本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域中的微生物發(fā)酵方法，涉及一種產(chǎn)朊假絲酵母和植物乳桿菌混合發(fā)酵的方法及制備的微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用。
背景技術(shù)：
隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化經(jīng)營模式的提高，殘存餌料的腐爛、生物代謝物和生物殘體沉積，使池塘有機污染嚴重，導致有害藻類和病菌的大量繁殖，水質(zhì)惡化。此外，人類生活污水、各種工業(yè)廢水、農(nóng)業(yè)退水等的超量排放，進一步污染了養(yǎng)殖用水水源，養(yǎng)殖環(huán)境惡化。而抗生素和化學藥品的濫用帶來了藥物在魚蝦體內(nèi)大量富集殘留和病原菌的抗藥性等問題，導致水產(chǎn)品質(zhì)量的下降，既危害了人類健康，也污染了環(huán)境。
養(yǎng)殖中后期隨著餌料投入量的增加，普遍出現(xiàn)亞硝態(tài)氮和氨氮含量偏高現(xiàn)象。亞硝態(tài)氮和氨氮中的非離子氨對養(yǎng)殖生物均有很強的毒性。亞硝態(tài)氮直接影響?zhàn)B殖生物血液的攜帶氧能力，是誘發(fā)爆發(fā)性疾病的主要環(huán)境因子，其含量的高低直接關(guān)系到水質(zhì)的好壞和養(yǎng)殖能否成功。非離子氨進入養(yǎng)殖生物體內(nèi)，對酶水解反應和膜穩(wěn)定性會產(chǎn)生明顯影響，表現(xiàn)為呼吸困難、不攝食、免疫力下降等，養(yǎng)殖生物生長受到抑制甚至中毒死亡。
采用微生物技術(shù)修復養(yǎng)殖環(huán)境，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的必然趨勢。酵母菌和乳酸菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的菌種，酵母菌主要用于飼料添加，乳酸菌除了用于飼料添加外對水體中亞硝態(tài)氮有較強的去除能力。由酵母菌和乳酸菌組成的復合微生態(tài)制劑大多是由單一菌劑分別發(fā)酵后按一定比例混合而成，此種方法工作量較大，且植物乳桿菌為兼性厭氧菌，單獨培養(yǎng)需要特殊裝置。酵母菌和乳酸菌有共生作用可以混合發(fā)酵，cn101805696b公布了一種除臭酵母菌和乳酸菌共培養(yǎng)方法，該方法步驟為：溫度在20-35℃下，先在發(fā)酵罐中通氣攪拌培養(yǎng)酵母菌2-8h，隨后補加乳酸菌菌液，培養(yǎng)18-24h后再次補加乳酸菌菌液培養(yǎng)8-14h，該方法在發(fā)酵過程中接種3次增加了染菌風險，所得的菌劑用于垃圾場、餐飲場所、廁所除臭。cn101715877a中酵母菌和乳酸菌放在塑料桶中共培養(yǎng)5-7d，時間周期較長，且發(fā)酵過程中需要放氣，所得制劑主要用于提高動物免疫力和消化吸收能力。
針對上述方法存在的不足，本發(fā)明對酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵進行了改進，所得到的微生態(tài)制劑能有效降解水體中亞硝態(tài)氮、氨氮和ph。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為養(yǎng)殖水體凈化提供一種酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵制備微生態(tài)制劑的方法，在保證有效活菌濃度的前提下簡化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容：
一種酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵制備微生態(tài)制劑的方法，其特征在于按如下的步驟進行：
（a）菌種活化：將產(chǎn)朊假絲酵母菌cgmcc2.281接種到滅菌ypd培養(yǎng)基中，25-30℃振蕩培養(yǎng)20-24h，將植物乳桿菌cgmcc1.511接種到裝有90%mrs滅菌培養(yǎng)基的玻璃瓶中，30-34℃靜置培養(yǎng)24-30h；產(chǎn)朊假絲酵母菌達2.0×108～5.0×108cfu/ml，植物乳桿菌達到5.0×108～8.0×108cfu/ml；所用的ypd培養(yǎng)基指的是：酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、蒸餾水1000ml；mrs培養(yǎng)基指的是：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母菌5.0g、葡萄糖5.0g、吐溫801.0ml、磷酸氫二鉀2.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、蒸餾水1000ml；
（b）培養(yǎng)基的制備：培養(yǎng)基由下列組分按質(zhì)量百分比組成，糖蜜1.5-2.5%，酵母膏0.5-0.8%，乙酸鈉0.3-0.5%，檸檬酸氫二銨0.1-0.2%，西紅柿汁5-10%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸錳0.01-0.02%，ph6.0，115℃滅菌20min；
