發(fā)生顯著性的變化。然而其最大的缺陷則是凍存條件在某些特定情況下是無法實(shí)現(xiàn)的，例如外出取樣者，采得的糞便樣本需要攜帶一段時(shí)間才可以拿回實(shí)驗(yàn)室凍存，或者取樣者與實(shí)驗(yàn)室并不在同一城市，需要采樣后通過快遞或者其它常規(guī)運(yùn)輸方式(非冷鏈運(yùn)輸)寄送到實(shí)驗(yàn)室后才可以完成凍存，而在此過程中，微生物的構(gòu)成可能己經(jīng)發(fā)生了巨大的改變。

傳統(tǒng)的檢測糞便微生物菌群的方法中，需要一邊需要將采集的糞便樣品冷卻的同時(shí)一邊需要分離細(xì)菌遺傳物質(zhì)。如果在不冷卻的情況下進(jìn)行該分離操作，由于糞便的變質(zhì)等而無法得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。因此，為了有效地防止糞便的變質(zhì)，在采集糞便后迅速進(jìn)行冷卻很重要。然而，在遇到例如出診在外或者在顧客家中無法進(jìn)行糞便采集后迅速冷卻等情況下，有效保存原始樣本的新鮮度將變得無法實(shí)現(xiàn)。

另外，為了防止糞便試樣的變質(zhì)而考慮到將糞便試樣冷凍，但在檢查前必須使冷凍的糞便試樣融解，因此操作變得繁雜。在傳統(tǒng)的方法中，通過添加殺菌劑等，從而不需要進(jìn)行冷卻操作就能夠在室溫下調(diào)制和保存糞便樣品，但存在從糞便中分離大腸脫落部分細(xì)菌的操作繁雜的問題。另外，被殺菌劑等破壞的細(xì)菌來源的核酸分解酶、蛋白分解酶會導(dǎo)致從大腸桿菌來源的核酸等的降解，因此，目標(biāo)細(xì)菌的遺傳物質(zhì)檢測的精度會降低。

然而目前國內(nèi)外尚無類似的常溫保存技術(shù)，因此發(fā)明糞便樣的細(xì)菌保存液，來解決含菌樣本比如糞便、腸道內(nèi)容物等常溫運(yùn)輸保存和菌群固化的問題迫在眉睫，該細(xì)菌保存液的發(fā)明制備可以有效解決含菌樣本常溫運(yùn)輸保存和菌群豐富度變化的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供一種使采樣者在任何時(shí)候都可以進(jìn)行采樣和樣品的保存、能夠用于糞便樣本的長途運(yùn)輸、保持菌群豐富度和遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的糞便類樣本的保存方法、保存用溶液、制備方法及應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種糞便類樣本保存用溶液，其用于與糞便樣本混合，其特征在于：以水溶性有機(jī)物作為主要成分，上述水溶性有機(jī)物選自水溶性醇、酮類、醛類及砜類的一種或幾種。其中水溶性醇以及部分砜類都是良好的低溫凍存用的保存劑，而發(fā)明中涉及到的主要成分二甲基亞砜是良好的低溫凍存保護(hù)劑，特定濃度的二甲基亞砜保存的新鮮樣品可以在不超過37度的高溫天氣下保存一天，或者在25度室溫下保存兩周；或者4度冰箱存放一個月；或者負(fù)20度長期保存而使rna保持完整免受降解。

所述保存用溶液的溶劑為緩沖溶液，水溶性有機(jī)物溶于緩沖溶液中，緩沖液中含有低濃度的鹽離子，研究表明高濃度nacl會妨礙樣品正常形成顆粒沉淀，因此在去除保存液之后，樣品還必須磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗。因此為了解決在樣品檢測實(shí)驗(yàn)中會樣品清洗的問題。本發(fā)明涉及到的保存液中nacl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)定義為2％-5％，處于低鹽的水平。

