本發(fā)明屬于基因工程和微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種能過量合成胞外camp的酵母菌株及其構(gòu)建方法、發(fā)酵工藝與在醫(yī)藥、畜牧業(yè)、食品、保健品或化工領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：環(huán)磷酸腺苷(cyclicadenosinemonophosphate，簡稱camp)是人體內(nèi)廣泛存在的一種具有生理活性的重要物質(zhì)，其作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，對糖代謝、脂肪代謝、核酸合成、蛋白質(zhì)合成等起著重要的調(diào)節(jié)作用。目前camp在醫(yī)藥方面用途廣泛：臨床上camp用于治療心絞痛、心肌梗死、心肌炎及心源性休克等；對改善風(fēng)濕性心臟病的心悸、氣急、胸悶等癥狀有一定的作用；可提高急性白血病結(jié)合化療的療效，亦可用于急性白血病的誘導(dǎo)緩解；此外，對老年慢性支氣管炎、各種肝炎和銀屑病也有一定療效。camp也可作為藥物中間體制備二丁酰環(huán)磷腺苷和環(huán)磷腺苷葡甲胺，提高脂溶性，從而發(fā)揮更有效的生理及藥理作用。camp還可用作畜禽食品添加劑，在離體條件下模擬生長激素的作用，促進(jìn)畜禽生長，增加優(yōu)質(zhì)禽產(chǎn)品產(chǎn)量。camp的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、酶促轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法三種。目前國內(nèi)外產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)全部采用以腺苷一磷酸(adenosine-5’-monophosphate,簡稱amp)為原料的化學(xué)合成法，其采用高效分離柱進(jìn)行中間體分離，操作復(fù)雜，且所涉及的試劑昂貴，采用大量的吡啶作為溶劑也造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。酶促轉(zhuǎn)化法即以腺苷酸環(huán)化酶(e.c.4.6.1.1，cyr1p)為酶源催化atp原料一步生產(chǎn)camp，但此法存在底物昂貴、腺苷酸環(huán)化酶含量低、純化困難、穩(wěn)定性差等限制，故目前還局限于實(shí)驗(yàn)室階段，離產(chǎn)業(yè)化還有相當(dāng)?shù)木嚯x。相比之下，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)camp具有如下的一些優(yōu)點(diǎn)：條件溫和、工藝簡單、能利用廉價的碳源，副產(chǎn)物少、環(huán)境污染小，可實(shí)現(xiàn)持續(xù)生產(chǎn)等等，是有潛力的、值得大力開發(fā)的工藝。目前利用液化短桿菌、微桿菌、棒狀桿菌、節(jié)桿菌、大腸桿菌等細(xì)菌發(fā)酵法生產(chǎn)camp已有一定的研究，但面臨重復(fù)性差、產(chǎn)量不穩(wěn)定、成本高、難以工業(yè)化等問題。而酵母尤其是釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)作為最重要的工業(yè)微生物之一，不僅具有工業(yè)化應(yīng)用技術(shù)成熟、抗逆性強(qiáng)、為食品安全性gras微生物的優(yōu)點(diǎn)，同時作為最早實(shí)現(xiàn)全基因組測序的微生物菌種，又是分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的最重要模式生物之一，camp信號通路及其調(diào)控相關(guān)的基礎(chǔ)研究深入，遺傳操作技術(shù)手段完善。遺憾的是目前國內(nèi)外的研究都集中于胞內(nèi)camp的信號調(diào)控功能，還沒有將其作為一個產(chǎn)品從而關(guān)注胞外生產(chǎn)情況的專門研究。若研究酵母胞外camp產(chǎn)生規(guī)律，并通過基因工程手段改造實(shí)現(xiàn)以過量生產(chǎn)胞外camp酵母為菌種的發(fā)酵法生產(chǎn)，將極大地降低成本、簡化工藝，從而為微生物發(fā)酵生產(chǎn)camp開辟新的途徑，推動高值醫(yī)藥和生化產(chǎn)品的綠色清潔生產(chǎn)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會意義。而camp在畜牧業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用，到目前為止因camp只能被注射使用而停留在研究階段。如能解決使用方法問題，必將有利于充分發(fā)揮其廣泛的營養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)作用，而實(shí)際成為非激素類安全無殘留無污染因而有良好應(yīng)用前景的動物促生長劑，可供直接用作飼料添加劑，或制備成飼料添加劑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明概述本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種容易培養(yǎng)、適合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)并易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的、經(jīng)過遺傳改造而能過量合成胞外camp的酵母菌株，構(gòu)建此菌株的重組方法及應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供一種酵母菌株，此酵母菌株經(jīng)過了第一種和第二種基因修飾，其中，所述第一種基因是蛋白激酶a(proteinkinasea，pka)催化亞基編碼基因tpk1，tpk2和tpk3，通過修飾第一種基因使pka活性或表達(dá)被完全抑制，從而消除對camp的反饋抑制，但同時使得酵母的生長被抑制，第二種基因修飾消除了第一種基因修飾導(dǎo)致的生長抑制，從而使得酵母能夠正常生長，所述酵母的camp產(chǎn)量上升，其中，所述camp產(chǎn)量上升，是相對于未經(jīng)基因修飾的酵母的camp產(chǎn)量而言的。優(yōu)選的，所述第二種基因包括但不僅限于蛋白激酶rim15編碼基因rim15、轉(zhuǎn)錄因子msn1/msn2編碼基因msn1/msn2、蛋白激酶yak1編碼基因yak1和/或蛋白激酶sch9編碼基因sch9，優(yōu)選yak1。更優(yōu)選的，所述第二種基因修飾使得所修飾基因編碼酶的活性或表達(dá)被完全抑制，或者編碼酶的活性提高或者過表達(dá)。優(yōu)選的，第二種基因修飾使得蛋白激酶rim15編碼基因rim15、轉(zhuǎn)錄因子msn1/msn2編碼基因msn1/msn2、和/或蛋白激酶yak1編碼基因yak1編碼酶的活性或表達(dá)被完全抑制；或者使得蛋白激酶sch9編碼基因sch9編碼酶的活性提高或者過表達(dá)。進(jìn)一步的，上述任一酵母還包括第三種基因修飾，以減少camp的降解，從而提高camp產(chǎn)量。優(yōu)選的，所述第三種基因?yàn)閏amp磷酸二酯酶編碼基因pde1和/或pde2，優(yōu)選pde1。更優(yōu)選的，所述第三種基因修飾使得所修飾基因編碼酶的活性或表達(dá)被完全抑制。優(yōu)選的，上述使得編碼酶的活性或表達(dá)被完全抑制的基因修飾方式包括點(diǎn)突變、缺失、插入、反義polynucleotides、sirna、microrna、crispr，更優(yōu)選缺失和點(diǎn)突變；使得編碼酶的活性提高或者過表達(dá)的基因修飾方式包括點(diǎn)突變、連接強(qiáng)啟動子、連接增強(qiáng)子、提高拷貝數(shù)。進(jìn)一步，上述任一酵母還包括第四種基因修飾，以增加嘌呤合成途徑中camp前體物的合成的正調(diào)控，使camp前體物的合成上升，從而提高camp產(chǎn)量。優(yōu)選的，所述第四種基因包括但不僅限于轉(zhuǎn)錄因子bas1、bas2編碼基因。更優(yōu)選的，所述基因修飾使bas1/bas2復(fù)合物表達(dá)上升。優(yōu)選的，上述第四種基因的修飾方式包括但不僅限于點(diǎn)突變、連接強(qiáng)啟動子、連接增強(qiáng)子、提高拷貝數(shù)、融合共表達(dá)，更優(yōu)選融合共表達(dá)。進(jìn)一步，上述任一酵母還包括第五種基因修飾，以增加對camp及其前體物的胞內(nèi)外運(yùn)輸和積累的調(diào)控，使camp合成和分泌上升，從而提高camp產(chǎn)量。優(yōu)選的，所述第五種基因包括但不僅限于質(zhì)膜載體蛋白fcy2編碼基因和snq2編碼基因。更優(yōu)選的，所述基因修飾使fcy2和/或snq2活性或表達(dá)上升。優(yōu)選的，上述第五種基因的修飾方式包括但不僅限于點(diǎn)突變、連接強(qiáng)啟動子、連接增強(qiáng)子、提高拷貝數(shù)。進(jìn)一步的，所述基因的修飾方式包含使用選擇標(biāo)記基因。優(yōu)選的，所述選擇標(biāo)記基因包括但不僅限于ura3、leu2、his3、trp1、lys2。更優(yōu)選使用ura3選擇標(biāo)記基因。更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述基因的修飾方式是循環(huán)使用選擇標(biāo)記基因而不保留選擇標(biāo)記基因。本發(fā)明所描述的酵母菌株，較未經(jīng)基因修飾的酵母有更高的胞外camp產(chǎn)量。例如，本文描述的酵母菌株的胞外camp產(chǎn)量可高達(dá)11581.6μmol/l。本發(fā)明所描述的酵母菌株，為釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、巴斯德酵母(saccharomycespastorianus),樹干畢赤酵母(pichiastipitis),saccharomycesbayanus和休哈塔假絲酵母(candidashehatae)中的任意一種。優(yōu)選釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)。本發(fā)明的一個目的是提供一種構(gòu)建胞外camp產(chǎn)量大幅提高的上述酵母菌株的方法。首先在酵母中引入第一種基因修飾，消除對camp的反饋抑制，但同時使得酵母的生長被抑制，其次，引入第二種基因修飾，第二種基因修飾消除了第一種基因修飾導(dǎo)致的生長抑制、從而使得酵母能夠正常生長。進(jìn)一步的，所述方法中還包括對酵母進(jìn)行第三種基因修飾以減少camp的降解，從而進(jìn)一步提高camp產(chǎn)量。更進(jìn)一步，所述方法中還包括對酵母進(jìn)行第四種基因修飾以增加嘌呤合成途徑中camp前體物的合成的正調(diào)控，使camp前體物的合成上升，提高camp產(chǎn)量。更進(jìn)一步，所述方法中還包括對酵母進(jìn)行第五種基因修飾以增加對camp及其前體物的胞內(nèi)外運(yùn)輸和積累的調(diào)控，使camp合成和分泌上升，從而提高camp產(chǎn)量。本發(fā)明的一個目的是提供一種使用上述的酵母生產(chǎn)camp的方法，所述方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述酵母。進(jìn)一步，所述方法包括發(fā)酵培養(yǎng)基組分，如碳源、氮源、微量元素。優(yōu)選的，所述方法中，發(fā)酵用培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為20-150g/l，酵母提取物10-20g/l，蛋白胨20-40g/l，腺嘌呤添加量為0-1.25g/l。本發(fā)明的一個目的是提供一種利用上述的酵母發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵液。本發(fā)明的一個目的是提供上述任一的酵母或者發(fā)酵液在生產(chǎn)camp中的用途。本發(fā)明的一個目的是提供上述任一的酵母或者發(fā)酵液在醫(yī)藥、畜牧業(yè)、食品、保健品或化工領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明的一個目的是提供上述任一的酵母或者發(fā)酵液在制備醫(yī)藥、畜牧業(yè)、食品、保健品或化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述上述任一的酵母菌株或者發(fā)酵液在畜牧業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用包括作為動物促生長劑，直接用作飼料或者飼料添加劑或制備成飼料或者飼料添加劑。本發(fā)明的一個目的是提供一種制備上述醫(yī)藥、畜牧業(yè)、食品、保健品或化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品的方法，所述方法包括利用上述任一的酵母或者發(fā)酵液制備上述產(chǎn)品。進(jìn)一步，所述方法包括將所述酵母或者發(fā)酵液進(jìn)一步加工成任何其他劑型，優(yōu)選為可食用的劑型。