本發(fā)明涉及微生物及其生物降解應(yīng)用領(lǐng)域，具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一株三氯卡班降解菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

氯代芳香烴三氯卡班(化學(xué)名稱n-(4-氯苯基)-n-(3,4-二氯苯基)脲)，為一種被廣泛添加到人們?nèi)粘Ｉ钣闷分械目咕鷦?，?duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌和真菌都有較好的抑菌作用。由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定及強(qiáng)疏水性，隨生活污水排放的三氯卡班經(jīng)傳統(tǒng)的污水處理過(guò)程不能被徹底去除，而主要吸附于剩余污泥并隨之排放到環(huán)境中。剩余污泥的農(nóng)田回用或填埋，導(dǎo)致三氯卡班進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至土壤、沉積物當(dāng)中，在各地的水體、沉積物環(huán)境中被頻繁檢出，給人類健康和環(huán)境帶來(lái)了多方面的危害。三氯卡班不僅會(huì)影響水生生物的活性，且影響動(dòng)物的生殖能力和內(nèi)分泌系統(tǒng)，三氯卡班及其多種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為潛在的誘癌物，同時(shí)作為抗菌劑，三氯卡班也具有潛在的誘發(fā)微生物抗性基因產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)三氯卡班在我國(guó)乃至全球開(kāi)始得到廣泛的關(guān)注。基于三氯卡班的污染范圍廣且相對(duì)濃度低的特點(diǎn)，其他治理方法難度大，成本高，因此，利用微生物降解去除三氯卡班是一種經(jīng)濟(jì)有效的途徑，對(duì)減少其引起的環(huán)境污染與降低其導(dǎo)致的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。目前，有關(guān)三氯卡班的降解菌篩選和降解路徑報(bào)道較少，僅sphingomonassp.yl-jm2c和ochrobactrumsp.mc22兩株菌被報(bào)道具有三氯卡班的降解能力，但其降解效率相對(duì)較低且能耐受的三氯卡班濃度較低。而有關(guān)三氯卡班的降解基因還未見(jiàn)報(bào)道。因此，篩選高效的三氯卡班降解菌，明確其降解路徑與降解關(guān)鍵功能基因，將為三氯卡班污染環(huán)境的生物修復(fù)等研究提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于為三氯卡班降解菌種資源提供新成員，彌補(bǔ)降解路徑與功能基因的空缺，而提供一株三氯卡班降解菌，所述的三氯卡班降解菌可以降解4,4’-二氯苯基脲和雙苯基脲、敵稗、利谷隆、苯胺靈、氯苯胺靈、除蟲(chóng)脲、4-氯苯基脲、4-溴苯基脲、1-(3,4-二溴苯基)脲、乙酰苯胺、對(duì)乙酰氨基酚和氯吡脲等。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一株三氯卡班降解菌，其為蒼白桿菌(ochrobactrumsp.)，其保藏編號(hào)為cgmccno.14087。

本發(fā)明所提供的三氯卡班降解菌命名為tcc-1，其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2017年5月2日，保藏編號(hào)為cgmccno.14087。

本發(fā)明所提供的三氯卡班降解菌tcc-1的主要生物學(xué)特征為：革蘭氏陰性，菌體呈短桿狀，周生鞭毛，菌落呈乳白色、邊緣整齊且光滑。

本發(fā)明所提供的三氯卡班降解菌tcc-1的16srrna基因序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明所提供的三氯卡班降解菌tcc-1，其基因組中含有酰胺酶編碼基因tcca，該基因通過(guò)鳥(niǎo)槍法基因文庫(kù)策略克隆得到，該基因的大小為1425bp，其基因序列如seqidno.4所示。

本發(fā)明還提供所述三氯卡班降解菌在微生物降解領(lǐng)域的應(yīng)用。

其中，所述應(yīng)用包括降解三氯卡班(tcc)、三氯卡班的脫氯同系物或含有酰胺鍵的化合物底物。

優(yōu)選地，所述三氯卡班的脫氯同系物包括4,4’-二氯苯基脲和雙苯基脲。

優(yōu)選地，所述含有酰胺鍵的化合物底物包括敵稗、利谷隆、苯胺靈、氯苯胺靈、除蟲(chóng)脲、4-氯苯基脲、4-溴苯基脲、1-(3,4-二溴苯基)脲、乙酰苯胺、對(duì)乙酰氨基酚和氯吡脲。