所述糞便類樣本保存用溶液的ph為7.0～7.4。所述水溶性有機(jī)物可替換為自由直鏈脂肪酸、二羧酸、氨基酸、芳香族或雜環(huán)的多元羧基酸中的一種或幾種。這些水溶性有機(jī)物可以迅速滲透到組織或其他生物樣本中，穩(wěn)定并保護(hù)rna完整而不被降解，確保下游分析得到的數(shù)據(jù)真實(shí)反應(yīng)樣品的表達(dá)信息。例如醇類的代表乙醇是一種便宜的保存液成分，申請人研究證實(shí)這種物質(zhì)即便是在室溫下，也能長時(shí)間里穩(wěn)定地保存糞便樣品中的微生物菌落結(jié)構(gòu)。

但是乙醇是可燃的，不能用于樣品運(yùn)輸，還有更重要的是，添加乙醇的低溫凍存保護(hù)劑會導(dǎo)致凍存的樣品比新鮮采集時(shí)的樣品，部分菌群數(shù)量增加。因此在本發(fā)明中通過添加一定比例的氯丁醇，起到菌群穩(wěn)定劑的作用。

優(yōu)選的，所述保存用溶液的成分如表1所示：其中w/v為質(zhì)量體積比，w/v的單位是g/ml。

表1保存用溶液的成分

且所述的保存用溶液的ph值為7.0～7.5，滲透壓為260～300mosm/l。

前述的保存用溶液的制備方法，按照配方稱取各組成成分，用無菌去離子水溶解后，通過0.22um的濾膜過濾或高壓滅菌，室溫保存即得保存用溶液。

本發(fā)明也旨在保護(hù)上述的保存用溶液在保存糞便細(xì)菌、保持細(xì)菌遺傳物質(zhì)穩(wěn)定中的應(yīng)用。

一種糞便類樣本的保存方法，將采集的糞便樣本與所述的糞便樣本保存用溶液混合。

保存糞便細(xì)菌的具體方法如下：

(1)采集至少0.5g新鮮的糞便樣品；

(2)在2分鐘時(shí)間內(nèi)使用所述的保存用溶液將糞便樣品在室溫下密封，糞便樣品不宜暴露在空氣中過久，將糞便樣品浸泡在保存用溶液中，所述的糞便樣本和保存用溶液用量的比例為1:3(w/v)。

本發(fā)明的糞便樣保存用溶液包括如下質(zhì)量體積比的組分二甲基亞砜(dmso)10.0％～20.0％(w/v)、edta-二鈉(edtana2)3.0％(w/v)、檸檬酸鈉(na3c6h5o7)1.5％(w/v)、氯化鈉2.0％(w/v)和氯丁醇(c4h9clo)0.5％(w/v)，其溶劑為水，ph值為7.0～7.5，在室溫條件下就能夠長時(shí)間的對類糞便的樣本中的dna進(jìn)行有效保存，有效解決了現(xiàn)有技術(shù)采集糞便樣本dna的保存時(shí)間短，且需要低溫保存運(yùn)輸?shù)娜毕?；本發(fā)明成本低廉，配制方法簡單快捷，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：按照配方配置保存液，將采集的糞便直接置于保存液中，無需凍存，即可達(dá)到穩(wěn)定其中微生物構(gòu)成的作用。使用該配方保存糞便樣本可以在常溫下達(dá)到凍存糞便樣本的效果，從而使采樣者在任何時(shí)候都可以進(jìn)行采樣和樣品的保存，也能夠用于糞便樣本的長途運(yùn)輸。本發(fā)明所述的糞便樣的保存液中樣本的dna收獲率高，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，確保樣本中菌群的種類和豐度和新鮮樣本的菌群豐度保持一致，樣本儲存在此保存液中可以常溫運(yùn)輸，無需冷凍，常溫保存可達(dá)2周時(shí)間。

附圖說明

圖1.根據(jù)配方設(shè)計(jì)11種不同的量(二甲基亞砜的比例為0％-100％，其余的成分保持一致，dmso的量由水來替代)的量來測定經(jīng)不同比例的dmso的量保存的隨機(jī)志愿者的糞便樣品中的總dna的保存效果；

