本發(fā)明屬于環(huán)境石油污染生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于修復(fù)石油污染水的農(nóng)業(yè)復(fù)合微生物菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，人類對(duì)能源的需求不斷擴(kuò)大，對(duì)石油的開(kāi)采力度逐漸加大，這給人們的生產(chǎn)和生活帶來(lái)了極大的便利，如：汽車代步、瀝青公路取代泥磚路等。這使得愈來(lái)愈多的油田出現(xiàn)在世界各地，但隨著石油行業(yè)的開(kāi)采、冶煉，石油所帶來(lái)的巨大的環(huán)境污染問(wèn)題，成為現(xiàn)代環(huán)境治理的重中之重。
石油，主要成分是烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴的組合物，是一種疏水性物質(zhì)。油輪、油田工業(yè)等含油廢料、廢水排放到水體中會(huì)在表面迅速擴(kuò)散形成油膜，這些油膜會(huì)吸收太陽(yáng)能，阻止大氣與水中的氣體交換，從而影響水中植物的光合、呼吸作用，降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝及轉(zhuǎn)換速率，干擾水中生物的攝食、生長(zhǎng)繁殖等；且由于水體生態(tài)系統(tǒng)自我凈化、修復(fù)能力較慢，使得水體中生物種群的豐富度和分布發(fā)生變化，從而影響生物群落組成及生態(tài)系統(tǒng)的多樣性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年傾注到海洋的石油量高達(dá)200萬(wàn)噸～1000萬(wàn)噸，航運(yùn)石油污染物達(dá)160萬(wàn)噸～200萬(wàn)噸，這些石油污染物使水體的綜合使用價(jià)值降低，通過(guò)生物間的富集會(huì)危害到人體健康。
石油對(duì)水體的嚴(yán)重危害性，不僅造成水體生態(tài)系統(tǒng)的破壞，也影響到人類的生活健康。石油中的苯、醛、烷烴和酚等化合物具有潛在的毒性和致癌性，通過(guò)食物鏈進(jìn)入到人體中，會(huì)引起人體的免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等代謝紊亂，從而影響人類的生長(zhǎng)發(fā)育、生育能力。因此，由石油引發(fā)的水體污染，已逐漸引起人們的重視。
目前處理水體中的石油污染物主要是通過(guò)物理法、化學(xué)藥劑法、臭氧氧化技術(shù)、吸附法等。其中物理法主要是通過(guò)抽油機(jī)吸油、水柵刮油等方法阻止溢油擴(kuò)散，但由于石油在水體中的擴(kuò)散速率較快、無(wú)定型、覆蓋面積廣等特點(diǎn)，處理時(shí)難度大、效率低；化學(xué)藥劑法，通過(guò)向水體中噴灑或投入可降解的石油清除劑，在短時(shí)間內(nèi)使得石油污染物能夠乳化降解，形成能消散于水中的微小球狀物，但這種通過(guò)人為的添加化學(xué)試劑的方法具有潛在的威脅性，會(huì)造成水體的二次污染，影響生態(tài)系統(tǒng)的多樣性；臭氧氧化法，能夠把危害性較大的污染物通過(guò)與臭氧接觸氧化的方法轉(zhuǎn)化成危害性較小的污染物，但這種方法的缺點(diǎn)是治標(biāo)不治本，污染的水體沒(méi)有得到根治；吸附法，將石油污染物通過(guò)活性炭、硅膠等吸附劑吸附從而達(dá)到清除污染物的目的，但所用的吸附材料易飽和，需定期更換，沉降速率慢。
由于傳統(tǒng)的治理方法存在著一定的弊端，因此尋求高效、環(huán)境友好性、安全性的清除措施成為近年來(lái)治理石油污染的一項(xiàng)重要途徑，微生物菌劑能夠利用石油中的有毒有害物質(zhì)作為能源，通過(guò)機(jī)體代謝轉(zhuǎn)化成無(wú)毒無(wú)害的小分子，從而達(dá)到降解、控制水體污染的目的，成為今年來(lái)開(kāi)發(fā)及利用的一項(xiàng)熱點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供用于修復(fù)石油污染水的農(nóng)業(yè)復(fù)合微生物菌劑及其制備方法，復(fù)合微生物菌劑中的紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌可利用石油中的苯、甲苯、芳香烴等物質(zhì)為能源，通過(guò)分泌表面活性劑，將水體中的石油乳化、分解，將有毒有害的石油污染物降解成小分子化合物，可應(yīng)用于水體中石油污染物的清除，過(guò)程簡(jiǎn)單、高效、無(wú)污染，適用于湖泊、河流等水體環(huán)境的治理。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
一種用于修復(fù)石油污染水的農(nóng)業(yè)復(fù)合微生物菌劑，制備該微生物菌劑的原料包括以下物質(zhì)：紅平紅球菌rhodococcuserythropolis3％～4％、芽孢桿菌bacillussp.8％～10％、鞘氨醇單胞菌sphingomonas.3％～4％、沸石粉末3％～6％、鼠李糖3％～6％、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基70％～80％。
所述芽孢桿菌組成為短芽孢桿菌brevibacillusbrevis、枯草芽孢桿菌bacillussubtilis、蠟狀芽孢桿菌bacilluscereus，其占比為1-2:0.5-1:1-2。
所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基成分組成為玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麥芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、無(wú)機(jī)鹽2％～3％，余量為蒸餾水，121℃，滅菌15～30min；固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基成分組成為瓊脂1.5％～2％、玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麥芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、無(wú)機(jī)鹽2％～3％，余量為蒸餾水，121℃，滅菌15～30min。
所述無(wú)機(jī)鹽成分組成為fecl3、k2hpo4、kh2po4、cucl2、mgso4、mnso4、cacl2、(nh4)2hso4、nacl，其比例為0.01:0.01:0.01:0.01:0.02:0.02:0.02:0.05:1。