優(yōu)選地，所述降解是在好氧條件下或在厭氧條件下進(jìn)行，其中，在厭氧條件下進(jìn)行時(shí)，所述三氯卡班降解菌利用硝酸鹽作為末端電子受體，在提供可利用電子供體和能源時(shí)生長(zhǎng)且伴隨三氯卡班、三氯卡班的脫氯同系物或含有酰胺鍵的化合物底物的降解。

優(yōu)選地，所述降解是在溫度為20-40℃，ph為5.2-9.0的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行。

在本發(fā)明的一較佳實(shí)例中，本發(fā)明所提供的三氯卡班降解菌tcc-1，在溫度為30℃，初始ph為6.6-7.0的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，好氧情況下72h內(nèi)完全水解10mg/l的三氯卡班，斷裂三氯卡班的雙酰胺鍵形成易生物降解的4-氯苯胺和3,4-二氯苯胺產(chǎn)物，具有很高的降解效率，具有良好的生物修復(fù)應(yīng)用潛力。

在本發(fā)明的另一較佳實(shí)例中，本發(fā)明所提供的三氯卡班降解菌tcc-1，在溫度為30℃，初始ph為6.6-7.0的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，厭氧情況下以1.5mm硝酸鹽為電子受體，15mm乙酸鈉為電子供體、能源和碳源，80h內(nèi)可水解5mg/l的三氯卡班，48h內(nèi)可水解5mg/l的雙苯基脲，96h內(nèi)可水解5mg/l的4,4’-二氯苯基脲。

在本發(fā)明的又一較佳實(shí)例中，本發(fā)明所提供的三氯卡班降解菌tcc-1，在溫度為30℃，初始ph為6.6-7.0的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，可以水解敵稗，利谷隆，苯胺靈，氯苯胺靈，除蟲(chóng)脲，4-氯苯基脲，4-溴苯基脲，1-(3,4-二溴苯基)脲，乙酰苯胺，對(duì)乙酰氨基酚和氯吡脲等的酰胺鍵，分別得到3,4-二氯苯胺，3,4-二氯苯胺，苯胺，3-氯苯胺，4-氯苯胺與2,6-二氟苯甲酸，4-氯苯胺，4-溴苯胺，3,4-二氯苯胺，苯胺，對(duì)氨基苯酚，苯胺與4-氨基-2氯吡啶。

本發(fā)明所提供的三氯卡班降解菌tcc-1，如上所述的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基配方為：nacl1g，nh4cl1g，k2hpo41.5g，kh2po40.5g，mgso4·7h2o0.2g，補(bǔ)足蒸餾水至1000ml。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明的菌株(ochrobactrumsp.tcc-1)可以有效降解的溫度范圍為20-40℃，有效的ph范圍為5.2-9.0，好氧與厭氧條件下均有降解能力，可以很好的適應(yīng)自然條件下的工程應(yīng)用，且可降解的含酰胺鍵底物種類多。

2、本發(fā)明的菌株(ochrobactrumsp.tcc-1)可以有效轉(zhuǎn)化三氯卡班等多種難降解污染物為易于降解的(氯)苯胺類，對(duì)以上污染物的去除降解意義重大。

附圖說(shuō)明

圖1顯示蒼白桿菌(ochrobactrumsp.)tcc-1菌株的透射電鏡照片；

圖2顯示基于16srrna基因構(gòu)建的蒼白桿菌(ochrobactrumsp.)tcc-1菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；

圖3顯示蒼白桿菌(ochrobactrumsp.)tcc-1菌株在好氧條件下對(duì)三氯卡班的降解結(jié)果；

圖4顯示蒼白桿菌(ochrobactrumsp.)tcc-1菌株在厭氧條件下對(duì)三氯卡班(tcc)的降解結(jié)果；

圖5顯示蒼白桿菌(ochrobactrumsp.)tcc-1菌株在厭氧條件下對(duì)4,4’-二氯苯基脲(dcc)及雙苯基脲(ncc)的降解結(jié)果；

圖6顯示蒼白桿菌(ochrobactrumsp.)tcc-1菌株對(duì)三氯卡班的降解產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定圖；

圖7顯示蒼白桿菌(ochrobactrumsp.)tcc-1菌株的tcca基因擴(kuò)增電泳圖。

生物材料保藏信息

本發(fā)明提供的蒼白桿菌ochrobactrumsp.tcc-1菌株，已于2017年5月2日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101。該菌株的保藏編號(hào)為：cgmccno.14087。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