圖2.經(jīng)5種不同種方式(具體方式如實(shí)施例2中描述)保存的四位隨機(jī)志愿者糞便樣品的菌群的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2-7中多個志愿者的隨機(jī)抽樣在四種不同條件下的dna回收效率的統(tǒng)計(jì)圖；其中圖3a為四名志愿者的樣品分別在五種配方溶液凍存一周的dna回收效率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，其中圖3b為相同的樣本在樣品凍存2周后的檢測結(jié)果；圖3c和圖3d分別為樣品常溫放置一周及樣品常溫放置兩周后的遺傳物質(zhì)的變化統(tǒng)計(jì)情況；

圖4.經(jīng)六種不同方式保存的四位隨機(jī)志愿者糞便樣品的門水平菌群構(gòu)成的異同性分析結(jié)果；

圖5.經(jīng)六種不同方式保存的四位隨機(jī)志愿者糞便樣品的綱水平菌群構(gòu)成的豐度分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

本發(fā)明涉及一種糞便保存液的配方，按照配方配置保存液，將采集的糞便直接置于保存液中，無需凍存，即可達(dá)到穩(wěn)定其中微生物構(gòu)成的作用。使用該配方保存糞便樣本可以在常溫下達(dá)到凍存糞便樣本的效果，從而使采樣者在任何時(shí)候都可以進(jìn)行采樣和樣品的保存，也能夠用于糞便樣本的長途運(yùn)輸。按照以上配方稱取各成分，無菌去離子水溶解后，高壓滅菌，室溫保存。本發(fā)明還涉及使用所述保存液進(jìn)行糞便細(xì)菌保存的方法，步驟如下:采集至少200ug的新鮮糞便樣品，室溫下密封，避光，使用本發(fā)明保存液浸泡類糞便樣品(0.5g糞便需要約2ml保存液)。

實(shí)施例1

1、糞便樣本保存液的配制(共四種保存液)：

(1)按下表2和表3中的數(shù)據(jù)稱取各組分，并將edta-二鈉完全溶解制成母液。

(2)在水中加入其他組分并充分溶解后，加入上述母液充分混合。

(3)用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至下表中的溶液終ph值后，加去離子水定容至配方所需的體積。

實(shí)施例2.

對上述四個志愿者的共4份糞便樣本的具體處理過程如下所述:

1.糞便dna提取:

提取步驟:

(1)取糞便裂解液1.2ml加入到2ml己滅菌的thermo的ep管中，并放置冰上操作；

(2)稱量500mg的糞便樣本到每個thermo的ep管中，直至樣本充分裂解均勻；

(3)在常溫下最高轉(zhuǎn)速離心5min；

(4)取上清液至新的2mlthermo的ep管中，重復(fù)離心一次，除去糞便樣本中的碎顆粒物，將上清液至新的2mlthermo的ep管中；

(5)稱取200mgbsa加入到每個樣本中，迅速用渦旋儀震蕩搖勻直至bsa完全懸浮，常溫下孵化懸浮物5min，使其一些抑制因子被bsa吸收；(的在常溫下最高速離心5min，除去糞便顆粒及結(jié)合到bsa上的抑制因子；

