本發(fā)明涉及微生物的混合培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌混合培養(yǎng)方法及所得混合菌液中活菌數(shù)檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

豬傳染性萎縮性鼻炎(swineinfectiousatrophicrhinitis)是由支氣管敗血波氏桿菌或/和產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌引起豬的一種慢性呼吸道傳染病。其特徵為鼻炎，顏面部變形，鼻甲骨尤其是鼻甲骨下卷曲發(fā)生萎縮和生長(zhǎng)遲緩。臨診癥狀表現(xiàn)為打噴嚏、流鼻血、顏面變形、鼻部歪斜和生長(zhǎng)遲滯，豬的飼料轉(zhuǎn)化率降低，給集約化養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，由于病原感染豬只后，損害呼吸道的正常結(jié)構(gòu)和功能，使豬體抵抗力降低，極易感染其他病原，引起呼吸系統(tǒng)綜合征，增加豬的死淘率。本病常發(fā)生于2～5月齡的豬，現(xiàn)在幾乎遍及世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的地區(qū)，中國許多地區(qū)亦有本病發(fā)生。

豬萎縮性鼻炎依據(jù)病原不同可以區(qū)分為進(jìn)行性和非進(jìn)行性，其中進(jìn)行性豬萎縮性鼻炎是由血清a型和血清d型多殺性巴氏桿菌引起的。在疫苗生產(chǎn)中添加血清a型和血清d型多殺性巴氏桿菌可以有效的預(yù)防進(jìn)行性豬萎縮性鼻炎，但單獨(dú)培育血清a型和血清d型多殺性巴氏桿菌較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，培養(yǎng)成本較高。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌混合培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法可減少培養(yǎng)時(shí)間，降低培養(yǎng)成本，提高生產(chǎn)效率。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種所述的混合培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的混合菌液中菌含量檢測(cè)方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明涉及一種血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌混合培養(yǎng)方法，將血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌以活菌數(shù)為(1.4～1.6):1的接種比例接種于培養(yǎng)基中并進(jìn)行混合培養(yǎng)。

血清a型和血清d型多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)特性較為相近，因此可以混合培養(yǎng)。以上述比例進(jìn)行接種，兩種類型的型多殺性巴氏桿菌均能獲得較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

本發(fā)明還涉及如上所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的多殺性巴氏桿菌混合菌液中血清a型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)的檢測(cè)方法，包括：

1)、將血清a型多殺性巴氏桿菌的血清型基因并用載體連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，得到陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；

2)、以經(jīng)過梯度稀釋的所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度和以該濃度的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板、以a-probe-f和a-probe-r為上、下游引物、以a-taqman為探針?biāo)M(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；

3)、以多殺性巴氏桿菌混合菌液的dna為模板，按照與步驟2)相同的擴(kuò)增條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，得到的ct值與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)血清a型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)的定量檢測(cè)；

其中，所述a-probe-f、a-probe-r和a-taqman的核苷酸序列分別如seqidno：1、seqidno：2和seqidno：3所示。

本發(fā)明還涉及如上所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的多殺性巴氏桿菌混合菌液中血清d型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)的檢測(cè)方法，包括：

a)、將血清d型多殺性巴氏桿菌的血清型基因并用載體連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，得到陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；

b)、以經(jīng)過梯度稀釋的所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度和以該濃度的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板、以d-probe-f和d-probe-r為上、下游引物、以d-taqman為探針?biāo)M(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；

c)、以多殺性巴氏桿菌混合菌液的dna為模板，按照與步驟b)相同的擴(kuò)增條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，得到的ct值與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)血清d型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)的定量檢測(cè)；

其中，所述d-probe-f、d-probe-r和d-taqman的核苷酸序列分別如seqidno：4、seqidno：5和seqidno：6所示。

上述方法可直接以血清a型和血清d型多殺性巴氏桿菌混合的dna作為模板進(jìn)行檢測(cè)，由于所用引物和探針的特異性很好，不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，可以特異性的檢測(cè)血清a型或血清d型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)、血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌常常需要共同使用，將二者混合培養(yǎng)可減少培養(yǎng)時(shí)間，降低培養(yǎng)成本，提高生產(chǎn)效率。

2)、本發(fā)明提供的血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌的檢測(cè)方法中使用的引物和探針特異性高，雖然兩種多殺性巴氏桿菌同源性較高，但仍然不會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為血清a型多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增曲線；

圖2為血清a型多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3為血清d型多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增曲線；

圖4為血清d型多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5為混合培養(yǎng)所得菌液用a型多殺性巴氏桿菌引物和探針進(jìn)行熒光定量pcr的擴(kuò)增曲線；

