本發(fā)明涉及香蕉病害生物防控領(lǐng)域，具體而言，涉及一種香蕉枯萎病拮抗菌以及生物有機(jī)肥及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌(fusariumoxysporumf.sp.cubense)侵染而引起香蕉維管束壞死的毀滅性土傳真菌病害，該病會(huì)導(dǎo)致香蕉植株莖葉萎蔫甚至全部枯死，一旦爆發(fā)則難以遏制，嚴(yán)重影響了香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
目前已報(bào)道的香蕉枯萎病防控方法主要包括抗病品種培育、農(nóng)藝防控、化學(xué)防治及生物防控等，前三種措施都存在污染二次環(huán)境、成本較高和防效不穩(wěn)定等問題，而生物防控具有環(huán)境友好型特點(diǎn)，是目前公認(rèn)比較安全和有效的防控措施。
生物防控的基礎(chǔ)在于篩選高效的生防菌株，已有很多研究論文和發(fā)明專利報(bào)道了防控枯萎病的生防菌和菌劑，包括放線菌、芽孢桿菌、假單胞菌、木霉、綠僵菌、耐寒短桿菌和非致病力尖孢鐮刀菌等。由于我國在香蕉枯萎病防控研究方面起步較晚，現(xiàn)有的生防菌資源庫有限，且有些菌株在實(shí)際應(yīng)用過程中常發(fā)生變異和退化現(xiàn)象，需要不斷補(bǔ)充新的高效生防菌株。
有鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一目的在于提供一種香蕉枯萎病拮抗菌，篩選到的貝萊斯芽孢桿菌對(duì)香蕉枯萎病有很強(qiáng)的平板抑制效果，提高生防菌的防控效果，豐富現(xiàn)有的枯萎病生防菌資源庫。
本發(fā)明的第二目的在于提供含有所述的香蕉枯萎病拮抗菌的菌劑，便于制備生物有機(jī)肥。
本發(fā)明的第三目的在于提供生物有機(jī)肥，是將上述拮抗菌與有機(jī)載體結(jié)合進(jìn)行二次發(fā)酵得到的堆肥產(chǎn)品，該產(chǎn)品不僅為生防菌生長提供養(yǎng)分，也能改善土壤理化和生物性質(zhì)，促進(jìn)植物生長，減少病害發(fā)生。
本發(fā)明的第四目的在于提供生物有機(jī)肥的制備方法，將生防菌菌劑與有機(jī)載體結(jié)合進(jìn)行二次發(fā)酵，獲得生物有機(jī)肥產(chǎn)品，保障了其在土壤中有效定殖。
本發(fā)明的第五目的在于提供所述的生物有機(jī)肥在香蕉枯萎病防控中的應(yīng)用，有利于保障香蕉苗期和移栽后根際土壤中的拮抗菌數(shù)量，抵御枯萎病病原菌的入侵，最終防控病害發(fā)生。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
一種香蕉枯萎病拮抗菌，于2017年01月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.13549，保藏名稱為貝萊斯芽孢桿菌bacillusvelezensish-6。
本發(fā)明從發(fā)病蕉園健康香蕉根際土中，以香蕉枯萎病病原菌4號(hào)生理小種作為指示菌，經(jīng)過平板初篩和復(fù)篩，獲得具有平板抑制效果的拮抗菌，編號(hào)h-6，通過劃線純化獲得拮抗菌單菌落，經(jīng)生理生化特性和16srrna基因鑒定，確定所述拮抗菌的分類地位，為貝萊斯芽孢桿菌，其中，16srrna基因與現(xiàn)有的類似菌種比對(duì)的最大額重合率為98％。篩選到的貝萊斯芽孢桿菌與其它多種芽孢桿菌不同，其在土傳病害生物防控上的應(yīng)用效果少見報(bào)道。研究表明，該菌對(duì)多種病原真菌有抑制作用，如對(duì)楊樹紫紋羽病原菌的抑菌圈達(dá)11.0mm。本發(fā)明篩選到的貝萊斯芽孢桿菌對(duì)香蕉枯萎病病原菌有很強(qiáng)的平板抑制效果，將其制成生物有機(jī)肥應(yīng)用于香蕉枯萎病防控，進(jìn)一步研究其提高拮抗菌的防控效果，可豐富現(xiàn)有的枯萎病拮抗菌資源庫。
本發(fā)明還提供了含有所述的香蕉枯萎病拮抗菌的微生物菌劑。
進(jìn)一步地，所述菌劑為液體菌劑。采用液體菌劑便于菌體保持活性?；顮顟B(tài)。
優(yōu)選地，所述液體菌劑中，所述香蕉枯萎病拮抗菌活菌的數(shù)量是1×109～1×1010cfu/ml。