（c）深層混合發(fā)酵：用（b）中制備的培養(yǎng)基，同時接入產(chǎn)朊假絲酵母菌和植物乳桿菌種，接種量按發(fā)酵液的體積百分比1%-3%接入，菌種體積比為1:1，培養(yǎng)溫度25-31℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)100-150rpm，發(fā)酵時間17-23h；
（d）復合微生態(tài)制劑的制備：將（c）中的發(fā)酵液與凹凸棒土按質(zhì)量比1:2混合，晾干得到復合微生態(tài)制劑，晾干后復合微生態(tài)制劑的含水率為8-12%；
（e）包裝保存：采用帶有塑料內(nèi)襯的編織袋密封包裝，常溫保存。
本發(fā)明優(yōu)選發(fā)酵溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)100rpm，發(fā)酵20h。優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(w/w)：糖蜜2.5%，酵母膏0.8%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸氫二銨0.2%，西紅柿汁5%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸錳0.02%，ph6.0。
本發(fā)明中酵母菌為產(chǎn)朊假絲酵母是好氧型真菌，乳酸菌為植物乳桿菌是兼性厭氧細菌，利用菌株生長繁殖的特點，將產(chǎn)朊假絲酵母菌和植物乳桿菌同時接種到200l發(fā)酵罐中，產(chǎn)朊假絲酵母菌生長繁殖消耗罐中余氧，為植物乳桿菌生長形成一個厭氧環(huán)境，使植物乳桿菌快速繁殖，在ph降到4.0以下停止發(fā)酵。
本發(fā)明更進一步公開了采用該方法制備的酵母菌和乳酸菌混合微生態(tài)制劑在有效降低水體中ph值方面的應用。特別是在有效去除養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)、氨氮方面的應用。實驗結(jié)果證明：復合微生態(tài)制劑能高效去除水體中亞硝態(tài)氮、氨氮，去除率分別達90%、84%，對ph有明顯的降低作用，這樣使得養(yǎng)殖池水質(zhì)清爽、魚蝦攝食活躍。提高了養(yǎng)殖池內(nèi)魚蝦的存活率。
本發(fā)明重點考察了酵母菌和乳酸菌混合同步發(fā)酵內(nèi)容，主要解決了降低成本、縮短發(fā)酵周期、降低染菌風險等問題。
本發(fā)明公開的酵母菌和乳酸菌混合同步發(fā)酵制備微生態(tài)制劑的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于：
（1）本發(fā)明以廉價的工業(yè)生產(chǎn)下腳料為主要原料，優(yōu)化混合菌的液體培養(yǎng)基，提供適合產(chǎn)朊假絲酵母菌和植物乳桿菌快速生長的培養(yǎng)基及混合發(fā)酵方法，生產(chǎn)工藝簡單、發(fā)酵時間短、成本低，發(fā)酵后有效活菌濃度高，產(chǎn)朊假絲酵母菌達2.0×107cfu/ml，植物乳桿菌達到5.13×109cfu/ml，水質(zhì)凈化效果優(yōu)良對養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)、氨氮的去除率分別為90%和84%，能有效降低水體中ph值。
（2）本發(fā)明的方法在發(fā)酵過程中解決了染菌風險，縮短了發(fā)酵周期。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由權(quán)利要求來限定。其中產(chǎn)朊假絲酵母菌（中國普通微生物菌種保藏管理中心：cgmcc2.281），植物乳桿菌（中國普通微生物菌種保藏管理中心：cgmcc1.11），菌種處于公開狀態(tài)，科學工作者可以向保藏機構(gòu)索取。
實施例1
酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵制備復合微生態(tài)制劑
（a）菌種活化：將產(chǎn)朊假絲酵母菌cgmcc2.281接種到滅菌ypd培養(yǎng)基中，25℃振蕩培養(yǎng)24h，將植物乳桿菌cgmcc1.11接種到裝有90%mrs滅菌培養(yǎng)基的玻璃瓶中，30℃靜置培養(yǎng)30h。所用的ypd培養(yǎng)基指的是：酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、蒸餾水1000ml；mrs培養(yǎng)基指的是：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母菌5.0g、葡萄糖5.0g、吐溫801.0ml、磷酸氫二鉀2.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、蒸餾水1000ml。
（b）發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜1.5%，酵母膏0.5%，乙酸鈉0.3%，檸檬酸氫二銨0.1%，西紅柿汁5%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸錳0.01%，初始ph6.0，115℃滅菌20min。
（c）深層發(fā)酵：按發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比3%同時接入產(chǎn)朊假絲酵母菌和植物乳桿菌菌種，菌種體積比為1:1，培養(yǎng)溫度25℃，發(fā)酵23h，發(fā)酵后產(chǎn)朊假絲酵母菌的有效活菌濃度為1.05×107cfu/ml，植物乳桿菌的有效活菌濃度為3.8×109cfu/ml，發(fā)酵液ph3.58。