圖6為混合培養(yǎng)所得菌液用a型多殺性巴氏桿菌引物和探針進(jìn)行熒光定量pcr的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖7為混合培養(yǎng)所得菌液用d型多殺性巴氏桿菌引物和探針進(jìn)行熒光定量pcr的擴(kuò)增曲線；

圖8為混合培養(yǎng)所得菌液用d型多殺性巴氏桿菌引物和探針進(jìn)行熒光定量pcr的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及一種血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌混合培養(yǎng)方法，將血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌以活菌數(shù)為(1.4～1.6):1的接種比例接種于培養(yǎng)基中并進(jìn)行混合培養(yǎng)。

優(yōu)選的，如上所述的血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌混合培養(yǎng)方法，將血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌以活菌數(shù)為1.5:1的接種比例接種于培養(yǎng)基中并進(jìn)行混合培養(yǎng)。

優(yōu)選的，如上所述的培養(yǎng)方法，每毫升或每克所述培養(yǎng)基中血清d型多殺性巴氏桿菌的接種量為≥1×10¹⁰cfu；更優(yōu)選為1×10^10-11cfu，也可以選擇，5×10¹⁰cfu或8×10¹⁰cfu等。

優(yōu)選的，如上所述的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)基為腦心浸液肉湯培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，如上所述的培養(yǎng)方法，所述混合培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：

培養(yǎng)溫度36℃～38℃，以150～250r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為15～16小時(shí)。

本發(fā)明還涉及一種如上所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的多殺性巴氏桿菌混合菌液中血清a型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)的檢測(cè)方法，包括：

1)、將血清a型多殺性巴氏桿菌的血清型基因并用載體連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，得到陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；

2)、以經(jīng)過梯度稀釋的所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度和以該濃度的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板、以a-probe-f和a-probe-r為上、下游引物、以a-taqman為探針?biāo)M(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；

3)、以多殺性巴氏桿菌混合菌液的dna為模板，按照與步驟2)相同的擴(kuò)增條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，得到的ct值與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)血清a型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)的定量檢測(cè)；

其中，所述a-probe-f、a-probe-r和a-taqman的核苷酸序列分別如seqidno：1、seqidno：2和seqidno：3所示。

優(yōu)選的，如上所述的檢測(cè)方法，在步驟2)所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)參數(shù)中，退火溫度為58℃～59℃；更優(yōu)選為58.5℃。

優(yōu)選的，如上所述的檢測(cè)方法，在步驟2)所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系中，上游引物和所述下游引物的濃度均為0.01～0.015mm；探針的濃度為0.01～0.015mm；模板濃度為40～80ng/μl；

更優(yōu)選的，上游引物和所述下游引物的濃度均為0.012～0.013mm；探針的濃度為0.012～0.013mm；模板濃度為50～70ng/μl。

本發(fā)明還涉及一種如上所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的多殺性巴氏桿菌混合菌液中血清d型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)的檢測(cè)方法，包括：

a)、將血清d型多殺性巴氏桿菌的血清型基因并用載體連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，得到陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；

b)、以經(jīng)過梯度稀釋的所述陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)濃度和以該濃度的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板、以d-probe-f和d-probe-r為上、下游引物、以d-taqman為探針?biāo)M(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；

c)、以多殺性巴氏桿菌混合菌液的dna為模板，按照與步驟b)相同的擴(kuò)增條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，得到的ct值與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)血清d型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)的定量檢測(cè)；

其中，所述d-probe-f、d-probe-r和d-taqman的核苷酸序列分別如seqidno：4、seqidno：5和seqidno：6所示。

本發(fā)明提供的血清a型或d型多殺性巴氏桿菌的檢測(cè)方法，其采用血清a型或d型多殺性巴氏桿菌的血清型基因通過載體連接以及轉(zhuǎn)化之后，獲得大量復(fù)制的片段，挑取陽性克隆增菌培養(yǎng)并進(jìn)行質(zhì)粒提取和鑒定(酶切鑒定)進(jìn)而獲得陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)該陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分子量將其換算成拷貝數(shù)濃度，并梯度稀釋；然后以該濃度的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板、以各自的上下游引物、以各自的taqman探針分別進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(ct值-拷貝數(shù)濃度)。

以多殺性巴氏桿菌混合菌液的dna為模板，通過供試材料反應(yīng)的ct值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接獲得血清a型或d型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)。

該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)多殺性巴氏桿菌混合菌液中的a型或d型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)的定量測(cè)定，而且檢測(cè)結(jié)果可直接通過電腦軟件讀出，不需要凝膠電泳以及成像檢測(cè)等操作，進(jìn)而避免了檢測(cè)結(jié)果假陽性的同時(shí)也避免了環(huán)境污染以及eb對(duì)操作人員造成的身體危害。另外，該檢測(cè)方法整個(gè)檢測(cè)過程僅需1小時(shí)左右，具有節(jié)約時(shí)間以及靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