(7)離心結(jié)束，迅速取出上清液至新的2mlthermo的ep管中，棄沉淀物；

(8)再一次最高速離心5min，取上清液至新的2mlthermo的ep管中；

(9)在液體中加入濃度為20mg/ml蛋白酶k，58℃水浴消化反應(yīng)1h；

(10)將樣品冰浴5min冷卻至常溫，加入200ul蛋白沉淀液，震蕩渦旋儀劇烈震蕩，再次冰浴5min；

(11)最高速離心5min，沉淀蛋白；

(12)取上清液加入至新的2mlthermo的ep管中；

(13)在上清液中加入dna硅膠膜結(jié)合液，上清液與dna硅膠膜結(jié)合液的體積比為1:1.5；

(14)取出600ml混合物加入到2mlthermo的ep管中的純化柱中，常溫下孵化5min，蓋上蓋子，5000rpm/min離心1min，棄去濾出液；

(15)重復(fù)步驟(14)兩次，使所有的裂解產(chǎn)物都濾過純化柱底部的硅膠膜；

(16)將硅膠柱放在新的2mlthermo的ep管中，棄去含有濾出液的thermo的ep管；

(17)輕輕打開純化柱蓋子，加入硅膠膜洗滌液，蓋上蓋子，5000rpm/min離心1min，棄去含有濾出液的thermo的ep管。

2.樣品來源及分組保存方式

首先采集4位志愿者的糞便樣本。每個志愿者的樣品各采集5份，分別對樣品做以下5種不同處理：

1)立即處理:采樣至少0.2g糞便樣品立即進(jìn)行dna提取，核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增等處理。

2)凍存一周處理:采集至少0.2g糞便樣品，-20℃下密封直接凍存，不添加保存液，保存一周，然后一周后再進(jìn)行dna提取，核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增等處理。

3)表2的三種配方常溫避光保存一周:采集至少0.2g糞便樣品，室溫下25℃密封，避光，使用本發(fā)明保存配方(配方見表2)保存一周，然后再進(jìn)行dna提取，核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增等處理。

4)對照配方2(具體配方見表3)保存一周:室溫下25℃密封，避光，使用對照保存配方(詳細(xì)配方參見表3)，保存一周后，然后再進(jìn)行dna提取，核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增等處理。

5)不做任何保存一周:室溫下25℃密封，避光保存一周，然后再進(jìn)行dna提取，核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增等處理。

所述三種實(shí)驗(yàn)組的保存液配方(保存液1-3)的見表2，所述對照保存液配方(保存液-c)的見表3。

具體測試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示：四個志愿者的糞便樣品，經(jīng)過上述五種方式處理后(處理方式1-4代表糞便樣品在四種不同保存液常溫放置1周，5編號表示樣品密封常溫避光保存一周)，直觀的比較四個樣本的凝膠成像的結(jié)果，可以明確的得出以下結(jié)論：與常溫避光儲存一周相比較，在添加保存液后(共四種保存液)明顯的提高了dna的存儲時(shí)間和效率，盡管從結(jié)果上看不出各類保存液的對菌群豐度的影響，從宏觀證明在常溫放置時(shí)保存液有利于糞便類樣品中的dna的長時(shí)效的穩(wěn)定性。

表2.實(shí)驗(yàn)組三種保存液的詳細(xì)配方

表3.對照保存液(保存液-c)的配方

結(jié)論：如圖1所示，以保存液1的配方作為研究案例，只變化二甲基亞砜的比例，從0％-100％，總共11個梯度，制備出對應(yīng)的保存液，在隨機(jī)志愿者的糞便樣本在對應(yīng)的保存液中冷凍保存一周(對應(yīng)的糞便樣品每份0.6g)其余的保存液成分保持一致，二甲基亞砜減少的量由水來補(bǔ)足，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二甲基亞砜的濃度在10％-30％之間，dna的回收保存效率較高?？偟恼f來，研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)發(fā)現(xiàn)加入一種低溫凍存保護(hù)有助于人體樣品的保存。在比較儲存樣品和新鮮樣品中的微生物組成之前，可以采用檢測樣品dna的量這種快速的方法，來評估保護(hù)劑的作用，如果dna量不足，那么間接表明采用的保存液并不適用于糞便微生物的保存。

實(shí)施例3

1.采集的的四位隨機(jī)試驗(yàn)者的樣本按1∶3與四種糞便保存液(表2中保存液1-3和保存液-c)分別凍存于-20℃冰箱中一周后，將16只凍存混合液取出，取上述混合液各500μl用全血基因組dna提取試劑盒(天根科技有限公司出品，商品編號n2516)提取dna，并分別溶解于50μl的洗脫液中得相應(yīng)的四個志愿者的樣品，分別編號樣品1、樣品2、樣品3和樣品4。在7天凍存期之前，4個試驗(yàn)對象的新鮮樣本各取400ug，基因組抽提后，將基因組dna預(yù)先測定濃度及純度，然后保存于-20℃冰箱(命名為新鮮樣品處理組n)。