一種用于修復(fù)石油污染水的農(nóng)業(yè)復(fù)合微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟：
(1)如上述所述制備液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，并進(jìn)行高壓滅菌；
(2)分別將紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的菌種取出并水浴活化，分別吸取稀釋后的紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的菌液在固體培養(yǎng)基上分別進(jìn)行涂布或劃線，培養(yǎng)；
(3)在培養(yǎng)紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基平板上分別挑取紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的單菌落并分別接種至液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基純種培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；
(4)將對(duì)數(shù)期的紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌純發(fā)酵菌液接種至液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，將接種后的發(fā)酵液通入無(wú)菌空氣，混合培養(yǎng)；
(5)發(fā)酵液ph值達(dá)到設(shè)定值，檢測(cè)發(fā)酵液中總活菌數(shù)，當(dāng)總活菌數(shù)達(dá)到設(shè)定值時(shí)，停止發(fā)酵；
(6)向發(fā)酵液中補(bǔ)充經(jīng)過(guò)濾除菌的鼠李糖和沸石粉末，在無(wú)菌的環(huán)境中罐裝成工作液。
所述步驟(2)中，水浴活化條件為：28℃，1～2min；吸取菌液量均為50～100μl；培養(yǎng)條件為25℃～35℃，24～28h。
所述步驟(3)中，純種培養(yǎng)條件為25℃～35℃，50～80r/min。
所述步驟(4)中，紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌與液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的接種比均為3％～5％，紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的接種質(zhì)量比為1-1.5:2-3:1-1.5；無(wú)菌空氣通入條件為：25℃～35℃，30～80ml/min；混合培養(yǎng)條件為：120～180r/min，3～5d。
所述步驟(5)中，ph設(shè)定值為6.8～7.8；總活菌數(shù)設(shè)定值為2-10*109cfu/ml。
所述步驟(6)中，鼠李糖、沸石粉末的質(zhì)量占比均為3％～6％。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)異技術(shù)效果：
(1)紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌等有益微生物，能夠在水體中迅速繁殖并分泌具有無(wú)毒、無(wú)二次污染、環(huán)境友好性的糖脂類、脂肽類、脂蛋白類等一些生物表面活性劑，能夠使水中石油中的苯、甲苯、酚、蒽等污染物快速增溶、乳化，將石油中的化合物分解成簡(jiǎn)單的親水性小分子化合物，降低石油疏水性，從而有效地降解水中石油有機(jī)污染物，改善并修復(fù)水體環(huán)境。
(2)沸石，作為分子篩，其晶體結(jié)構(gòu)有不同大小的空穴和通道，具有很大的開(kāi)放性，可以將石油組成成分進(jìn)入孔道內(nèi)，可有效提高石油污染物的降解效率。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步解釋：
實(shí)施例1
制備該微生物菌劑的原料按質(zhì)量百分比為：
紅平紅球菌rhodococcuserythropolis3％、芽孢桿菌bacillussp.8％、鞘氨醇單胞菌sphingomonas.3％、沸石粉末3％、鼠李糖5％、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基80％；其中芽孢桿菌組成為短芽孢桿菌brevibacillusbrevis、枯草芽孢桿菌bacillussubtilis、蠟狀芽孢桿菌bacilluscereus，其占比為1.5:1:1.5。
營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基成分組成為玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麥芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、無(wú)機(jī)鹽3％，余量為蒸餾水；固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基成分組成為瓊脂2％、玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麥芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、無(wú)機(jī)鹽3％，余量為蒸餾水。
無(wú)機(jī)鹽成分組成為fecl3、k2hpo4、kh2po4、cucl2、mgso4、mnso4、cacl2、(nh4)2hso4、nacl，其比例為0.01:0.01:0.01:0.01:0.02:0.02:0.02:0.05:1。
制備方法為：
(1)如上述所述制備液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，并進(jìn)行高壓滅菌，121℃，30min。
(2)分別將紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的菌種從-80℃冰箱內(nèi)取出并于28℃水浴活化2min，分別吸取稀釋后的紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的菌液50μl在固體培養(yǎng)基上分別進(jìn)行涂布或劃線，于30℃培養(yǎng)24h。