（d）復合微生態(tài)制劑制備：以凹凸棒土為載體，將菌液與凹凸棒土按質(zhì)量比1:2混合，晾至含水率低于12%，得到復合微生態(tài)制劑。采用帶有塑料內(nèi)襯的編織袋密封包裝，常溫保存。
實施例2
酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵制備復合微生態(tài)制劑
（a）菌種活化：將產(chǎn)朊假絲酵母菌cgmcc2.281接種到滅菌ypd培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)20h，將植物乳桿菌cgmcc1.11接種到裝有90%mrs滅菌培養(yǎng)基的玻璃輸液瓶中，34℃靜置培養(yǎng)24h。所用的ypd培養(yǎng)基指的是：酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、蒸餾水1000ml；mrs培養(yǎng)基指的是：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母菌5.0g、葡萄糖5.0g、吐溫801.0ml、磷酸氫二鉀2.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、蒸餾水1000ml。
（b）發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜2.0%，酵母膏0.6%，乙酸鈉0.4%，檸檬酸氫二銨0.1%，西紅柿汁5%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸錳0.02%，初始ph6.0，115℃滅菌20min。
（c）深層發(fā)酵：按發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比2%同時接入產(chǎn)朊假絲酵母菌和植物乳桿菌菌種，菌種體積比為1:1，培養(yǎng)溫度31℃，發(fā)酵17h，發(fā)酵后產(chǎn)朊假絲酵母菌的有效活菌濃度為6.5×106cfu/ml，植物乳桿菌的有效活菌濃度為4.3×109cfu/ml，發(fā)酵液ph3.76。
（d）復合微生態(tài)制劑制備：以凹凸棒土為載體，將菌液與凹凸棒土按質(zhì)量比1:2混合，晾至含水率低于12%，得到復合微生態(tài)制劑。采用帶有塑料內(nèi)襯的編織袋密封包裝，常溫保存。
實施例3
酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵制備復合微生態(tài)制劑
（a）菌種活化：將產(chǎn)朊假絲酵母菌cgmcc2.281接種到滅菌ypd培養(yǎng)基中，25℃振蕩培養(yǎng)24h，將植物乳桿菌cgmcc1.11接種到裝有90%mrs滅菌培養(yǎng)基的玻璃輸液瓶中，34℃靜置培養(yǎng)24h。所用的ypd培養(yǎng)基指的是：酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、蒸餾水1000ml；mrs培養(yǎng)基指的是：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母菌5.0g、葡萄糖5.0g、吐溫801.0ml、磷酸氫二鉀2.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、蒸餾水1000ml。
（b）發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜2.5%，酵母膏0.8%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸氫二銨0.2%，西紅柿汁5%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸錳0.02%，初始ph6.0，115℃滅菌20min。
（c）深層發(fā)酵：按發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比1%同時接入產(chǎn)朊假絲酵母菌和植物乳桿菌種，菌種體積比為1:1，培養(yǎng)溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)100rpm，發(fā)酵20h，發(fā)酵后產(chǎn)朊假絲酵母菌的有效活菌濃度為2.0×107cfu/ml，植物乳桿菌的有效活菌濃度為5.13×109cfu/ml，發(fā)酵液ph3.20。
（d）復合微生態(tài)制劑制備：以凹凸棒土為載體，將菌液與凹凸棒土按質(zhì)量比1:2混合，晾至含水率低于12%，得到復合微生態(tài)制劑。采用帶有塑料內(nèi)襯的編織袋密封包裝，常溫保存。
實施例4：酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵復合微生態(tài)制劑的應用
表1天津西青區(qū)二基地示范池水質(zhì)測定結(jié)果
復合微生態(tài)制劑用于對蝦精養(yǎng)池，養(yǎng)殖池面積50畝，使用量為500g/畝·次，使用周期10-15d，全池潑灑。6月13日測定值為使用前初始值，6月14日開始使用，持續(xù)試驗2個月到8月14日。從表1可知，復合微生態(tài)制劑能高效去除水體中亞硝態(tài)氮、氨氮，去除率分別達90%、84%，對ph有明顯的降低作用，養(yǎng)殖池水質(zhì)清爽、魚蝦攝食活躍。