下述實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為市售分析純及以上，三氯卡班、4-氯苯胺和3,4-二氯苯胺等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自西格瑪(sigma-aldrich，美國(guó))、阿拉丁試劑公司(上海)和百靈威科技(上海)等。三氯卡班及其他底物采用丙酮配制為高濃度母液備用。

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的配方為：nacl1g，nh4cl1g，k2hpo41.5g，kh2po40.5g，mgso4·7h2o0.2g，補(bǔ)足蒸餾水至1000ml，采用高溫高壓滅菌處理后備用。

實(shí)施例1三氯卡班降解菌tcc-1的分離、鑒定及其對(duì)三氯卡班的好氧降解

1.1菌株分離純化

菌源采自北京某污水處理廠的剩余污泥，20mg/l的tcc以母液加入到150ml的錐形瓶中，首先揮發(fā)去除丙酮，然后再加入50ml的滅菌基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(內(nèi)含0.05％酵母浸出物)，分別接入大約5g的泥水混合樣，置于30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150rpm。培養(yǎng)7-8天后，以類似的方法準(zhǔn)備培養(yǎng)基，分別轉(zhuǎn)接10％體積的富集液到新鮮的培養(yǎng)基中。連續(xù)轉(zhuǎn)接5次后，測(cè)定富集液的降解效果。以含三氯卡班20mg/l的lb平板，采用稀釋平板法、劃線分離法分離和純化菌株。從中挑選形態(tài)不同的菌落，于基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中確定其降解三氯卡班的能力。

1.2菌株鑒定

于富集液中分離出一株三氯卡班降解菌，將分離純化的菌株進(jìn)行簡(jiǎn)單生理生化分析和16srrna基因測(cè)序鑒定，該菌株透射電鏡觀察如圖1所示，該菌株主要生物學(xué)特征為：革蘭氏染色反應(yīng)陰性，菌體呈短桿狀，周生鞭毛，菌落呈乳白色、邊緣整齊且光滑。其序列高度相似于ochrobactrum菌屬，其16srrna基因序列如序列表中seqidno.1所示，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)如圖2所示。結(jié)合其生理生化特征，該菌被鑒定為ochrobactrumsp.，命名為ochrobactrumsp.tcc-1。該菌交送中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)進(jìn)行保藏，保藏日期為2017年5月2日，保藏編號(hào)為cgmccno.14087。

1.3三氯卡班降解菌對(duì)三氯卡班的好氧降解

菌懸液制備：將純化的菌株于lb培養(yǎng)基(蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl10.0g，蒸餾水1000ml)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，通過(guò)離心收集菌體，棄培養(yǎng)基后采用無(wú)菌基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基重懸洗滌3次，每次以離心收集菌體，最后采用無(wú)菌基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基重懸，初始接種量以od600值計(jì)。

降解菌對(duì)三氯卡班的降解：于50ml的錐形瓶中以母液的形式加入底物tcc10mg/l，待有機(jī)溶劑揮發(fā)，再裝入20ml的無(wú)菌mm培養(yǎng)基，接種一定菌懸液，30℃恒溫震蕩培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，以不加菌和不加底物的培養(yǎng)基為對(duì)照。三氯卡班的降解如圖3所示，測(cè)定結(jié)果表明，三氯卡班降解菌tcc-1于72h內(nèi)基本降解全部三氯卡班，主要積累兩個(gè)產(chǎn)物，利用uplc-ms進(jìn)行鑒定。液相條件為：乙腈和水以0.2ml/min梯度洗脫，0-10min：乙腈由初始的10％增加到90％，維持2min，后于0.5min內(nèi)恢復(fù)初始比例；質(zhì)譜條件為毛細(xì)管電壓3kv，去溶劑氣溫度350℃，氣流量900l/h，噴霧氣和碰撞氣均為氮?dú)?，其他等同于常?guī)設(shè)定，確認(rèn)產(chǎn)物為4-氯苯胺和3,4-二氯苯胺，鑒定結(jié)果如圖4所示。