(3)在培養(yǎng)紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基平板上分別挑取紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的單菌落并分別接種至液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基純種培養(yǎng)。其中紅平紅球菌的液體培養(yǎng)條件為30℃、60r/min，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；芽孢桿菌的液體培養(yǎng)條件為35℃、80r/min，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；鞘氨醇單胞菌的液體培養(yǎng)條件為30℃、50r/min，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。
(4)將對(duì)數(shù)期的紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌純發(fā)酵菌液按接種質(zhì)量比為1.5:3:1.5接種至液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其中紅平紅球菌與液體培養(yǎng)基的接種比為3％，芽孢桿菌與液體培養(yǎng)基的接種比為5％，鞘氨醇單胞菌與液體培養(yǎng)基的接種比為3.5％；將接種后的發(fā)酵液于30℃，以50ml/min的流速通入無(wú)菌空氣，180r/min，混合培養(yǎng)5d。
(5)發(fā)酵液ph值達(dá)到7.5，檢測(cè)發(fā)酵液中總活菌數(shù)，當(dāng)達(dá)到5*109cfu/ml時(shí)，停止發(fā)酵。
(6)向發(fā)酵液中補(bǔ)充經(jīng)過(guò)濾除菌的鼠李糖、沸石粉末，鼠李糖質(zhì)量占比為5％、沸石粉末質(zhì)量占比為3％，在無(wú)菌的環(huán)境中罐裝成工作液。
本實(shí)施例治理的污染水源為久置1年的石油管道清洗廢液，將發(fā)酵后的復(fù)合微生物菌劑搖勻后按1:100的比例加入到石油污染廢水中。在30℃的條件下，以50ml/min的流速通入無(wú)菌空氣并以100r/min的轉(zhuǎn)速攪拌處理48h、96h，原油的降解率可高達(dá)84.5％、90.8％。
實(shí)施例2
制備該微生物菌劑的原料按質(zhì)量百分比為：
紅平紅球菌rhodococcuserythropolis4％、芽孢桿菌bacillussp.10％、鞘氨醇單胞菌sphingomonas.4％、沸石粉末5％、鼠李糖5％、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基72％；其中芽孢桿菌組成為短芽孢桿菌brevibacillusbrevis、枯草芽孢桿菌bacillussubtilis、蠟狀芽孢桿菌bacilluscereus，其占比為1.5:1:1.5。
營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基成分組成為玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麥芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、無(wú)機(jī)鹽2.5％，余量為蒸餾水；固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基成分組成為瓊脂2％、玉米粉0.2％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.01％、麥芽糖0.2％、淀粉0.2％、豆粕2.5％、無(wú)機(jī)鹽2.5％，余量為蒸餾水。
無(wú)機(jī)鹽成分組成為fecl3、k2hpo4、kh2po4、cucl2、mgso4、mnso4、cacl2、(nh4)2hso4、nacl，其比例為0.01:0.01:0.01:0.01:0.02:0.02:0.02:0.05:1。
制備方法為：
(1)如上述所述制備液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，并進(jìn)行高壓滅菌，121℃，30min。
(2)分別將紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的菌種從-80℃冰箱內(nèi)取出并于28℃水浴活化2min，分別吸取稀釋后的紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的菌液50μl在固體培養(yǎng)基上分別進(jìn)行涂布或劃線，于30℃培養(yǎng)24h。
(3)在培養(yǎng)紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基平板上分別挑取紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌的單菌落并分別接種至液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基純種培養(yǎng)。其中紅平紅球菌的液體培養(yǎng)條件為30℃、80r/min，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；芽孢桿菌的液體培養(yǎng)條件為35℃、80r/min，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；鞘氨醇單胞菌的液體培養(yǎng)條件為28℃、60r/min，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。
(4)將對(duì)數(shù)期的紅平紅球菌、芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌純發(fā)酵菌液按接種質(zhì)量比為1.5:2:1.2接種至液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其中紅平紅球菌與液體培養(yǎng)基的接種比為3％，芽孢桿菌與液體培養(yǎng)基的接種比為3.5％，鞘氨醇單胞菌與液體培養(yǎng)基的接種比為3.5％；將接種后的發(fā)酵液于30℃，以40ml/min的流速通入無(wú)菌空氣，120r/min，混合培養(yǎng)4d。
(5)發(fā)酵液ph值達(dá)到7.2，檢測(cè)發(fā)酵液中總活菌數(shù)，當(dāng)達(dá)到4*109cfu/ml時(shí)，停止發(fā)酵。
(6)向發(fā)酵液中補(bǔ)充經(jīng)過(guò)濾除菌的鼠李糖、沸石粉末，鼠李糖質(zhì)量占比為5％、沸石粉末質(zhì)量占比為5％，在無(wú)菌的環(huán)境中罐裝成工作液。
本實(shí)施例治理的污染水源為輸油管道泄漏造成的原油水體污染，將發(fā)酵后的復(fù)合微生物菌劑搖勻后按1:100的比例加入到石油污染廢水中。在30℃的條件下，以40ml/min的流速通入無(wú)菌空氣并以100r/min的轉(zhuǎn)速攪拌處理36h，原油的降解率可高達(dá)75.6％。
最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。