優(yōu)選的，在步驟1)或步驟a)中，所用的載體可選擇pmd19-t載體；

優(yōu)選的，在步驟1)或步驟a)中，所用的宿主細(xì)胞可選擇dh5α細(xì)胞。

優(yōu)選的，如上所述的檢測(cè)方法，在步驟b)所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)參數(shù)中，退火溫度為58℃～59℃；更優(yōu)選為58.5℃。

優(yōu)選的，如上所述的檢測(cè)方法，在步驟b)所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系中，上游引物和所述下游引物的濃度均為0.01～0.015mm；探針的濃度為0.01～0.015mm；模板濃度為40～80ng/μl；

更優(yōu)選的，上游引物和所述下游引物的濃度均為0.012～0.013mm；探針的濃度為0.012～0.013mm；模板濃度為50～70ng/μl。

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

根據(jù)多殺性巴氏桿菌血清a型和血清d型多殺性巴氏桿菌的血清型基因設(shè)計(jì)引物和探針，序列為：

a-probe-f：gggcatcacaaggtatgtttatga

a-probe-r：tgactggcaggatgtgatgac

a-taqman：catgagcttctgacgatta

d-probe-f：ccgattaaactcaaatctagggacat

d-probe-r：tcgattctttcatggtgacataca

d-taqman：tattttctttcaggatagcgatg

pcr反應(yīng)體系為：premix12.5μl，上游引物：0.5μl，下游引物：0.5μl，模板2μl，taqman探針0.25ul，蒸餾水補(bǔ)齊25μl。

pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s；58.5℃退火30s；共40個(gè)循環(huán)。

克隆血清a型和血清d型多殺性巴氏桿菌的血清型基因分別連接至pmd19-t載體上，轉(zhuǎn)化入dh5α細(xì)胞，提取質(zhì)粒，測(cè)量核酸濃度，計(jì)算其中基因拷貝數(shù)，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，依據(jù)上述反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，血清a型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果分別如圖1和圖2所示；血清d型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果分別如圖3和圖4所示。

通過熒光定量pcr計(jì)算出了疫苗制備所要求a型和d型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)所對(duì)應(yīng)的基因拷貝數(shù)。建立血清a型和血清d型多殺性巴氏桿菌單獨(dú)培養(yǎng)所得菌液的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果與拷貝數(shù)之間的相關(guān)性為正相關(guān)；

血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌混合培養(yǎng)接種比例為1.5:1，36～38℃，以200r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為15～16小時(shí)。

本發(fā)明與現(xiàn)有的單獨(dú)培養(yǎng)技術(shù)相比，具有減少培養(yǎng)時(shí)間，降低培養(yǎng)成本，提高生產(chǎn)效率的特點(diǎn)。

實(shí)施例2

按照1.5:1接種血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌，37℃，以200r/min培養(yǎng)11小時(shí)，提取混合培養(yǎng)菌液核酸，通過熒光定量pcr檢測(cè)混合培養(yǎng)菌液中血清a型和血清d型多殺性巴氏桿菌抗原的濃度。結(jié)果證實(shí)混合培養(yǎng)菌液中a型和血清d型多殺性巴氏桿菌的拷貝數(shù)高于疫苗制備所要求a型和d型多殺性巴氏桿菌活菌數(shù)所對(duì)應(yīng)的基因拷貝數(shù)。

圖5和圖6分別為混合培養(yǎng)所得菌液用a型多殺性巴氏桿菌引物和探針進(jìn)行熒光定量pcr的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中1為疫苗制備要求a型多殺性巴氏桿菌菌液，2為混合培養(yǎng)菌液；通過計(jì)算菌液1的ct＝18.93，初始拷貝濃度＝2.184e+08，菌液2的ct＝18.64，初始拷貝濃度＝2.668e+08。

圖7和圖8分別為混合培養(yǎng)所得菌液用d型多殺性巴氏桿菌引物和探針進(jìn)行熒光定量pcr的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中1為疫苗制備要求d型多殺性巴氏桿菌菌液，2為混合培養(yǎng)菌液；通過計(jì)算菌液1的ct＝19.22，初始拷貝濃度＝5.895e+06，菌液2的ct＝17.98，初始拷貝濃度＝1.382e+07。

最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。

sequencelisting

<110>吉林冠界生物技術(shù)有限公司

<120>血清a型、血清d型多殺性巴氏桿菌混合培養(yǎng)方法及所得混合菌液中活菌數(shù)檢

測(cè)方法

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