1.4培養(yǎng)溫度和ph對(duì)三氯卡班降解菌的影響

培養(yǎng)溫度的影響：考察不同的培養(yǎng)溫度(20，25，30，40℃)對(duì)三氯卡班降解菌tcc-1降解三氯卡班的影響，基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中三氯卡班初始濃度為20mg/l，72h后測(cè)定培養(yǎng)液中三氯卡班的殘留以及產(chǎn)物4-氯苯胺和3,4-二氯苯胺的形成濃度，不同溫度下tcc的去除率(72h)都可達(dá)90％，30℃下底物tcc的去除率，4-氯苯胺和3,4-二氯苯胺產(chǎn)物的形成率相對(duì)較高，與其他溫度下無(wú)明顯差異。

初始ph的影響：考察不同的初始ph值(5.2，6.7，8.0，9.0)對(duì)三氯卡班降解菌tcc-1降解三氯卡班的影響，基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中三氯卡班初始濃度為20mg/l，72h后測(cè)定培養(yǎng)液中三氯卡班的殘留以及產(chǎn)物4-氯苯胺和3,4-二氯苯胺的形成濃度，ph值在6.7條件下底物tcc的去除率，4-氯苯胺和3,4-二氯苯胺產(chǎn)物的形成率相對(duì)較高，與其他ph值下無(wú)明顯差異。

不同溫度和ph條件下的降解顯示，三氯卡班降解菌tcc-1可以在溫度范圍20-40℃，ph值范圍5.2-9.0條件下有效降解三氯卡班。

實(shí)施例2三氯卡班降解菌tcc-1厭氧降解三氯卡班、4,4’-二氯苯基脲及雙苯基脲

厭氧培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中補(bǔ)充1.5mm的硝酸鉀以及15mm的乙酸鈉，充分溶解后，通入高純氮?dú)庖猿酰捎脜捬跞芊馀囵B(yǎng)瓶，高溫高壓滅菌。

以上準(zhǔn)備的厭氧培養(yǎng)基中，以母液的形式分別加入5mg/l的三氯卡班、4,4’-二氯苯基脲及雙苯基脲，將實(shí)施例1中篩選的菌株tcc-1接種到厭氧的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，初始o(jì)d600值約0.035，每組3個(gè)重復(fù)，觀察生物量的變化以及以上底物的降解。

連續(xù)監(jiān)測(cè)三氯卡班、4,4’-二氯苯基脲及雙苯基脲的轉(zhuǎn)化如圖5和6所示，結(jié)果表明，三氯卡班降解菌ochrobactrumsp.tcc-1可以在厭氧條件下以硝酸鹽作為電子受體生長(zhǎng)并且水解以上底物，形成產(chǎn)物4-氯苯胺、3,4-二氯苯胺和苯胺，硝酸鹽經(jīng)亞硝酸鹽被還原為氮?dú)?，為后續(xù)該菌在厭氧環(huán)境中發(fā)揮降解作用奠定了基礎(chǔ)。

實(shí)施例3三氯卡班降解菌tcc-1降解基因tcca的克隆

3.1細(xì)菌基因組總dna的提取

三氯卡班降解菌tcc-1大量培養(yǎng)后，采用ctab法提取高純度、大片段的基因組dna，提取方法參考f.奧斯伯等編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》。

3.2總dna的酶切

ochrobactrumsp.tcc-1的總dna采用sau3ai部分酶切。

3.3dna片段的回收

酶切后的dna片段通過(guò)電泳(tae緩沖液)進(jìn)行分離純化，采用dna回收試劑盒(天根，北京)進(jìn)行回收，回收的dna溶于te緩沖液(ph8.0)中，置于-20℃保藏。

3.4酶連

建立如下反應(yīng)體系：puc118(bamhi)(takara，code：d3321)0.5μl

回收dna片段5μl

10×t4dna連接酶緩沖液1μl

t4dna連接酶0.5μl

加雙蒸水至10μl

16℃溫育12h

3.5轉(zhuǎn)化及篩選

采用一種含酰胺鍵化合物對(duì)乙酰氨基酚作為目標(biāo)酰胺酶的初篩標(biāo)記，對(duì)乙酰氨基酚(無(wú)色)在酰胺鍵斷裂后易形成褐色的對(duì)氨基苯酚。10μl酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μl大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞(天根，code：cb101)，具體方法參考f.奧斯伯等編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》。涂布含有抗生素氨芐青霉素(100mg/l)的lb平板，37℃培養(yǎng)12h以上。待菌落長(zhǎng)到一定大小時(shí)，將其影印到含有對(duì)乙酰氨基苯酚(200mg/l)和氨芐青霉素(100mg/l)的lb平板上，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24h以上，選擇產(chǎn)生褐色的克隆子驗(yàn)證能否降解三氯卡班?？寺∽訉?duì)三氯卡班的降解實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)實(shí)施例1中1.3三氯卡班降解菌對(duì)三氯卡班的好氧降解。