更優(yōu)選為粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊、或液體等形式。相應(yīng)的，本發(fā)明還提供包含上述任一的酵母或者發(fā)酵液的醫(yī)藥、畜牧業(yè)、食品、保健品或化工領(lǐng)域的產(chǎn)品，例如藥物，飼料，飼料添加劑、食品、保健品等等。優(yōu)選的，所述藥物，飼料，飼料添加劑、食品,保健品可以是直接的菌株或發(fā)酵液、或?qū)⑺鼋湍富蛘甙l(fā)酵液進(jìn)一步加工成任何其他劑型，優(yōu)選為可食用的劑型。更優(yōu)選為粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊、或液體等形式。發(fā)明詳述本發(fā)明提供的是一種經(jīng)過遺傳改造的、能過量合成胞外camp的酵母菌株、構(gòu)建此菌株的重組方法及應(yīng)用。更具體地，如上所述，本發(fā)明的酵母包括第一種基因修飾和第二種基因修飾。進(jìn)一步的，所述酵母還包括第三種、第四種和/或第五種基因修飾。其中，第一種基因修飾消除對camp的反饋抑制，但同時使得酵母的生長被抑制；第二種基因修飾消除了第一種基因修飾導(dǎo)致的生長抑制，從而使得酵母能夠正常生長；第三種基因修飾減少camp的降解，第四種基因修飾增加嘌呤合成途徑中camp前體物的合成的正調(diào)控，使camp前體物的合成上升，提高camp產(chǎn)量。第五種基因修飾以增加對camp及其前體物的胞內(nèi)外運(yùn)輸和積累的調(diào)控，使camp合成和分泌上升，從而提高camp產(chǎn)量。更具體地，第一種基因修飾可以通過修飾蛋白激酶a(proteinkinasea，pka)的催化亞基編碼基因tpk1、tpk2和tpk3，使pka活性或表達(dá)被完全抑制，pka對camp的反饋抑制被消除，但同時使得酵母的生長被抑制；第二種基因修飾消除了第一種基因修飾導(dǎo)致的生長抑制，從而使得酵母能夠正常生長；第二種基因修飾可以使蛋白激酶yak1等的活性或表達(dá)被完全抑制，從而消除了因pka活性或表達(dá)被完全抑制而導(dǎo)致的抑制細(xì)胞生長，因此菌株能夠正常生長；第三種基因修飾使水解camp的磷酸二酯酶pde活性或表達(dá)被完全抑制；第四種基因修飾使經(jīng)嘌呤合成途徑中合成camp前體物amp的正調(diào)控例如轉(zhuǎn)錄因子bas1、bas2活性或表達(dá)上升，使amp合成上升，最終提高camp產(chǎn)量；第五種基因修飾使camp前體物質(zhì)膜載體蛋白例如fcy2和/或camp質(zhì)膜載體蛋白例如snq2活性或表達(dá)上升，使camp合成和分泌上升，從而提高camp產(chǎn)量。本發(fā)明描述了通過酵母菌株的第一種和第二種基因修飾消除pka對camp的反饋抑制來提高合成胞外camp產(chǎn)量。pka是酵母中目前唯一已知的camp靶標(biāo)，一般認(rèn)為camp濃度上的波動通過pka途徑來施加效應(yīng)；換言之，酵母細(xì)胞內(nèi)camp信號通路受pka的嚴(yán)格負(fù)反饋調(diào)控。酵母pka是由兩個催化亞基和一個二聚體的調(diào)節(jié)亞基組成的四聚體蛋白，在胞內(nèi)缺乏camp或camp水平較低時，pka以鈍化復(fù)合體的形式存在。胞內(nèi)camp水平上升時，camp與pka的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，pka的催化亞基從調(diào)節(jié)亞基上解離下來，激活一系列蛋白磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致這些蛋白的活性發(fā)生變化，進(jìn)而在不同水平上調(diào)控胞內(nèi)camp的水平；其中的首要效應(yīng)酶是腺苷酸環(huán)化酶cyr1，cyr1催化atp合成camp。pka的調(diào)節(jié)亞基由基因bcy1編碼，催化亞基由基因tpk1、tpk2和tpk3編碼。當(dāng)三個催化亞基tpk1、tpk2和tpk3活性或表達(dá)同時被完全抑制時，pka活性也就被完全抑制，pka對camp的反饋抑制被消除。另一方面，當(dāng)pka活性被完全抑制時，蛋白激酶rim15停留在細(xì)胞核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄因子msn1/msn2，msn1/msn2進(jìn)而激活對細(xì)胞生長起負(fù)調(diào)控作用的蛋白激酶yak1，使細(xì)胞停留在g1期而無法繼續(xù)生長，因此pka活性被完全抑制的酵母菌株需要進(jìn)一步的基因修飾來確保菌株正常生長。蛋白激酶sch9與pka的催化亞基具有同源性，在正常的生理?xiàng)l件下，sch9與pka具有不同的底物；但增加任一種激酶的活性都會補(bǔ)償由于缺失另一個激酶而引起的生長缺陷。本發(fā)明中的第一種基因修飾消除了pka對camp的反饋抑制，使pka活性或表達(dá)被完全抑制，第二種基因修飾消除了酵母菌株因第一種基因修飾導(dǎo)致的生長抑制、從而能夠正常生長。消除pka對camp的反饋抑制作用以及保持pka活性被完全抑制情況下的菌株正常生長的策略有多種。使pka活性或表達(dá)被完全抑制、消除pka對camp的反饋抑制作用，可以在編碼催化亞基tpk1、tpk2和tpk3的核酸序列中進(jìn)行，此核酸序列可以是調(diào)控區(qū)、編碼區(qū)。tpk1的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.nc_001142.9中找到。tpk2的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.nc_001148.4中找到。tpk3的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.nc_001143.9中找到。保持pka活性被完全抑制情況下的菌株正常生長的策略包括但不限于對蛋白激酶rim15編碼基因rim15、轉(zhuǎn)錄因子msn1/msn2編碼基因msn1/msn2和/或蛋白激酶yak1編碼基因yak1進(jìn)行基因修飾，修飾的結(jié)果使相應(yīng)酶活性或表達(dá)被完全抑制，菌株從而得以正常生長。保持pka活性被完全抑制情況下的菌株正常生長的策略還包括但不限于對蛋白激酶sch9編碼基因sch9進(jìn)行基因修飾，修飾的結(jié)果使相應(yīng)酶活性或表達(dá)被提高，菌株從而得以正常生長。yak1的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.nc_001142.9中找到。rim15的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.nc_001138.5中找到。msn1/msn2的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.nc_001147.6，nc_001145.3中找到。sch9的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.nc_001140.6中找到。不論以何種方式進(jìn)行第一種和第二種基因修飾使酶活性或表達(dá)被完全抑制，或使酶活性或表達(dá)被提高，酵母菌株中tpk1、tpk2、tpk3和第二種基因共四個基因的修飾步驟，除了在單倍體酵母細(xì)胞中同時失活tpk1、tpk2、tpk3的組合(此組合因生長缺陷而不能存活)以外，上述四個基因可以不分先后、任一組合的被修飾。本發(fā)明描述的經(jīng)過上述第一種和第二種基因修飾的酵母菌株相對于未經(jīng)第一種和第二種基因修飾的酵母菌株產(chǎn)生更多的胞外camp。另一方面，camp一旦產(chǎn)生，唯一使它失活的方式是在環(huán)核苷酸磷酸二酯酶pde的催化下將其水解為5’-amp。因此，pde也影響著胞內(nèi)camp的水平。因此，本發(fā)明通過第三種基因修飾使pde活性或表達(dá)被完全抑制，從而減少camp的降解、提高camp含量水平。釀酒酵母細(xì)胞本身包含兩個camp磷酸二酯酶：pde1編碼一個低親和力(km＝20-250μm)的、特異性較低的酶，主要介導(dǎo)快速的camp信號傳導(dǎo)；pde2編碼一個高親和力(km＝170nm)的、特異性很強(qiáng)的酶，主要控制camp的基礎(chǔ)水平。pde1的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.nc_001139.9中找到。pde2的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.nc_001147.6中找到。本發(fā)明所描述的第一種，第二種和第三種基因修飾可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任意多種方法來實(shí)現(xiàn)。使得編碼酶的活性或表達(dá)被完全抑制的基因修飾方式可以是對基因的核酸序列進(jìn)行點(diǎn)突變、缺失或插入一個或者多個核苷酸，點(diǎn)突變?nèi)鐔魏塑账岬霓D(zhuǎn)換(嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶)或者顛換(嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤)。核酸的突變可以導(dǎo)致在其表達(dá)的多肽中一個或者多個保守的或者非保守的氨基酸的置換，這種置換可能會導(dǎo)致多肽的構(gòu)象發(fā)生變化，也可能失去部分或者全部功能，可能發(fā)生移碼突變將導(dǎo)致整個多肽鏈從該點(diǎn)處開始編碼一個完全不同的多肽，也可能提前形成一個終止密碼子使得多肽鏈殘缺，甚至使基因沉默。缺失或插入用核酸序列可以用pcr或者化學(xué)合成的方法得到，也可以利用細(xì)胞復(fù)制擴(kuò)增得到。使基因酶活性或表達(dá)被完全抑制的基因修飾還可以通過提供或表達(dá)反義寡核苷酸antisensepolynucleotides、sirna、microrna或其它可以阻止待修飾基因的mrna翻譯為蛋白質(zhì)的核酸的方法來實(shí)現(xiàn)。近年來發(fā)展的類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，talen)和crispr技術(shù)——規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)也可以用來失活基因。本發(fā)明中提到的使基因酶活性或表達(dá)被完全抑制的基因修飾指的是能夠使這種酶/多肽的活性降低(與未經(jīng)基因修飾的酵母或野生型酵母比較)至少95％(例如至少96％，97％，98％，99％，或者100％)。使得編碼酶的活性提高或者過表達(dá)的基因修飾方式包括但不限于點(diǎn)突變、連接強(qiáng)啟動子、連接增強(qiáng)子、提高拷貝數(shù)。例如，點(diǎn)突變提高多肽活性；提高核酸序列的拷貝數(shù)；通過基因修飾使核酸序列與一個可表達(dá)的強(qiáng)啟動子或增強(qiáng)子連接；改變核酸序列的啟動子或者其他調(diào)節(jié)因子從而提高其表達(dá)水平(例如提高啟動子序列與轉(zhuǎn)錄起始因子的結(jié)合強(qiáng)度)；提高該核酸序列轉(zhuǎn)錄的mrna的半衰期；抑制對mrna或者多肽鏈的降解。本發(fā)明中提到的使基因酶活性或表達(dá)被提高的基因修飾指的是一個經(jīng)過基因修飾的核酸序列編碼的酶/多肽的活性或?qū)Φ孜锏淖饔眯逝c野生型相比提高至少20％(例如至少25％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,95％,99％,100％或者更高)。本發(fā)明描述的經(jīng)過上述第一種、第二種和第三種基因修飾的酵母菌株，相對于未經(jīng)第一種、第二種和第三種基因修飾的酵母菌株產(chǎn)生更多的胞外camp。甚至相對于第一種和第二種基因修飾的酵母菌株產(chǎn)生更多的胞外camp。提高酵母細(xì)胞胞外camp水平，對camp-pka信號通路途徑的基因進(jìn)行修飾外，也可以通過調(diào)控嘌呤合成途徑、增加camp合成前體物amp的合成量來實(shí)現(xiàn)。釀酒酵母的嘌呤合成途徑中，amp從頭合成途徑基因即ade基因的表達(dá)受2個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子bas1和bas2間的協(xié)同作用正調(diào)控。bas1是myb族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，bas2又名pho2，是同源域(homeodomain)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，二者以復(fù)合物形式與特定啟動子區(qū)域結(jié)合，協(xié)同作用激活10個ade基因的表達(dá)。當(dāng)胞內(nèi)adp、atp濃度過高時，adp、atp反饋抑制從頭合成途徑第一個酶ade4p(prpp酰胺轉(zhuǎn)移酶，簡稱prppat)的活性，使得中間產(chǎn)物saicar的合成下降，bas2p能感知saicar的濃度變化，當(dāng)此濃度降至一定程度時，bas2p不再與bas1p形成復(fù)合物。