上述四個樣品的在不同的保存液處理下的吸光值檢測結(jié)果如表4所示：

表4.糞便樣品在保存液中凍存于-20℃一周后的dna濃度測定(ng/μl)

將上述四個樣品的進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測和pcr檢測，如圖2的擴(kuò)增結(jié)果所示，從圖上可以看到編號樣品1-4在-20℃凍存一周后與新鮮對照組即樣品5，這五個樣品核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增差異不顯著，間接證明樣品在保存液中凍存-20℃一周后，細(xì)菌的基因組dna還是比較穩(wěn)定的。

實(shí)施例4

1.如實(shí)施例3的的四位隨機(jī)試驗(yàn)者的糞便樣本，按糞便與保存液質(zhì)量比1:3的比例，與4位隨機(jī)的受試者的糞便樣品混勻后，將16個樣品與保存液的混合物至于常溫避光放置7天，取上述混合液各500μl用全血基因組dna提取試劑盒(天根生物科技有限公司出品，商品編號n2516)提取dna，并分別溶解于50μl的洗脫液中得相應(yīng)的四個志愿者的樣品，分別編號樣品1、樣品2、樣品3和樣品4。

上述四個樣品的在不同的保存液處理下的dna濃度檢測結(jié)果如下表所示：

表5.糞便樣品在保存液中常溫放置一周后的dna濃度測定結(jié)果(ng/μl)

如圖2所示，圖2中的1、2、3和4分別為樣品1、樣品2、樣品3和樣品4分別在保存液1中的dna提取物，通過特異性引物擴(kuò)增后的凝膠成像結(jié)果，從結(jié)果中我們可以看到，與對照組相比，通過保存液1-3對糞便樣本常溫保存一周時(shí)，細(xì)菌的基因組dna還是比較穩(wěn)定的。

上述配方配制的保存液與采集的兩個唾液樣本按1∶1的體積比充分混合得混合液，分別編號樣品5和樣品6，該兩個樣品在37℃及室溫條件下保存一定時(shí)間后取上述混合液各500μl用全血基因組dna提取試劑盒提取dna，并分別溶解于100μl的洗脫液中得相應(yīng)的兩個樣品。

實(shí)施例5

1.如實(shí)施例3的四位隨機(jī)試驗(yàn)者的糞便樣本，同樣是按樣本與糞便保存液(共四種保存液)1∶3的常溫避光放置2周后，從16個樣品與保存液的混合物，取出混合液各500μl用全血基因組dna提取試劑盒(天根科技有限公司出品，商品編號n2516)提取dna，并分別溶解于100ul的洗脫液中得相應(yīng)的四個志愿者的樣品，分別編號樣品1、樣品2、樣品3和樣品4。

上述四個樣品的在不同的保存液處理下的dna濃度檢測結(jié)果如下表所示：

表6.糞便樣品在不同的保存液中常溫放置兩周后的dna濃度測定結(jié)果(ng/μl)

從結(jié)果中我們可以看到，與對照組相比，通過保存液1-3對糞便樣本常溫保存兩周時(shí)，細(xì)菌的基因組dna明顯更為穩(wěn)定。

實(shí)施例6

1.如實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)操作條件一樣，挑選四位隨機(jī)試驗(yàn)者的糞便樣本，按糞便與保存液質(zhì)量比1:3的比例，與4位隨機(jī)的受試者的糞便樣品混勻后，將16個樣品與保存液的混合物至于-20℃放置14天，取上述混合液各500μl用全血基因組dna提取試劑盒(天根科技有限公司，商品編號n2516)提取dna，并分別溶解于100μl的洗脫液中得相應(yīng)的四個志愿者的樣品，分別編號樣品1、樣品2、樣品3和樣品4，對應(yīng)的保存液-1，保存液-2，保存液-3，保存液-c分別通過i、ii、iii、iv來標(biāo)記，以100ulddh20溶解抽提到的dna。