3.6基因核苷酸序列的擴(kuò)增與測(cè)定

將3.5中獲得的有三氯卡班降解能力的陽(yáng)性克隆子委托寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行，序列經(jīng)ncbi在線orf分析，同源性比對(duì)后，其中一個(gè)orf預(yù)測(cè)負(fù)責(zé)三氯卡班酰胺鍵水解，對(duì)菌株基因組中該片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增，所用引物為：tcca-f(5'-cgtcctcccgcatatgactgctaccgacgagttgta-3'(seqidno.2)，tcca-r(5'-tccatcggatgctggaagggtccagga-3'(seqidno.3)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

pcr擴(kuò)增體系為25μl，各組分的體積為2×gcbuffer12.5μl，dntp(25mm)2μl，引物(25μm)各0.5μl，dna模板0.5μl，lataq酶(5u/μl)0.25μl，超純水8.75μl。

pcr的擴(kuò)增程序?yàn)椋?1)預(yù)變性，94℃5min；(2)變性，94℃45s，退火，58℃45s，延伸，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；(3)延伸，72℃10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察，結(jié)果見(jiàn)圖7。

擴(kuò)增的序列被定義為具水解三氯卡班雙酰胺鍵功能的基因，命名為tcca，其核苷酸序列為seqidno.4，根據(jù)酰胺酶基因tcca核苷酸序列所推導(dǎo)得到的474個(gè)氨基酸序列為seqidno.5，對(duì)應(yīng)翻譯得到的蛋白tcca能夠水解三氯卡班的雙酰胺鍵。

以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心

<120>一株三氯卡班降解菌及其應(yīng)用

<130>ib178265

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1444

<212>dna

<213>ochrobactrumsp.

<400>1

agagtttgatcatggctcagaacgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagc60

gccccgcaaggggagcggcagacgggtgagtaacgcgtgggaacgtaccttttgctacgg120

aataactcagggaaacttgtgctaataccgtatgtgcccttcgggggaaagatttatcgg180

caaaggatcggcccgcgttggattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgacg240

atccatagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactc300

ctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgcc360

gcgtgagtgatgaaggccctagggttgtaaagctctttcaccggtgaagataatgacggt420

aaccggagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggct480

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aaatcccggggctcaaccccggaactgcctttgatactggaagtcttgagtatggtagag600

gtgagtggaattccgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcggaggaacaccagtggc660

gaaggcggctcactggaccattactgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacagg720

attagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgttagccgttggggagtttact780

cttcggtggcgcagctaacgcattaaacattccgcctggggagtacggtcgcaagattaa840

aactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagc900

aacgcgcagaaccttaccagcccttgacataccggtcgcggacacagagatgtgtctttc960

agttcggctggaccggatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgt1020

tgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcccttagttgccagcatttagttgggca1080

ctctaaggggactgccggtgataagccgagaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcat1140

ggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaatggtggtgacagtgggcagcgagcac1200

gcgagtgtgagctaatctccaaaagccatctcagttcggattgcactctgcaactcgagt1260

gcatgaagttggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgg1320

gccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggcgctgtgcta1380

accgcaaggaggcaggcgaccacggtagggtcagcgactggggtgaagtcgtaacaaggt1440

aacc1444

<210>2

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>tcca-f引物

<400>2

cgtcctcccgcatatgactgctaccgacgagttgta36

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>tcca-r引物

<400>3

tccatcggatgctggaagggtccagga27

<210>4

<211>1425

<212>dna

<213>ochrobactrumsp.