當(dāng)培養(yǎng)基中有相當(dāng)量的腺嘌呤存在時，腺嘌呤進(jìn)入胞內(nèi)，通過補(bǔ)救途徑形成amp，amp進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為adp和atp，也導(dǎo)致整個從頭合成途徑合成受到抑制。本發(fā)明的第四種基因修飾通過增加嘌呤合成途徑中amp合成的正調(diào)控，使amp合成上升，提高camp產(chǎn)量。增加amp合成的正調(diào)控的核心在于促進(jìn)bas1/bas2復(fù)合物形成、提高復(fù)合物的正調(diào)控活性，抑制腺嘌呤、adp和atp的反饋抑制。而促進(jìn)bas1/bas2復(fù)合物形成、提高復(fù)合物正調(diào)控活性的策略有多種，可以提高單個正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子bas1或bas2的活性或表達(dá)，也可以直接融合共表達(dá)bas1和bas2，或在融合共表達(dá)bas1和bas2的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高活性或表達(dá)量。有很多種方法能夠使核酸編碼的多肽活性提高。例如，點(diǎn)突變提高多肽活性；提高核酸序列的拷貝數(shù)；通過基因修飾使核酸序列與一個可表達(dá)的強(qiáng)啟動子或增強(qiáng)子連接；改變核酸序列的啟動子或者其他調(diào)節(jié)因子從而提高其表達(dá)水平(例如提高啟動子序列與轉(zhuǎn)錄起始因子的結(jié)合強(qiáng)度)；提高該核酸序列轉(zhuǎn)錄的mrna的半衰期；抑制對mrna或者多肽鏈的降解。認(rèn)定一個經(jīng)過基因修飾的核酸序列編碼的多肽活性的提高需要其對底物的作用效率與野生型相比提高至少20％(例如至少25％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,95％,99％,100％或者更高)。單拷貝或者多拷貝的核酸序列的過表達(dá)可以通過連接到載體中實(shí)現(xiàn)，也可以通過整合到酵母的基因組中實(shí)現(xiàn)。適用于核酸序列過表達(dá)的載體已經(jīng)商業(yè)化或者可以通過本領(lǐng)域中常用的基因重組技術(shù)得到。在本領(lǐng)域中已經(jīng)有一些在酵母基因組中整合核酸序列的方法。例如，methodsinenzymology:guidetoyeastgeneticsandmolecularandcellbiology,vol.194,2004,abelsonetal.,eds.,academicpress。含有核酸序列的載體可以把一些對表達(dá)有必要的元件與目的核酸序列進(jìn)行可操作的連接：可以帶上表達(dá)選擇標(biāo)記的核酸序列(如營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記基因、抗生素抗性基因)；或者帶上可用來純化多肽的基因(例如6xhistag)；還可以帶有一個或多個復(fù)制起點(diǎn)。對表達(dá)有必要的元件包括能夠指導(dǎo)或者調(diào)控目的核酸序列的核酸序列，例如啟動子序列。代表性的啟動子包括(不局限于此)pgk啟動子，tpi1啟動子，adh1啟動子。對表達(dá)有必要的元件還包括增強(qiáng)子序列，響應(yīng)元件，或者調(diào)控編碼序列表達(dá)的誘導(dǎo)因子。對表達(dá)有必要的元件可以來自細(xì)菌，酵母，昆蟲，植物，哺乳動物，真菌或者病毒，表達(dá)載體可以帶有不同來源的元件。對表達(dá)有必要的元件可以參見ingoeddel,1990,geneexpressiontechnology:methodsinenzymology,185,academicpress,sandiego,ca。在某些情況下，可以選擇對特定密碼子最適宜的核酸序列或?qū)Ρ磉_(dá)有必要的元件以便在酵母中得到最好的表達(dá)。參見bennetzen&hall,1982,j.biol.chem.,257:3026-31。bas1的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.nc_001143.9中找到。bas2的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.nc_001136.10中找到。本發(fā)明描述的經(jīng)過上述第一種、第二種、第三種和第四種基因修飾的酵母菌株相對于未經(jīng)第一種、第二種、第三種和第四種基因修飾的酵母菌株產(chǎn)生更多的胞外camp。甚至相對于第一種和第二種基因修飾的酵母菌株或者相對于第一種、第二種和第三種基因修飾的酵母菌株產(chǎn)生更多的胞外camp。提高酵母細(xì)胞胞外camp水平，還可以通過調(diào)控camp及其前體物的胞內(nèi)外運(yùn)輸和積累來實(shí)現(xiàn)。酵母細(xì)胞胞內(nèi)外物質(zhì)運(yùn)輸需要很多質(zhì)膜載體蛋白參與。負(fù)責(zé)從胞外向胞內(nèi)運(yùn)輸堿基的載體蛋白有fcy2、fur4和fui1，其中fcy2為嘌呤-胞嘧啶透性酶，介導(dǎo)腺嘌呤、鳥嘌呤和次黃嘌呤及胞嘧啶從胞外到胞內(nèi)的運(yùn)輸和積累。而質(zhì)膜atp結(jié)合(abc)通道蛋白snq2參與多種藥物的運(yùn)輸，通過依賴atp外排多種外源性化合物包括誘變劑、殺菌劑、類固醇和抗癌藥物等；初步研究顯示snq2可能受到pka的直接調(diào)節(jié)并參與對camp的反饋抑制，同時負(fù)責(zé)camp向胞外排放。本發(fā)明的第五種基因修飾通過增加對camp及其前體物的胞內(nèi)外運(yùn)輸和積累的調(diào)控，使camp合成和分泌上升，從而提高camp產(chǎn)量。增加對camp及其前體物的胞內(nèi)外運(yùn)輸和積累的調(diào)控的方式是對相關(guān)載體蛋白編碼基因進(jìn)行修飾，使載體蛋白活性或表達(dá)上升。被修飾的基因包括但不限于fcy2編碼基因和snq2編碼基因，修飾的結(jié)果使相應(yīng)酶活性或表達(dá)上升，菌株增加了對camp及其前體物的胞內(nèi)外運(yùn)輸和積累，使camp合成和分泌上升，從而提高camp產(chǎn)量。使得編碼酶的活性提高或者過表達(dá)的基因修飾方式包括但不限于點(diǎn)突變、連接強(qiáng)啟動子、連接增強(qiáng)子、提高拷貝數(shù)。fcy2的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.bk006939.2中找到。snq2的核酸序列可以在例如genbankaccessionno.bk006938.2中找到。本發(fā)明描述的經(jīng)過上述第一種、第二種、第三種和第五種基因修飾的酵母菌株相對于未經(jīng)第一種、第二種、第三種和第五種基因修飾的酵母菌株產(chǎn)生更多的胞外camp。甚至相對于第一種和第二種基因修飾的酵母菌株或者相對于第一種、第二種和第三種基因修飾的酵母菌株產(chǎn)生更多的胞外camp。在本發(fā)明的基因修飾過程中，核酸序列(如表達(dá)載體)可以通過多種方法轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞或者其他宿主細(xì)胞中。這些方法包括(不局限于此)電穿孔法，磷酸鈣沉淀法，熱激法，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，顯微注射法，氯化鋰法，醋酸鋰法，巰基乙醇法和病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移法。除了酵母細(xì)胞，“宿主細(xì)胞”還可以是任何可以用于標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)操作并產(chǎn)生核酸和多肽的細(xì)胞。包括但不僅限于細(xì)菌細(xì)胞(如e.coli)，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞(如cho或cos細(xì)胞)?！敖湍讣?xì)胞”包括本文中描述的重組酵母細(xì)胞。本文所指的“宿主細(xì)胞”不僅包括對其進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)的母細(xì)胞，還包括其子細(xì)胞。在本發(fā)明的基因修飾過程中，供轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞篩選使用的選擇標(biāo)記基因包括但不僅限于酵母可用的任何營養(yǎng)缺陷型基因，如ura3、leu2、his3、trp1、lys2。為了能進(jìn)行盡可能多的基因修飾，同時避免營養(yǎng)缺陷型基因表達(dá)本身帶來的可能干擾，優(yōu)選能方便地被反復(fù)、循環(huán)使用的ura3基因。更進(jìn)一步優(yōu)選的，ura3等選擇標(biāo)記基因被循環(huán)使用而不保留在被基因修飾的菌株中。雖然本發(fā)明所應(yīng)用的策略針對s.cerevisiae菌株的基因和多肽，但是相同的策略同樣適用于其它可發(fā)酵的酵母，優(yōu)選能夠進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵的酵母菌株。除了s.cerevisiae菌株外，合適的菌株還包括巴斯德酵母(saccharomycespastorianus)、樹干畢赤酵母(pichiastipitis)、saccharomycesbayanus和休哈塔假絲酵母(candidashehatae)。在這些菌株中通路或者基因名稱或許稍有不同，但是可以應(yīng)用同樣的策略和技術(shù)來修飾相應(yīng)的通路和同源基因。此處描述的基因工程酵母菌株是本領(lǐng)域的研究人員所熟知的。本發(fā)明還描述了上述經(jīng)過基因修飾的酵母菌株生產(chǎn)camp的方法。優(yōu)選的，所述發(fā)酵方法中，發(fā)酵用培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為20-150g/l，酵母提取物10-20g/l，蛋白胨20-40g/l，腺嘌呤添加量為0-1.25g/l。更優(yōu)選的，所述方法中，發(fā)酵用培養(yǎng)基葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨可以用有同等功能的、更大量廉價的原料來替換或替代，包括但不限于糖蜜、玉米漿/玉米漿干粉、玉米蛋白粉、豆粕粉。本發(fā)明還描述了上述經(jīng)過基因修飾的酵母菌株的用途，其可用于發(fā)酵代謝碳水化合物產(chǎn)生胞外camp。進(jìn)一步，上述經(jīng)過基因修飾的酵母菌株細(xì)胞，和/或經(jīng)發(fā)酵得到的包含胞外camp的發(fā)酵液，可直接作為camp的替代品。并如同camp一般應(yīng)用到各個領(lǐng)域，例如，醫(yī)藥、畜牧業(yè)、食品、保健品或化工領(lǐng)域等等。更進(jìn)一步，所述應(yīng)用包括在制備上述領(lǐng)域的產(chǎn)品中的應(yīng)用，例如藥物、食品、保健品和飼料等。相應(yīng)的，本發(fā)明還提供包含上述經(jīng)過基因修飾的酵母菌株細(xì)胞，和/或經(jīng)發(fā)酵得到的包含胞外camp的發(fā)酵液的醫(yī)藥、畜牧業(yè)、食品、保健品或化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品，例如藥物、食品、保健品、飼料、飼料添加劑等。所述在醫(yī)藥、畜牧業(yè)、食品領(lǐng)域、保健品的應(yīng)用，包括將上述酵母菌株細(xì)胞，和/或經(jīng)發(fā)酵得到的包含胞外camp的發(fā)酵液，直接用于人和動物的營養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)、保健和疾病治療，形成這些領(lǐng)域的產(chǎn)品，例如藥物、食品和飼料/飼料添加劑等，及這些產(chǎn)品的應(yīng)用?；蛘邔⑺龅募?xì)胞、發(fā)酵液進(jìn)一步加工成任何其他劑型，優(yōu)選為可食用的劑型。更優(yōu)選為粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊、或液體等形式；而所述加工方法，為本領(lǐng)域常用處理方法，無需本領(lǐng)域技術(shù)人員再付出創(chuàng)造性勞動；在畜牧業(yè)領(lǐng)域，優(yōu)選的，為低溫干燥或噴霧干燥方法制備粉劑。所述動物，包括模式動物、畜禽類、水產(chǎn)動物、寵物和各種特殊用途的動物如信鴿、肉鴿等，優(yōu)選畜禽類動物，更優(yōu)選的，包括但不限于雞鴨鵝、豬、牛羊馬驢，進(jìn)一步優(yōu)選作為雞、豬。與上述作為飼料添加劑使用而被添加的飼料，可以是目前市面上任何常用動物飼料，即不為配合的常用動物飼料種類所限制。然而其中的常用動物飼料可優(yōu)選為日糧，進(jìn)一步優(yōu)選為雞用日糧、豬用日糧、反芻動物，水產(chǎn)動物用日糧。所述作為飼料添加劑的使用量，為(0.05-50)mgcamp/(kg體重)，優(yōu)選為(0.5-20)mgcamp/(kg體重)，更優(yōu)選0.5-10.0mgcamp/(kg體重)。若非特殊說明，本文涉及的所有專業(yè)術(shù)語、技術(shù)概念都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。