上述四個樣品的在不同的保存液處理下的dna濃度檢測結(jié)果如下表所示：

表7.糞便樣品在不同的保存液中-20℃放置兩周后的dna濃度測定結(jié)果(ng/μl)

從結(jié)果中我們可以看到，與對照組相比，通過保存液1-3對糞便樣本-20℃保存兩周時(shí)，細(xì)菌的基因組dna明顯更為穩(wěn)定。

實(shí)施例7樣品dna擴(kuò)增結(jié)果

i.核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增(neb公司的試劑):

1)特異性擴(kuò)增引物

(上游序列5’-agagtttgatcmtggctcag-3’，下游序列5’-tacggytaccttgttacgactt-3’)

2)taqdna聚合酶

3)mgc12

4)2.5mmol/ldntpmixture

5)ddh20

6)10xrtaqpcrbuffer

7)dna模板

ii.操作步驟:

1)每個pcr反應(yīng)體系總量為20ul，包括:10.75ulddh2o，2.5ul10xtaqbuffer，2uldntpmixture，1.5ulmgc12，0.25ultaqdna聚合酶，上游引物和下游引物各0.5ul，2ul模板dna。

2)在每個ep管中分裝好每個20ul的pcr反應(yīng)體系后，按照以下pcr程序擴(kuò)增反應(yīng):

step1:98℃，2min

step2:92℃，30s

step3:58℃，30s

step4:72℃，45s

step5:onetostep2，32cycles

step6:72℃，5min

step7:40℃，forever

step8:endandholdat4℃

3)擴(kuò)增得到的目的基因片段，送往測序公司進(jìn)行測序，獲得序列后進(jìn)行后續(xù)生物信息分析(由金唯智代理分析)，得到菌群結(jié)果。

樣本dna的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，每一副小圖代表一位志愿者的糞便細(xì)菌dna的擴(kuò)增結(jié)果，有亮色條帶并且位置在320bp左右，則表示成功擴(kuò)增了核糖體16srrna基因第四可變區(qū)引物對應(yīng)的目的片段。結(jié)果表明，四種方式保存處理的樣本，其核糖體16srna基因第四可變區(qū)都被成功擴(kuò)增，說明不同的保存方法對于糞便細(xì)菌dna的擴(kuò)增效率影響不大。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2-7中多個志愿者的隨機(jī)抽樣在四種不同條件下的dna回收效率的統(tǒng)計(jì)圖；其中圖3a為四名志愿者的樣品分別在五種配方溶液凍存一周的dna回收效率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，其中圖3b為相同的樣本在樣品凍存2周后的檢測結(jié)果；圖3c和圖3d分別為樣品常溫放置一周及樣品常溫放置兩周后的遺傳物質(zhì)的變化統(tǒng)計(jì)情況。由此可知，保存液1-3在凍存條件(-20攝氏度)和常溫條件下均對遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定起重要作用。

實(shí)施例8.糞便類樣品中細(xì)菌豐富度比較

經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)操作，我們收集了四位志愿者的糞便樣本，分裝成六份，分別進(jìn)行一下六種處理方式：

1)立即處理:采樣至少0.2g糞便樣品立即進(jìn)行dna提取，核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增等處理。

2)按照保存液1的配方(配方見表2)，凍存兩周后處理(保存于-20度冰箱):采集至少0.2g糞便樣品，添加保存液，-20℃下密封，保存2周，2周后再進(jìn)行dna提取，核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增等處理。

3)按照保存液1的配方，常溫避光放置保存兩周:采集至少0.2g糞便樣品，室溫下25℃密封，避光，使用本發(fā)明保存配方(配方見表2)保存兩周，然后再進(jìn)行dna提取，核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增等處理。

4)按照表3的保存液c的對照配方，凍存兩周后處理(保存于-20度冰箱):采集至少0.2g糞便樣品，添加保存液，-20℃下密封，避光保存2周，使用本發(fā)明涉及到的對照保存配方(配方見表3)保存兩周，然后再進(jìn)行dna提取，核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增等處理。