<400>4

atgactgctaccgacgagttgtactacctgccggtgaccgagctgtctgagctcatcgcc60

gagcgacgactggctccgtccgaactgatgtcggccgtgattgcgcgagccgaggaggtg120

aatccgaagctgaacgcattggtagcccagcgcttcgaggcggctacccgcgaggcagcc180

gctgccgacaacgagccatccagaggagtgctgcacggtatacccatcacgctgaaggat240

ctggcctatgagacgccggatctgccgtcgacctatggctcgcgcgccttcgcgggctac300

gagccgggcttcgagacagtggtcggacagcggttgcgcgcggctggaacgatcgcgatc360

ggccggacgaactccccggagttcgggctcaccaacacctgcgagagcgcgcagttcggc420

ccgacctcgaatccgtggcggccggagcacacaccgggcggatccagcggtggcgccgga480

gctgcggtggccgctgggatcgcgccgctggctgccgccaacgacggcggcgggtcgtgt540

cgcgtcccggcgtccagctgcggtgtggtcggtctgaagccgagccggggccgcgtcccg600

tgggcgcccacctcgtacgagtattgggccggcttcgccaccaatggcccgatcgcgcgg660

accgttgaggacgtcgcgctgttgctcgatgcgatgtcgggccccgtcgtcggcgagccg720

tacggcttacccgcgccgagcgagtcgttcctgacggcctcgcgtcggcgtccaggcccc780

ctccgcatcgccttctcctgcactccgcccaagcctcacgaccggctgaacgccgaggtc840

aagcagacgttcctggctgcggtcgccaacttcgaggcgctcgggcacacggtcaccgag900

atcgaccatggtctggacggcatcttcgacagcttcatccgagtcatcgcggccaatacc960

gcattgtcggtgacgcagaccgtcccgttggggagcctgaacctgctggaacccaacacg1020

ctcggactggcccagcgcgggtgggggctcagcgcgatggactactgcgaggcgatcaac1080

cacctgcgtaccaccgccgcactgagcatggcccgatggaccgaggacttcgacgtcctg1140

ctcacgcccaccctcacggacctgccgccgttgacgggacagatgccgtcgtacgacggt1200

gacttggacgcctgctatctgcacatgctcggacacaatgccttcacgtatccgttcaac1260

gtcaccggccagccggcgctctccatcccgtgcggatggagcacctccggcttgcccatc1320

ggcttgcagatcatcgggggcatgggccaagaggcccgcgtgctggcgttggccgccgcc1380

tatgaggaggcacatccctgggcggcgcgcaagccgccgctgtga1425

<210>5

<211>474

<212>prt

<213>ochrobactrumsp.

<400>5

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151015

gluleuilealagluargargleualaprosergluleumetserala

202530

valilealaargalaglugluvalasnprolysleuasnalaleuval

354045

alaglnargpheglualaalathrargglualaalaalaalaaspasn

505560

gluproserargglyvalleuhisglyileproilethrleulysasp

65707580

leualatyrgluthrproaspleuproserthrtyrglyserargala

859095

phealaglytyrgluproglyphegluthrvalvalglyglnargleu

100105110

argalaalaglythrilealaileglyargthrasnserprogluphe

115120125

glyleuthrasnthrcysgluseralaglnpheglyprothrserasn

130135140

protrpargprogluhisthrproglyglyserserglyglyalagly

145150155160

alaalavalalaalaglyilealaproleualaalaalaasnaspgly

165170175

glyglysercysargvalproalasersercysglyvalvalglyleu

180185190

lysproserargglyargvalprotrpalaprothrsertyrglutyr

195200205

trpalaglyphealathrasnglyproilealaargthrvalgluasp

210215220

valalaleuleuleuaspalametserglyprovalvalglyglupro

225230235240

tyrglyleuproalaprosergluserpheleuthralaserargarg

245250255

argproglyproleuargilealaphesercysthrproprolyspro

260265270

hisaspargleuasnalagluvallysglnthrpheleualaalaval

275280285

alaasnpheglualaleuglyhisthrvalthrgluileasphisgly

290295300

leuaspglyilepheaspserpheileargvalilealaalaasnthr

305310315320

alaleuservalthrglnthrvalproleuglyserleuasnleuleu

325330335

gluproasnthrleuglyleualaglnargglytrpglyleuserala

340345350

metasptyrcysglualaileasnhisleuargthrthralaalaleu

355360365

sermetalaargtrpthrgluasppheaspvalleuleuthrprothr

370375380

leuthraspleuproproleuthrglyglnmetprosertyraspgly

385390395400

aspleuaspalacystyrleuhismetleuglyhisasnalaphethr

405410415

tyrpropheasnvalthrglyglnproalaleuserileprocysgly

420425430

trpserthrserglyleuproileglyleuglnileileglyglymet

435440445

glyglnglualaargvalleualaleualaalaalatyrglugluala

450455460

hisprotrpalaalaarglysproproleu

465470