盡管有多種類似或等效的方法可以用來構(gòu)建和測定本發(fā)明中涉及的酵母菌株，下文中將描述一種合適的方法和材料。這些材料、方法和例子只是作為舉證，它不在任何程度上限制本發(fā)明。本文中提到的所有文獻(xiàn)、專利和其他參考資料均尊重其完整性。本發(fā)明涉及的方法和材料將在下文中與詳細(xì)說明和圖表一同給出。發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和益處本發(fā)明所得重組酵母菌株具有低營養(yǎng)需求、容易培養(yǎng)、適合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)并易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的性能；通過基因工程手段進(jìn)行相關(guān)基因修飾，在消除camp通路反饋抑制、減少camp降解的同時，增加通向camp前體物amp的代謝流，提高camp及其前體物的胞內(nèi)外運(yùn)輸和積累，使所得重組酵母菌株能穩(wěn)定、持續(xù)、高效生產(chǎn)胞外camp；通過提高碳源濃度、優(yōu)化碳/氮比、添加前體物等措施，使代謝流更有效地流向目的產(chǎn)物，得到優(yōu)化的、高產(chǎn)胞外camp的發(fā)酵工藝，camp濃度可達(dá)到11581.6μmol/l。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)化學(xué)合成法工藝復(fù)雜、原料昂貴、副產(chǎn)物多、環(huán)境污染嚴(yán)重的缺點(diǎn)，也克服了酶促轉(zhuǎn)化法底物昂貴、腺苷酸環(huán)化酶穩(wěn)定性差等不足，具有工藝操作簡單、產(chǎn)物容易分離提取、原料成本低、安全環(huán)保、可工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，為微生物發(fā)酵生產(chǎn)camp開辟了新的途徑，將推動高值醫(yī)藥和生化產(chǎn)品的綠色清潔生產(chǎn)，能廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、畜牧業(yè)、食品或化工領(lǐng)域，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會意義。作為在畜牧業(yè)中的應(yīng)用，通過直接添加、飲食口服方式使用高含camp的酵母細(xì)胞或其發(fā)酵液及其制劑,可以克服目前研究和應(yīng)用中只能靠注射使用camp純制劑的不足和局限，同時發(fā)揮酵母細(xì)胞培養(yǎng)物和camp保健、促生長(協(xié)同)作用，是一種新型的酵母源生物飼料添加劑和非激素類安全無毒、無污染、無化學(xué)殘留無耐藥性的動物促生長劑，可以替代飼用抗生素的使用和減少養(yǎng)殖過程中的抗生素使用，符合當(dāng)前畜牧業(yè)發(fā)展趨勢，同時也有利于最大限度地降低成本，從而較單純的酵母培養(yǎng)物或單純的camp制劑及其衍生物具有更廣闊的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為實(shí)施例1質(zhì)粒示意圖，其中圖1a為質(zhì)粒puc18-ura3，圖1b為質(zhì)粒puc18-tpk2p-tpk2t-ura3-tpk2t。圖2為實(shí)施例5五個基因缺失菌株camp生產(chǎn)初步評價。圖3為實(shí)施例6質(zhì)粒puc18-h1ynrcδ9-bas1-bas2-h2ynrcδ9-ura3-h2ynrcδ示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明?？梢岳斫獾氖?，在此描述的特定實(shí)施方式通過舉例的方式來表示，其并不作為對本發(fā)明的限制。若非特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。在不偏離于本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實(shí)施方式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會意識到或能夠確認(rèn)，僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，許多等同物都能應(yīng)用于本文所描述的特定步驟中。這些等同物被認(rèn)為處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并且被權(quán)利要求所覆蓋。實(shí)施例中所涉及的幾種培養(yǎng)基如下：1)酵母菌株活化及種子液培養(yǎng)用培養(yǎng)基ypad酵母提取物(yeastextracts)10g/l，蛋白胨(peptone)20g/l，葡萄糖(glucose)20g/l，腺嘌呤(adenine)0.05g/l，自然ph值；固體培養(yǎng)時另加瓊脂粉15g/l。2)使用尿嘧啶(ura)營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記時的轉(zhuǎn)化篩選培養(yǎng)基cmg-ura使用缺省了尿嘧啶的基本培養(yǎng)基cmg平板簡稱cmg-ura平板進(jìn)行篩選。組分如下：氨基酸堿基混合物，0.83g/l；不含氨基酸的酵母氮源yeastnitrogenbase，簡稱ynb，6.7g/l；葡萄糖，20g/l；瓊脂粉，15g/l。其中的氨基酸堿基混合物見表1。表1.氨基酸堿基混合物成分腺嘌呤50mg/l亮氨酸100mg/l精氨酸20mg/l賴氨酸30mg/l天冬氨酸100mg/l甲硫氨酸20mg/l谷氨酸100mg/l苯丙氨酸50mg/l組氨酸100mg/l絲氨酸150mg/l異亮氨酸30mg/l蘇氨酸150mg/l色氨酸l00mg/l酪氨酸30mg/l尿嘧啶50mg/l纈氨酸150mg/l注：省卻特定的氨基酸成分，即可做成選擇培養(yǎng)基。調(diào)ph值5.6，葡萄糖110℃滅菌15min，其它成分121℃滅菌21min，使用前混合。3)5’-foa平板(5’-乳清酸平板)制備方法如下：a、制備100ml5’-foa溶液，包括：ynbw/oaa：1.4gdropoutpowder：0.17g5’-foa：0.2g尿嘧啶：20mg腺嘌呤：10mg亮氨酸：40mg組氨酸：30mg色氨酸：20mg葡萄糖：4g用磁力攪拌器于45℃下不停攪拌，使其各個組分全部溶解，之后過濾除菌；b、制備100ml瓊脂粉agar溶液，使其最終濃度達(dá)到3.0％，121℃滅菌15min后，將其冷卻至45℃；c、將100ml5’-foa與100mlagar溶液混勻，防止出現(xiàn)氣泡，倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷卻成型。4)大腸桿菌培養(yǎng)用lb培養(yǎng)基酵母提取物(yeastextracts)5g/l，蛋白胨(peptone)10g/l，氯化鈉(nacl)10g/l，調(diào)ph值至7.0；固體培養(yǎng)時另加瓊脂粉15g/l。需要時添加抗生素，氨芐青霉素的添加終濃度100μg/ml。實(shí)施例中所涉及的引物序列見表2。表2實(shí)施例中用到的引物序列實(shí)施例中，釀酒酵母菌株w303-1a(＝atcc208352)可以從美國atcc購得。ycplac33可從invitrogen公司買到。puc18、yiplac211可從invitrogen公司、promega公司、biovectorco.,ltd等多家公司買到。實(shí)施例1：構(gòu)建缺失tpk2基因的酵母菌株利用同源重組雙交換機(jī)制缺失酵母染色體上的tpk2基因，首先構(gòu)建缺失用質(zhì)粒puc18-tpk2p-tpk2t-ura3-tpk2t，此質(zhì)粒經(jīng)酶切線性化后轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，以ura3為篩選標(biāo)記基因篩選得到以tpk2p和ura3下游的tpk2t為左、右同源臂發(fā)生雙交換得到的酵母菌株tpk2△::ura3；再以5’-foa平板篩選得到菌株tpk2△::ura3染色體上ura3左、右兩側(cè)tpk2t之間發(fā)生重組而彈出ura3基因的酵母目的菌株tpk2△。構(gòu)建和鑒定用引物見表2，示意圖見圖1。一、puc18-tpk2p-tpk2t-ura3-tpk2t構(gòu)建此質(zhì)粒的構(gòu)建涉及四個連接：(1)puc18-ura3構(gòu)建以質(zhì)粒ycplac33為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增ura3基因，使用表2中的seqidno.1、seqidno.2所示序列為上、下游引物p1、p2，全式金公司生產(chǎn)的fastpfu聚合酶，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，共32個循環(huán)。得到1055bp的pcr片段，使用限制性內(nèi)切酶bamhi和sali雙酶酶切此片段和載體質(zhì)粒puc18，t4dna連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到質(zhì)粒puc18-bamhi-ura3-sali(簡稱puc18-ura3，見圖1a)。(2)puc18-tpk2t-ura3構(gòu)建提取釀酒酵母菌株w303-1a染色體，以w303-1a染色體為模板進(jìn)行pcr，擴(kuò)增tpk2基因的終止子區(qū)(簡稱為tpk2t)，使用表2中的seqidno.3、seqidno.4所示序列為上、下游引物p3、p4，全式金公司生產(chǎn)的fastpfu聚合酶，50℃退火1min，72℃延伸0.5min，共32個循環(huán)。得到526bp的pcr片段，使用限制性內(nèi)切酶kpni和bamhi雙酶酶切此片段和載體質(zhì)粒puc18-ura3，t4dna連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到質(zhì)粒puc18-tpk2t-ura3。(3)puc18-tpk2p-tpk2t-ura3構(gòu)建提取w303-1a染色體，以w303-1a染色體為模板進(jìn)行pcr，擴(kuò)增tpk2基因的啟動子區(qū)(簡稱為tpk2p)，使用表2中的seqidno.5、seqidno.6所示序列為上、下游引物p5、p6，全式金公司生產(chǎn)的fastpfu聚合酶，50℃退火1min，72℃延伸0.5min，共32個循環(huán)。得到532bp的pcr片段，使用限制性內(nèi)切酶saci和kpni雙酶酶切此片段和載體質(zhì)粒puc18-tpk2t-ura3，t4dna連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到質(zhì)粒puc18-tpk2p–tpk2t-ura3。(4)puc18-tpk2p-tpk2t-ura3-tpk2t構(gòu)建將上述(2)中擴(kuò)增的含tpk2t序列的pcr產(chǎn)物用sali和psti雙酶酶切，與同樣雙酶酶切的puc18-tpk2p-tpk2t-ura3大片段連接，得到質(zhì)粒puc18-tpk2p-tpk2t-ura3-tpk2t(見圖1b)。二、w303-1a(tpk2△)菌株構(gòu)建將質(zhì)粒puc18-tpk2p-tpk2t-ura3-tpk2t用saci和psti雙酶酶切，得到線性化dna片段tpk2p-tpk2t-ura3-tpk2t；然后利用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母w303-1a菌株感受態(tài)細(xì)胞，使用尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記(ura)進(jìn)行篩選，即使用cmg-ura平板進(jìn)行篩選，對得到的轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行ypad液體培養(yǎng)，提取染色體dna，以其為模板進(jìn)行pcr法驗(yàn)證，引物對為表2中的seqidno.7、seqidno.8所示序列為上、下游引物p7、p8，整合成功、含有ura基因的轉(zhuǎn)化子pcr產(chǎn)物為2592bp，對照菌株pcr產(chǎn)物為2299bp。陽性轉(zhuǎn)化子菌株命名為w303-1a(tpk2△::ura3)。進(jìn)一步將菌株w303-1a(tpk2△::ura3)平板生長菌體涂布于5’-foa平板上，從而篩選出通過整合在染色體上的兩個相同序列(tpk2t)之間同源重組而彈出ura3片段的菌落。用同上的引物對p7、p8驗(yàn)證，成功彈出ura3的目的菌株的pcr產(chǎn)物長1053bp，沒有彈出ura3的宿主菌株w303-1a(tpk2△::ura3)的pcr片段長2592bp。對1053bppcr產(chǎn)物進(jìn)行了測序，測序結(jié)果證明發(fā)生了預(yù)期的變化：tpk2基因的起始密碼子前的2個堿基、整個orf區(qū)和終止密碼子之后的107個堿基被完全缺失。這樣，最終得到tpk2基因缺失、ura3基因彈出的陽性轉(zhuǎn)化子菌株w303-1a(tpk2△)。