5)按照對照配方保存液c保存兩周:室溫下25℃密封，避光，使用對照保存配方(配方見表3)保存兩周后，然后再進(jìn)行dna提取，核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增等處理。

6)不做任何處置室溫放置兩周:室溫下25℃密封，避光保存兩周，然后再進(jìn)行dna提取，核糖體16srna基因第四可變區(qū)擴(kuò)增等處理。

具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示：將四個志愿者的糞便樣品經(jīng)過6種不同的處理方式收集，交由測序服務(wù)公司進(jìn)行測序，獲得對應(yīng)的菌群，通過生物信息學(xué)分析，計(jì)算物種多樣性指數(shù)，進(jìn)行比較。如圖4的統(tǒng)計(jì)結(jié)果所示，每一副小圖是隨機(jī)的志愿者的糞便樣本經(jīng)過上述6種不同的保存方式(包括更換保存液)測得的細(xì)菌的豐富程度，每一個柱子代表某個志愿者的某一種處理方式，每種圖案對應(yīng)的處理方式可見圖例，數(shù)值越高則代表細(xì)菌的豐富程度越高。結(jié)果表明，采用本專利涉及到的保存液1的配方凍存糞便樣品2周以及常溫保存2周的細(xì)菌豐富度和采樣后立即處理的結(jié)果較為接近，而對照配方保存液c的常溫保存兩周的效果遠(yuǎn)低于凍存2周的，同時(shí)與實(shí)驗(yàn)組新鮮樣品直接處理組相比較，菌群的豐富度差異顯著，遠(yuǎn)差于保存液1常溫保存的細(xì)菌豐度，而不做任何保存的結(jié)果與采樣后立即處理組的結(jié)果差異更大。從測序分析的結(jié)果展示常溫保存需要添加保存液，使用本發(fā)明涉及到的保存液能有效維持細(xì)菌的組份，降低外界因素對細(xì)菌組份的破壞。實(shí)施例9.不同的保存方式，糞便樣品中綱水平菌群構(gòu)成的異同性分析

經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)操作，我們獲得了四位志愿者六種不同處理方式獲得的菌群，通過生物信息學(xué)分析，計(jì)算每個樣品中的細(xì)菌分屬于哪些細(xì)菌綱，進(jìn)行比較?；诰V水平的細(xì)菌相對豐度構(gòu)成如圖5所示，每一副小圖是一位志愿者6種不同保存方式測得的綱水平的細(xì)菌相對豐度構(gòu)成，每一個柱子代表的是某個支援者的某一種保存方式，分別由1，2，3，4，5，6表示，對應(yīng)的保存方式可見圖例，若某一種細(xì)菌占的比例多，則其在柱子中所占的比例就會變大。從圖5的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，除去不做任何措施保存兩周以外的結(jié)果表明，保存液1保存兩周的結(jié)果與采樣后立即處理組最為相似，其次為保存液1常溫保存2周后處理，最后為保存液c對照組凍存保存2周，不用任何措施保存2周的結(jié)果與其余幾種相差較大。

從上述具體的實(shí)施案例可以得出以下結(jié)論：采用保存液1常溫保存最長可達(dá)14天，因此可以通過在類糞便樣品中添加發(fā)明專利中所述的保存液-1，采取常溫運(yùn)輸，高效穩(wěn)定期可達(dá)7天?；诩?xì)菌豐富度，菌群關(guān)系，以及菌屬構(gòu)成的分析，得出本發(fā)明所述保存液配方，其效果與傳統(tǒng)的凍存液處理相比有明顯的優(yōu)異性，且明顯優(yōu)于發(fā)明書涉及到的對照配方以及不做任何處理的保存方案。

最后需要說明的是，以上實(shí)施例僅用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，并不用作對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

序列表

<110>蘇州阿迪康生物科技有限公司

<120>一種糞便樣本的保存方法、保存用溶液、制備方法及應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>16srna基因第四可變區(qū)上游序列

<400>1

agagtttgatcmtggctcag20

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>16srna基因第四可變區(qū)下游序列

<400>2

tacggytaccttgttacgactt22