實(shí)施例2：構(gòu)建缺失tpk1或tpk3基因的酵母菌株一、w303-1a(tpk1△)構(gòu)建tpk1基因缺失用質(zhì)粒puc18-tpk1p-tpk1t-ura3-tpk1t的構(gòu)建：以實(shí)施例1中(1)puc18-ura3質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建質(zhì)粒puc18-tpk1p-tpk1t-ura3-tpk1t，過程與實(shí)施例1中經(jīng)過(2)、(3)和(4)步驟最終得到puc18-tpk2p-tpk2t-ura3-tpk2t的過程一樣，使用的引物對：擴(kuò)增tpk1t為表2中的seqidno.9、seqidno.10所示序列為上、下游引物p9、p10，產(chǎn)物516bp；擴(kuò)增tpk1p為表2中的seqidno.11、seqidno.12所示序列為上、下游引物p11、p12，產(chǎn)物572bp。將質(zhì)粒puc18–tpk1p-tpk1t-ura3-tpk1t用saci和psti雙酶酶切，得到線性化dna片段tpk1p-tpk1t-ura3-tpk1t；然后轉(zhuǎn)化釀酒酵母w303-1a菌株感受態(tài)細(xì)胞，使用尿嘧啶(ura)營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選，即使用cmg-ura平板進(jìn)行篩選，對得到的轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)一步用pcr法驗(yàn)證，引物對為表2中的seqidno.13、seqidno.14所示序列為上、下游引物p13、p14，整合成功的轉(zhuǎn)化子pcr產(chǎn)物為2631bp，對照菌株pcr產(chǎn)物為2476bp。陽性轉(zhuǎn)化子菌株命名為w303-1a(tpk1△::ura3)。進(jìn)一步將菌株w303-1a(tpk1△::ura3)平板生長菌體涂布于5’-foa(5’-乳清酸)平板上，從而篩選出通過整合在染色體上的兩個相同序列(tpk1t)之間同源重組而彈出ura3片段的菌落。用同上的引物對p13、p14驗(yàn)證，成功彈出ura3的目的菌株的pcr產(chǎn)物長1102bp，沒有彈出ura3的對照pcr片段長2631bp。對1102bppcr產(chǎn)物進(jìn)行了測序，測序結(jié)果證明發(fā)生了預(yù)期的變化：tpk1基因的起始密碼子前的70個堿基、整個orf區(qū)和終止密碼子之后的116個堿基被完全缺失。這樣，最終得到tpk1基因缺失、ura3基因彈出的陽性轉(zhuǎn)化子菌株w303-1a(tpk1△)。二、w303-1a(tpk3△)構(gòu)建tpk3基因缺失用質(zhì)粒的構(gòu)建：以實(shí)施例1中(1)puc18-ura3質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建質(zhì)粒puc18–tpk3p-tpk3t-ura3-tpk3t的過程與實(shí)施例1中經(jīng)過(2)、(3)和(4)步驟最終得到puc18-tpk2p-tpk2t-ura3-tpk2t的過程一樣，使用的引物對：擴(kuò)增tpk3t為表2中的seqidno.15、seqidno.16所示序列為上、下游引物p15、p16，產(chǎn)物566bp；擴(kuò)增tpk3p為表2中的seqidno.17、seqidno.18所示序列為上、下游引物p17、p18，產(chǎn)物545bp。將質(zhì)粒puc18-tpk3p-tpk3t-ura3-tpk3t用saci和psti雙酶酶切，得到線性化dna片段tpk3p-tpk3t-ura3-tpk3t；然后轉(zhuǎn)化釀酒酵母w303-1a菌株感受態(tài)細(xì)胞，同實(shí)施例1中“w303-1a(tpk2△)菌株構(gòu)建”方法篩選、鑒定得到w303-1a(tpk3△::ura3)菌株和w303-1a(tpk3△)菌株。pcr方法驗(yàn)證用引物對為表2中的seqidno.19、seqidno.20所示序列為上、下游引物p19、p20，整合成功、含有ura3基因的轉(zhuǎn)化子pcr產(chǎn)物為2695bp，整合成功、ura3基因彈出的轉(zhuǎn)化子pcr產(chǎn)物為1116bp，對照菌株pcr產(chǎn)物為2400bp。對1116bppcr產(chǎn)物進(jìn)行了測序，測序結(jié)果證明發(fā)生了預(yù)期的變化：tpk3基因的整個orf區(qū)和終止密碼子之后的93個堿基被完全缺失。這樣，最終得到tpk3基因缺失、ura3基因彈出的陽性轉(zhuǎn)化子菌株w303-1a(tpk3△)。實(shí)施例3：構(gòu)建缺失yak1基因的酵母菌株yak1基因缺失用質(zhì)粒的構(gòu)建：以實(shí)施例1中(1)puc18-ura3質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建質(zhì)粒puc18–yak1p-yak1t-ura3-yak1t的過程與實(shí)施例1中經(jīng)過(2)、(3)和(4)步驟最終得到puc18-tpk1p-tpk1t-ura3-tpk1t的過程一樣，使用的引物對：擴(kuò)增yak1t為表2中的seqidno.21、seqidno.22所示序列為上、下游引物p21、p22，產(chǎn)物506bp；擴(kuò)增yak1p為表2中的seqidno.23、seqidno.24所示序列為上、下游引物p23、p24，產(chǎn)物504bp。yak1基因缺失菌株的構(gòu)建：將質(zhì)粒puc18–yak1p-yak1t-ura3-yak1t用saci和psti雙酶酶切，得到線性化dna片段yak1p-yak1t-ura3-yak1t；然后轉(zhuǎn)化釀酒酵母w303-1a菌株感受態(tài)細(xì)胞，同實(shí)施例1中“w303-1a(tpk2△)菌株構(gòu)建”方法篩選、鑒定得到w303-1a(yak1△::ura3)菌株和w303-1a(yak1△)菌株。pcr方法驗(yàn)證用引物對為表2中的seqidno.25、seqidno.26所示序列為上、下游引物p25、p26，整合成功、含有ura3基因的轉(zhuǎn)化子pcr產(chǎn)物為2529bp，整合成功、ura3基因彈出的轉(zhuǎn)化子pcr產(chǎn)物為1010bp，對照菌株pcr產(chǎn)物為3614bp。對1010bppcr產(chǎn)物進(jìn)行了測序，測序結(jié)果證明發(fā)生了預(yù)期的變化：yak1基因的起始密碼子之前40個堿基、整個orf區(qū)和終止密碼子之后的146個堿基被完全缺失。這樣，最終得到y(tǒng)ak1基因缺失、ura3基因彈出的陽性轉(zhuǎn)化子菌株w303-1a(yak1△)。實(shí)施例4：構(gòu)建同時缺失tpk1、tpk2、tpk3、yak1基因的酵母菌株下面分四個步驟構(gòu)建得到同時缺失四個基因的菌株。事實(shí)上本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，除了在單倍體酵母細(xì)胞中同時失活tpk1、tpk2、tpk3的組合(此組合因生長缺陷而不能存活)以外，上述四個基因可以不分先后、任一組合的被修飾。一、缺失yak1基因同實(shí)施例3方法構(gòu)建得到w303-1a(yak1△)菌株。二、缺失yak1和tpk1基因?qū)?shí)施例2中構(gòu)建的缺失用質(zhì)粒puc18-tpk1p-tpk1t-ura3-tpk1t用saci和psti雙酶酶切，得到線性化dna片段tpk1p-tpk1t-ura3-tpk1t；然后轉(zhuǎn)化步驟一中的w303-1a(yak1△)菌株感受態(tài)細(xì)胞，使用尿嘧啶(ura)營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選，即使用cmg-ura平板進(jìn)行篩選，對得到的轉(zhuǎn)化子菌株用同實(shí)施例2中相同的方法鑒定得到tpk1缺失菌株w303-1a(yak1△)(tpk1△::ura3)，并進(jìn)一步反選得到w303-1a(yak1△)(tpk1△)菌株。三、缺失tpk2和tpk3基因從w303-1a經(jīng)過交配型轉(zhuǎn)換獲得與w303-1a菌株除交配型外基因型完全相同的w303-1b菌株(matαleu2-3,112ura3-1trp1-92his3-11,15ade2-1can1-100)，以w303-1b為宿主，順次敲除tpk2、tpk3兩個基因。將實(shí)施例1中構(gòu)建的質(zhì)粒puc18-tpk2p-tpk2t-ura3-tpk2t用saci和psti雙酶酶切，得到線性化dna片段tpk2p-tpk2t-ura3-tpk2t；然后轉(zhuǎn)化釀酒酵母w303-1b菌株感受態(tài)細(xì)胞，同實(shí)施例1中“w303-1a(tpk2△)菌株構(gòu)建”方法篩選、鑒定得到w303-1b(tpk2△::ura3)菌株和w303-1b(tpk2△)菌株。將實(shí)施例2中構(gòu)建的質(zhì)粒puc18-tpk3p-tpk3t-ura3-tpk3t用saci和psti雙酶酶切，得到線性化dna片段tpk3p-tpk3t-ura3-tpk3t；然后轉(zhuǎn)化釀酒酵母w303-1b(tpk2△)菌株感受態(tài)細(xì)胞，同實(shí)施例1中“w303-1a(tpk2△)菌株構(gòu)建”方法篩選、鑒定得到w303-1b(tpk2△tpk3△::ura3)菌株和w303-1b(tpk2△tpk3△)菌株。四、同時缺失tpk1、tpk2、tpk3、yak1基因?qū)303-1a(tpk1△yak1△)菌株與w303-1b(tpk2△tpk3△)菌株進(jìn)行雜交，得到二倍體菌株，然后通過產(chǎn)孢、拆孢使等位基因分離，篩選、鑒定得到w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△)和w303-1b(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△)。鑒定四個基因敲除的驗(yàn)證引物同前。對鑒定所得pcr產(chǎn)物的測序結(jié)果證明兩個菌株中染色體上的四個基因核酸序列均發(fā)生了預(yù)期的變化，全部被缺失了orf區(qū)。五、四個基因缺失菌株的生長和發(fā)酵生產(chǎn)胞外camp評價對上述四個基因缺失菌株進(jìn)行了生長和發(fā)酵生產(chǎn)胞外camp評價，操作如下：1、種子液培養(yǎng)：挑取ypad固體培養(yǎng)基平板上生長的菌落，接入裝有5mlypad培養(yǎng)液的試管中，30℃、220rpm過夜培養(yǎng)，必要時進(jìn)行二次擴(kuò)大培養(yǎng)；2、發(fā)酵：發(fā)酵用培養(yǎng)基：酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，自然ph值；將新鮮種子液接種到裝有25ml發(fā)酵培養(yǎng)基的100ml容量瓶中，控制初始o(jì)d600值在0.1左右，30℃、220rpm下發(fā)酵；3、發(fā)酵液的od600測定：將發(fā)酵樣品適當(dāng)稀釋后測定od600，檢測生長情況；4、hplc分析發(fā)酵上清液camp濃度即胞外camp濃度：hplc分析camp的方法參照《中華人民共和國藥典：2010年版》(國家藥典委員會編)第419頁的方法而有調(diào)整。具體操作如下：1)將發(fā)酵樣品在13000rpm、1min條件下離心，取上清進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用孔徑0.22μm的濾膜過濾，濾液用于色譜檢測：檢測波長258nm，thermosyncronisc18色譜柱，流動相為(5.78g/lkh2po4，2.72g/l四丁基溴化銨):乙腈＝85:15用磷酸調(diào)節(jié)ph至4.3，流速1ml/min，柱溫35℃；2)camp標(biāo)準(zhǔn)樣品的配置及標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：先將camp標(biāo)準(zhǔn)品用滅菌后的去離子水配置成濃度為50mmol/l的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用去離子水對其進(jìn)行稀釋，得到終濃度分別為1、3、5、7.5和10μmol/l的標(biāo)準(zhǔn)樣品，用0.2μm濾膜過濾標(biāo)準(zhǔn)樣品后進(jìn)行hplc分析，以峰面積對camp濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線；3)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線由外標(biāo)定量法計(jì)算出發(fā)酵液樣品中camp的濃度。96h內(nèi)的生長和發(fā)酵生產(chǎn)胞外camp評價結(jié)果見表3。表3、四個基因缺失菌株的生長和camp生產(chǎn)評價菌株名稱最大od600最高胞外camp濃度(μmol/l)w303-1a21.1(48h)1.39(60h)w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△)35.0(48h)200.2(24h)w303-1b(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△)33.5(48h)215.6(24h)由表3可知：兩個缺失菌株的最大胞外camp濃度分別是對照菌株w303-1a最大胞外camp濃度的144.0和155.1倍。需要說明的是：兩個缺失菌株在0-24h內(nèi)camp濃度迅速升高，24h達(dá)到最高值以后，camp濃度略有下降，但一直到96h時仍然保持在180μmol/l以上。實(shí)施例5：構(gòu)建同時缺失tpk1、tpk2、tpk3、yak1、pde1基因的酵母菌株一、缺失pde1基因以w303-1a染色體為模板進(jìn)行pcr，擴(kuò)增pde1基因的終止子區(qū)(簡稱為pde1t)，使用表2中的seqidno.27、seqidno.28所示序列為上、下游引物p27、p28，全式金公司生產(chǎn)的fastpfu聚合酶，50℃退火1min，72℃延伸0.5min，共32個循環(huán)。得到500bp的pcr片段，使用限制性內(nèi)切酶kpni和bamhi雙酶酶切此片段和載體質(zhì)粒puc18-ura3，t4dna連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到質(zhì)粒puc18-pde1t-ura3。以w303-1a染色體為模板進(jìn)行pcr，擴(kuò)增pde1基因的啟動子區(qū)(簡稱為pde1p)，使用表2中的seqidno.29、seqidno.30所示序列為上、下游引物p29、p30，全式金公司生產(chǎn)的fastpfu聚合酶，50℃退火1min，72℃延伸0.5min，共32個循環(huán)。得到544bp的pcr片段，使用限制性內(nèi)切酶saci和kpni雙酶酶切此片段和載體質(zhì)粒puc18-pde1t-ura3，t4dna連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到質(zhì)粒puc18-pde1p-pde1t-ura3。將上述擴(kuò)增的含pde1t序列的pcr產(chǎn)物用sali和psti雙酶酶切，與同樣雙酶酶切的puc18-pde1p-pde1t-ura3大片段連接，得到質(zhì)粒puc18-pde1p-pde1t-ura3-pde1t。將質(zhì)粒puc18-pde1p-pde1t-ura3-pde1t用saci和psti雙酶酶切，用與實(shí)施例1中“w303-1a(tpk2△)菌株構(gòu)建”中相同的方法，以實(shí)施例4中構(gòu)建的w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△)為宿主，構(gòu)建得到w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△::ura3)和w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△)。pcr方法驗(yàn)證用引物對為表2中的seqidno.31、seqidno.32所示序列為上、下游引物p31、p32，整合成功、含有ura3基因的轉(zhuǎn)化子pcr產(chǎn)物為2958bp，整合成功、ura3基因彈出的轉(zhuǎn)化子pcr產(chǎn)物為1445bp，對照菌株pcr產(chǎn)物為2635bp。對1445bppcr產(chǎn)物進(jìn)行了測序，測序結(jié)果證明發(fā)生了預(yù)期的變化：pde1基因的起始密碼子之前40個堿基、整個orf區(qū)和終止密碼子之后的46個堿基被完全缺失。這樣，最終得到pde1基因缺失、ura3基因彈出的陽性轉(zhuǎn)化子菌株。二、w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△::ura3)和w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△)的camp生產(chǎn)對比為對比考察一下選擇標(biāo)記基因ura3存在對camp生產(chǎn)可能的影響，進(jìn)行了兩個菌株的camp生產(chǎn)初步評價。1、種子液培養(yǎng)同實(shí)施例4；2、發(fā)酵：1)發(fā)酵用培養(yǎng)基：酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，自然ph值；2)發(fā)酵條件為：新鮮種子液接種到裝有25ml發(fā)酵培養(yǎng)基的100ml容量瓶中，控制初始o(jì)d600值在0.1左右，30℃、220rpm下發(fā)酵。發(fā)酵液分析同實(shí)施例4中的hplc分析方法。120h內(nèi)的胞外camp生產(chǎn)結(jié)果見圖2。圖2結(jié)果顯示：1、兩個缺失菌株120h內(nèi)的最大胞外camp濃度分別為252.0、953.8μmol/l，分別為對照菌株w303-1a最大胞外camp濃度(1.45μmol/l)的173.8、657.8倍，為實(shí)施例4里w303-1b(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△)菌株最大胞外camp濃度的1.17、4.42倍；2、w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△::ura3)的camp濃度48h起基本穩(wěn)定，而w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△)的camp濃度則一直上升；3、不保留選擇標(biāo)記ura3可以明顯提高camp產(chǎn)量。三、w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△)的生長和camp生產(chǎn)評價進(jìn)行了不帶ura3的五個基因缺失菌株的生長和發(fā)酵生產(chǎn)胞外camp評價：1、種子液培養(yǎng)同實(shí)施例4；2、發(fā)酵：1)發(fā)酵用培養(yǎng)基：酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20～150g/l，自然ph值；2)發(fā)酵條件為：新鮮種子液接種到裝有25ml發(fā)酵培養(yǎng)基的100ml容量瓶中，控制初始o(jì)d600值在1左右，30℃、220rpm下發(fā)酵。發(fā)酵液分析同實(shí)施例4中的hplc分析方法。120h內(nèi)的生長和發(fā)酵生產(chǎn)胞外camp評價結(jié)果見表4。表4、五個基因缺失菌株的生長和camp生產(chǎn)評價葡萄糖濃度(g/l)最大od600最高胞外camp濃度(μmol/l)2031.1(24h)981.0(48h)5035.0(48h)2223.7(72h)10063.7(72h)3596.6(96h)15069.5(72h)3925.6(96h)根據(jù)上述結(jié)果可知：培養(yǎng)基中的碳源可顯著影響胞外camp的產(chǎn)量，隨著葡萄糖濃度由20g/l上升到150g/l，胞外camp的產(chǎn)量也由981.0μmol/l上升到3925.6μmol/l。實(shí)施例6：bas1-bas2融合共表達(dá)將bas1和bas2基因進(jìn)行融合共表達(dá)，并整合到酵母細(xì)胞的染色體上。為此首先需要構(gòu)建帶有左、右同源臂的融合共表達(dá)整合載體。這里選擇的整合位點(diǎn)是被文獻(xiàn)報(bào)道(baiflagfeldtd,siewersv,huangl,etal.characterizationofchromosomalintegrationsitesforheterologousgeneexpressioninsaccharomycescerevisiae.yeast,2009,26(10):545-551)有較高基因表達(dá)效率的ynrcδ9，位于染色體xiv上。一、bas1-bas2融合共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建共4個連接得到bas1-bas2融合共表達(dá)質(zhì)粒puc18-h1ynrcδ9-bas1-bas2-h2ynrcδ9-ura3-h2ynrcδ9(示意圖見圖3)。1、puc18-h1ynrcδ9-saci-sali-h2ynrcδ9質(zhì)粒構(gòu)建以w303-1a的染色體dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增ynrcδ9的部分序列作為整合的左、右同源臂。使用表2中的seqidno.33、seqidno.34所示序列為上、下游引物p33、p34，全式金公司生產(chǎn)的fastpfu聚合酶，50℃退火1min，72℃延伸45sec，共32個循環(huán)，得到521bp的pcr1片段(對應(yīng)序列用作整合的左同源臂h1ynrcδ9)。使用表2中的seqidno.35、seqidno.36所示序列為上、下游引物p35、p36，同法擴(kuò)增得到448bp的pcr2片段(對應(yīng)序列用作整合的右同源臂h2ynrcδ9)。再以pcr1、pcr2產(chǎn)物為模板，以p33、p36為引物對，交叉重疊延伸pcr反應(yīng)擴(kuò)增得到949bp的pcr12片段。此片段的5’端添加有酶切位點(diǎn)ecori，3’端添加有酶切位點(diǎn)bamhi，中間添加有酶切位點(diǎn)saci、sali。將pcr產(chǎn)物用ecori和bamhi雙酶酶切，與同樣雙酶酶切的puc18大片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到質(zhì)粒puc18-h1ynrcδ9-saci-sali-h2ynrcδ9。測序證明克隆片段沒有突變。2、puc18-h1ynrcδ9-saci-sali-h2ynrcδ9-ura3-h2ynrcδ9質(zhì)粒構(gòu)建以ycplac33為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增ura3基因用作整合時的選擇標(biāo)記基因。使用表2中的seqidno.37、seqidno.38所示序列為上、下游引物p37、p38，全式金公司生產(chǎn)的fastpfu聚合酶，50℃退火1min，72℃延伸1min，共32個循環(huán)，得到1060bp的pcr1片段。仍以w303-1a的染色體dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增h2ynrcδ9片段，但上、下游引物對換成表2中的seqidno.39、seqidno.40所示序列為p39、p40，擴(kuò)增得到438bp的pcr2片段。再以pcr1、pcr2產(chǎn)物為模板，以p37、p40為引物對，交叉重疊延伸pcr反應(yīng)擴(kuò)增得到1478bp的pcr12片段。此片段的5’端添加有酶切位點(diǎn)bamhi，3’端添加有酶切位點(diǎn)hindiii。將pcr產(chǎn)物用bamhi和hindiii雙酶酶切，與同樣雙酶酶切的puc18-h1ynrcδ9-saci-sali-h2ynrcδ9大片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到質(zhì)粒puc18-h1ynrcδ9-saci-sali-h2ynrcδ9-ura3-h2ynrcδ9。測序證明克隆片段沒有突變。3、pgem-teasy-bas1-bas2質(zhì)粒構(gòu)建以w303-1a的染色體dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增基因bas1，使用表2中的seqidno.41、seqidno.42所示序列為上、下游引物p41、p42，全式金公司生產(chǎn)的fastpfu聚合酶，50℃退火1min，72℃延伸2.5min，共32個循環(huán)。得到2907bp的pcr1片段，此片段5’端添加有酶切位點(diǎn)saci，包含bas1基因起始密碼子atg上游762bp序列和包括atg在內(nèi)的2112bporf序列，刪除了orf的3′端324bp(含終止密碼子)序列。以w303-1a的染色體dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增基因bas2，使用表2中的seqidno.43、seqidno.44所示序列為上、下游引物p43、p44，全式金公司生產(chǎn)的fastpfu聚合酶，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，共32個循環(huán)。得到1692bp的pcr2片段，其3’端添加有酶切位點(diǎn)sali；包含bas2基因orf全部序列(含終止密碼子)。以pcr1、pcr2產(chǎn)物為模板，以p41、p44為引物對，交叉重疊延伸pcr反應(yīng)擴(kuò)增得到4578bp的pcr12片段。將此pcr片段進(jìn)行加a尾反應(yīng)后，瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收，按說明書操作要求與購自promega公司的pgem-teasy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到質(zhì)粒pgem-teasy-bas1-bas2。測序證明克隆片段沒有突變。4、puc18-h1ynrcδ9-bas1-bas2-h2ynrcδ9-ura3-h2ynrcδ9質(zhì)粒構(gòu)建用saci、sali雙酶酶切質(zhì)粒pgem-teasy-bas1-bas2，回收大片段saci-bas1-bas2-sali，與同樣雙酶酶切的puc18-h1ynrcδ9-saci-sali-h2ynrcδ9-ura3-h2ynrcδ9大片段連接，得到整合質(zhì)粒puc18-h1ynrcδ9-bas1-bas2-h2ynrcδ9-ura3-h2ynrcδ9。二、菌株w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△bas1bas2)構(gòu)建將質(zhì)粒puc18-h1ynrcδ9-bas1-bas2-h2ynrcδ9-ura3-h2ynrcδ9用pvuii酶切，得到線性化dna片段h1ynrcδ9-bas1-bas2-h2ynrcδ9-ura3-h2ynrcδ9；然后轉(zhuǎn)化w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△)菌株感受態(tài)細(xì)胞，同實(shí)施例1中“w303-1a(tpk2△)菌株構(gòu)建”方法篩選、鑒定得到w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△bas1bas2-ura3)菌株和w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△bas1bas2)菌株。pcr方法驗(yàn)證用引物對為表2中的seqidno.45、seqidno.46所示序列為上、下游引物p45、p46，整合成功、含有ura3基因的轉(zhuǎn)化子pcr產(chǎn)物為7389bp，整合成功、ura3基因彈出的轉(zhuǎn)化子pcr產(chǎn)物為5929bp，對照菌株pcr產(chǎn)物為1687bp。對5929bppcr產(chǎn)物的測序結(jié)果證明染色體上發(fā)生了預(yù)期的變化：ynrcδ9位點(diǎn)有321bp序列被敲除，替代插入的是bas1bas2融合片段，此片段沒有發(fā)生突變；不含ura3基因。三、菌株w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△bas1bas2)的生長和camp生產(chǎn)評價實(shí)施例5已經(jīng)證明了葡萄糖濃度顯著影響camp的生產(chǎn)。鑒于camp合成所需組分(分子式為c10hl2n5o6p)，在葡萄糖濃度提高的同時，推測培養(yǎng)基中氮、磷的含量尤其是氮的含量可能成為camp合成的首要制約因素。另外，作為camp合成的前提物，胞外腺嘌呤的狀況也極大地影響嘌呤合成途徑各基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響camp生產(chǎn)。因此，這里對比考察了上述菌株在兩個酵母提取物/蛋白胨含量水平(1*yp、2*yp)、添加腺嘌呤下的camp生產(chǎn)情況。具體操作如下：1、種子液培養(yǎng)同實(shí)施例4；2、發(fā)酵：1)發(fā)酵用培養(yǎng)基：酵母提取物10g/l、蛋白胨20g/l，簡記為1*yp，葡萄糖150g/l，自然ph值；酵母提取物20g/l，蛋白胨40g/l，簡記為2*yp，葡萄糖150g/l，自然ph值；腺嘌呤的添加量為0.625、1.25g/l，簡稱為a0.625、a1.25；2)發(fā)酵條件為：新鮮種子液接種到裝有25ml發(fā)酵培養(yǎng)基的100ml容量瓶中，控制初始o(jì)d600值在1左右，30℃、220rpm下發(fā)酵；3)發(fā)酵液分析：同實(shí)施例4中的hplc分析方法，同時補(bǔ)充腺嘌呤的hplc分析：a、樣品處理和hplc分析與camp分析的樣品處理和hplc分析相同；b、腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品用滅菌后的去離子水配置成濃度為5mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用去離子水對其進(jìn)行稀釋，得到終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)樣，過濾除菌后進(jìn)行色譜分析，做標(biāo)準(zhǔn)曲線；c、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線由外標(biāo)定量法計(jì)算出發(fā)酵液樣品中腺嘌呤的濃度。發(fā)酵結(jié)果見表5。表5結(jié)果表明：1、同為1*yp、葡萄糖15％的發(fā)酵條件下，融合共表達(dá)bas1-bas2菌株最大胞外camp濃度較實(shí)施例5里的w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△)菌株最大胞外camp濃度(3925.6μmol/l)有所提高，前者為后者的1.108倍；2、提高酵母粉和蛋白胨濃度效果極為顯著；3、添加腺嘌呤能進(jìn)一步提高胞外camp產(chǎn)量。表5、w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△bas1-bas2)菌株的camp生產(chǎn)評價組分最大od600最高camp濃度(μmol/l)比例比例1*yp,葡萄糖150g/l70.1(72h)4348.8(120h)1—2*yp,葡萄糖150g/l71.6(96h)8291.5(168h)1.90712*yp,葡萄糖150g/l,a0.62568.4(120h)9265.3(168h)2.1311.1172*yp,葡萄糖150g/l,a1.2564.4(120h)9721.6(168h)2.2351.172實(shí)施例7：fcy2過表達(dá)通過酵母整合載體yiplac211將fcy2基因整合到酵母細(xì)胞的染色體上進(jìn)行過表達(dá)。以w303-1a染色體dna為模板，以引物p47和p48為引物對合成558bp、含pgk1基因啟動子區(qū)ppgk1的產(chǎn)物pcr1，以引物p49和p50為引物對合成1630bp、含fcy2基因的產(chǎn)物pcr2，以p51和p52為引物對合成481bp、含pgk1基因終止子區(qū)tpgk1的產(chǎn)物pcr3。再以pcr1和pcr2片段為模板、以p47和p50為引物對，交叉重疊延伸擴(kuò)增得到產(chǎn)物pcr12。最后以pcr12和pcr3片段為模板、以p47和p52為引物對，擴(kuò)增得到產(chǎn)物pcr123。將產(chǎn)物pcr123用sphi和ecori雙酶酶切后，與同樣雙酶酶切的載體yiplac211大片段連接，得到6.3kb大小的質(zhì)粒yiplac211-ppgk1-fcy2-tpgk1。此質(zhì)粒的測序結(jié)果證明克隆片段ppgk1-fcy2-tpgk1沒有突變，用stui酶切線性化后醋酸鋰法轉(zhuǎn)化實(shí)施例5里的菌株w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△)感受態(tài)細(xì)胞,用cmg-ura平板進(jìn)行篩選，對得到的轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行ypad液體培養(yǎng)，提取染色體，用p47、p52引物對進(jìn)行pcr鑒定，產(chǎn)物預(yù)期大小為2.6kb。對得到的陽性轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行發(fā)酵評價：1、種子液培養(yǎng)同實(shí)施例4；2、發(fā)酵：發(fā)酵用培養(yǎng)基同實(shí)施例6里的(2*yp,葡萄糖150g/l,a0.625)，發(fā)酵條件同實(shí)施例6；camp最高產(chǎn)量達(dá)到10197.8μmol/l。實(shí)施例8：snq2過表達(dá)通過酵母整合載體yiplac211將snq2基因整合到酵母細(xì)胞的染色體上進(jìn)行過表達(dá)。以w303-1a染色體dna為模板，以引物p53和p54為引物對合成4527bp、含snq2基因orf序列的pcr產(chǎn)物，用sali和bamhi雙切，然后與同樣雙酶酶切的實(shí)施例7質(zhì)粒yiplac211-ppgk1-fcy2-tpgk1大片段連接。此質(zhì)粒的測序結(jié)果證明克隆片段沒有突變，用stui酶切線性化后醋酸鋰法轉(zhuǎn)化實(shí)施例6里的菌株w303-1a(tpk1△tpk2△tpk3△yak1△pde1△bas1bas2)感受態(tài)細(xì)胞，用cmg-ura平板進(jìn)行篩選，對得到的轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行ypad液體培養(yǎng)，提取染色體，用實(shí)施例6里的p47、p52引物對進(jìn)行pcr鑒定，產(chǎn)物預(yù)期大小為5.5kb。對得到的陽性轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行發(fā)酵評價：1、種子液培養(yǎng)同實(shí)施例4；2、發(fā)酵：發(fā)酵用培養(yǎng)基同實(shí)施例6里的(2*yp,葡萄糖100g/l,a0.625)，發(fā)酵條件同實(shí)施例6；camp最高產(chǎn)量達(dá)到11581.6μmol/l。實(shí)施例9：camp生產(chǎn)菌株發(fā)酵液粉劑飼養(yǎng)小白鼠將實(shí)施例5里的菌株按實(shí)施例6里的方法進(jìn)行逐級活化、放大培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基為(2*yp、葡萄糖100g/l)。取168h發(fā)酵液直接冷凍干燥制成粉劑。使用實(shí)驗(yàn)動物飼料作為日糧，將粉劑溶于飲水喂食小白鼠。小白鼠隨機(jī)分為三組，每組8只，自由飲水和采食兩天后開始添加；添加量依次為：0、0.5、10mgcamp/(kg體重)，每2天添加一次和進(jìn)行一次稱重，共添加10次；添加前先禁食≥10h，然后稱重、記錄體重和計(jì)算添加粉劑量，單組使用粉劑溶于20ml飲水。最后一次稱重后采血取樣進(jìn)行血清檢測，并解剖觀察內(nèi)臟。結(jié)果顯示：1、增重：第20天平均體重分別為37.54±1.89g、41.41±0.48g和40.12±1.28g，添加組平均體重較對照組平均體重分別提高10.20％和6.87％，劑量0.5mgcamp/(kg體重)差異顯著(p<0.05)；2、毒性：小白鼠的解剖分析結(jié)果顯示：最大劑量10mgcamp/(kg體重)組與對照組相比，心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟等內(nèi)臟器官均無明顯眼觀病理變化，表明粉劑對小白鼠沒有顯著的急性毒性；3、血清分析結(jié)果顯示：總蛋白平均含量分別為49.90±1.34、57.50±1.85和56.02±1.05g/l，白蛋白平均含量分別為29.52±0.63、34.25±0.86和35.90±0.62g/l，樣品組均極顯著高于對照組(p＜0.01)，說明添加camp制劑確能有效提高機(jī)體蛋白含量。實(shí)施例10：camp生產(chǎn)菌株發(fā)酵液粉劑飼養(yǎng)肉雞將實(shí)施例6里的菌株按實(shí)施例6里的方法進(jìn)行逐級活化和放大培養(yǎng)，然后在發(fā)酵罐里使用發(fā)酵培養(yǎng)基(2*yp、葡萄糖100g/l),30℃、200-700rpm下發(fā)酵120h,發(fā)酵液直接低溫干燥制粉,作為camp粉劑使用。選用1日齡健康白羽肉雞雛180羽，先進(jìn)行6天的適應(yīng)性培養(yǎng)，然后公母各半按體重隨機(jī)分成三個處理，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)20只。三個處理的粉劑添加量分別設(shè)為0.5、2.5、0mgcamp/(kg體重)。每隔5天進(jìn)行一次稱重和一次camp粉劑添加，前后共添加7次、全程培養(yǎng)時間42天。添加前先禁食≥10h和禁水約2h，然后稱重和計(jì)算添加粉劑量。camp粉劑直接添加到飲水中，供應(yīng)此飲水的同時恢復(fù)供料。分別于首次添加后的第25天和第35天(全程培養(yǎng)時間分別為32天和42天)各個重復(fù)取兩只雞進(jìn)行屠宰，分析臟器指數(shù)和血清指標(biāo)。天津市團(tuán)泊洼農(nóng)場養(yǎng)雞場進(jìn)行。采用網(wǎng)上平養(yǎng)方式，家用煤爐供暖控溫。自由采食和飲水。采用滄州宏益飼料有限公司生產(chǎn)的肉小雞配合飼料(0-21日齡用)和肉中雞配合飼料(22-42日齡用)。結(jié)果見表6，由表6可知：1、生長性能上，添加粉劑提高日增重極為顯著(p＜0.01)，而料肉比下降也極為顯著(p＜0.01)；2、臟器指數(shù)上，心臟、肝臟、胃、腸均與對照組沒有明顯差異，表明添加物對臟器刺激作用小、無傷害；與此同時，添加粉劑提高法氏囊指數(shù)顯著(p＜0.05)，表明對肉雞免疫器官的發(fā)育有促進(jìn)作用；3、血清指標(biāo)上，血清中膽固醇和高密度脂蛋白均顯著高于對照組(p＜0.05)，說明添加粉劑能促進(jìn)機(jī)體脂肪代謝和蛋白代謝及其調(diào)控。表6、添加camp粉劑對肉雞生長、臟器和血清生化指標(biāo)的影響指標(biāo)日齡0.5mgcamp/(kg體重)2.5mgcamp/(kg體重)0mgcamp/(kg體重)平均日增重g42d60.63±2.12a73.25±1.86b61.43±1.78a平均日采食量g42d105.96±6.46120.82±3.81111.49±5.50料肉比42d1.748±0.011a1.649±0.006b1.815±0.021a法氏囊指數(shù)42d2.89±0.31a3.81±0.40b2.93±0.38a膽固醇mmol/l42d3.665±0.108a3.666±0.165a3.178±0.227b高密度脂蛋白mmol/l42d2.739±0.055a2.653±0.125a2.248±0.140b注：同列肩標(biāo)小寫字母不同者表示差異顯著(p<0.05)，大寫字母不同者表示差異極顯著(p<0.01)對本發(fā)明實(shí)施例4、實(shí)施例5、實(shí)施例7和實(shí)施例8得到的釀酒酵母發(fā)酵液或發(fā)酵液粉劑也分別進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果呈現(xiàn)基本相似的規(guī)律。實(shí)施例11：camp生產(chǎn)菌株發(fā)酵液制粉劑飼養(yǎng)豬同實(shí)施例10進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液噴霧干燥制粉,作為camp粉劑使用。選擇30kg體重的健康斷奶仔豬12頭，公母各半，隨機(jī)分為3組，每組4頭；3組處理a、處理b、處理c的camp粉劑添加量分別為0.75、1.5和0mgcamp/(kg體重)。每隔5天進(jìn)行一次稱重和一次camp粉劑添加，至體重達(dá)到90kg時結(jié)束。camp粉劑直接添加到飲水中，添加前控制豬空腹≥10h并稱重。飼喂基礎(chǔ)日糧，自由采食和飲水。結(jié)果顯示：1、三組日增重分別為0.715±0.057、0.770±0.063和0.699±0.139kg/d，處理a、b分別較處理c提高2.23％、10.16％,而處理b顯著高于處理c(p＜0.05)；2、三組料肉比分別為2.95±0.11、2.690±0.09和3.01±0.23kg/d，處理a、b分別較處理c降低1.99％、10.63％,而處理b顯著低于處理c(p＜0.05)。結(jié)果證明酵母camp發(fā)酵液粉劑可顯著提高豬的生長性能。將本發(fā)明的釀酒酵母發(fā)酵液或發(fā)酵液粉劑作為反芻類動物和水產(chǎn)類動物的飼料添加劑，也觀察到了相似的結(jié)果。序列表<110>天津大學(xué)<120>一種高產(chǎn)camp的酵母菌株及其應(yīng)用<150>201710709212.0<151>2017-08-17<160>54<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cccgggggatccttgattcggtaatctccgaa32<210>2<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cccggggtcgacctgatataattaaattgaagct34<210>3<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cccggggtcgacggtaccacctaacggatgccttattt38<210>4<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cccgggctgcagggatccgggattttggaccttagact38<210>5<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cccggggagctctcaatttggttgtaagcaac32<210>6<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cccgggggtacccgacaattttcaacagtatg32<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cctcaagataaaccagctgg20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ataatggtgatatcagcacc20<210>9<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cccggggtcgacggtaccgttactacggagatggaacg38<210>10<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cccgggctgcagggatccatccctgaaggcttaaatag38<210>11<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11cccggggagctcctccgttaatcctagtctgt32<210>12<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cccgggggtaccttctgtgctacctttgaagc32<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13atccctcccatcctccttaa20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gaaggagccgcagcattatt20<210>15<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cccggggtcgacggtaccgattcttggtgagtctaaca38<210>16<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16cccgggctgcagggatcctggaacgcttttttgcttgt38<210>17<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17cccggggagctcgtcaacgtttcagatactct32<210>18<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18cccgggggtacctttgtgcaggctcgctcttt32<210>19<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19gcgactatgcatttttgcaaaa22<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20cggagccttcatgagataaa20<210>21<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21cccggggtcgacggtaccaaagtttctgcactagcttt38<210>22<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22cccgggctgcagggatccagagagaggacccatggaat38<210>23<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23cccggggagctcctttcgccctcaaactcaac32<210>24<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24cccgggggtaccatgttcccttgcacaatggc32<210>25<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25caatacggatgaatatttgtg21<210>26<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26acttttgattgcgctgtgaa20<210>27<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27cccggggtcgacggtaccaaattcattacccgggagca38<210>28<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28cccgggctgcagggatccatgctggaaccctcatatga38<210>29<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29cccggggagctccagacatatagtctcgaaga32<210>30<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30cccgggggtacccctcgttaaaagccactttc32<210>31<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31aatcttactttggcgaatg19<210>32<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32acactatttccttgttcatac21<210>33<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33gcgcgcgaattccgtattgaccattcctaa30<210>34<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34tcgactcccgggtaccgagctctatcgtatcgcagccta39<210>35<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gctcggtacccgggagtcgactgtagacctaagttcat38<210>36<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36atattaggatccgccttgcttacctagatg30<210>37<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37gcgttaggatccgattcggtaatctccg28<210>38<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38aggtctacaggggtaataactgatat26<210>39<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39gttattacccctgtagacctaagttcat28<210>40<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40cgtacgaagcttgccttgcttacctagatg30<210>41<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41gggcccgagctctctttagccgtaattgcgaa32<210>42<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42gtacgagaattcttccatcatggatgtagtccttgatatctc42<210>43<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43atgatggaagaattctcgtac21<210>44<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44gggcccgtcgactcatatccatctatgctcgtc33<210>45<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45tcaactttgggattactgc19<210>46<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>46ctcatcatttgcgtcatct19<210>47<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>47gggcccgcatgcctgcagaagaaattaccgtcgc34<210>48<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>48acatgtcgacagacattgttttatatttgt30<210>49<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>49aacaatgtctgtcgacatgttggaagagggaaat34<210>50<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>50tttaggatcctcctaacgaccgaagtattt30<210>51<211>36<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>51gtcgttaggaggatcctaaattgaattgaattgaaa36<210>52<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>52gggcccgaattcgagctcggtacccggggac31<210>53<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>53gggcccgtcgacatgagcaatatcaaaagcac32<210>54<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>54gggcccggatccctgcttctttttccttatgt32當(dāng)前第1頁12