進(jìn)一步地，所述液體菌劑通過以下方法制備：
將所述菌種接種于lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液，收集菌體，重懸，即得。
優(yōu)選地，所述培養(yǎng)的條件為：
28℃～32℃，150r/min～190r/min搖床培養(yǎng)10h～16h后轉(zhuǎn)接至新鮮lb培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)60h～80h，獲得所述培養(yǎng)液。
本發(fā)明還提供了一種生物有機(jī)肥，其中所述香蕉枯萎病拮抗菌的濃度不小于1.0×108cfu/g干樣。即每克生物有機(jī)肥干樣中，香蕉枯萎病拮抗菌的濃度不小于1.0×108cfu。
本發(fā)明還提供了所述的生物有機(jī)肥的制備方法，將所述的微生物菌劑與有機(jī)載體和輔料混合，然后進(jìn)行好氧堆肥處理，得到生物有機(jī)肥。
拮抗菌菌劑在應(yīng)用過程中，需要為其提供合適的有機(jī)載體，以保障其在土壤中有效定殖。本發(fā)明將拮抗菌菌劑與有機(jī)載體結(jié)合進(jìn)行二次發(fā)酵，獲得生物有機(jī)肥產(chǎn)品，該產(chǎn)品不僅為拮抗菌生長提供養(yǎng)分，也能改善土壤理化和生物性質(zhì)，促進(jìn)植物生長，減少病害發(fā)生。
優(yōu)選地，所述有機(jī)載體為畜禽糞便好氧堆肥產(chǎn)品。
畜禽糞便好氧堆肥產(chǎn)品的原料包括：牛糞、豬糞、羊糞、犬糞、雞糞、鴨糞、鵝糞等等。
進(jìn)一步地，所述有機(jī)載體與所述微生物菌劑以固液比為3-8:1混合，其中，固液比的單位為kg/l。
優(yōu)選地，所述有機(jī)載體與所述微生物菌劑以固液比為5-6:1混合。
進(jìn)一步地，所述有機(jī)載體先與輔料混合，得到原料混合物；所述輔料包括花生麩和菜籽粕，所述輔料的添加量為所述有機(jī)載體重量的8％-12％。
其中，如花生麩和菜籽粕的重量比例可以為0.5-2:1。
進(jìn)一步地，所述原料混合物與所述微生物菌劑混合的時(shí)期包括：
好氧堆肥開始前，用純凈水調(diào)節(jié)原料混合物的水分至50wt％～60wt％，獲得堆肥堆體，進(jìn)行好氧堆肥處理，堆體降溫時(shí)期添加所述微生物菌劑；
或
好氧堆肥開始前，添加所述微生物菌劑調(diào)節(jié)原料混合物含水量至50wt％～60wt％，獲得堆肥堆體，進(jìn)行好氧堆肥處理；
或
好氧堆肥開始前，添加所述微生物菌劑調(diào)節(jié)原料混合物含水量至50wt％～60wt％，獲得堆肥堆體，進(jìn)行好氧堆肥處理；所述堆體降溫時(shí)期再次添加所述微生物菌劑。
具體地，有機(jī)載體、微生物菌劑和輔料的添加方式有三種，具體如下：
堆肥處理前，在所述有機(jī)載體中添加10％花生麩和菜籽粕，獲得原料混合物；拮抗菌菌劑按照5:1固液比接入所述原料混合物中；拮抗菌初始濃度為1.0×109cfu/ml，接種后調(diào)節(jié)原料混合物的水分至50wt％～60wt％。
或
堆肥處理前，在所述有機(jī)載體中添加10％花生麩和菜籽粕，獲得原料混合物，用純凈水調(diào)節(jié)所述原料混合物的水分至50wt％～60wt％，獲得堆肥堆體。所述堆體溫度降至35℃以下后，將所述微生物菌劑按照固液比5:1接入堆體中，拮抗菌初始濃度為1.0×109cfu/ml。
或
堆肥處理前，將所述微生物菌劑按照5:1固液比接入所述原料混合物中；所述拮抗菌初始濃度為1.0×109cfu/ml，接種后調(diào)節(jié)所述原料混合物的水分至50wt％～60wt％，獲得堆肥堆體。所述堆體溫度降至35℃以下后，再次將微生物菌劑按照固液比5:1接入堆體中。
進(jìn)一步地，所述好氧堆肥處理的條件為：每隔45-50h翻堆一次；每隔50-70min通風(fēng)5-7min，通風(fēng)量為30±2l/min；堆體維持高溫35～45℃達(dá)5d以上，降溫至35℃以下后干燥所述堆體水分含量至30wt％～40wt％。
好氧堆肥處理可置于智能堆肥反應(yīng)器中進(jìn)行，簡(jiǎn)便易于操作。
本發(fā)明還提供了所述的生物有機(jī)肥在香蕉枯萎病防控中的應(yīng)用，在香蕉育苗和/或香蕉種植過程的基質(zhì)中添加所述生物有機(jī)肥。
具體地，生物有機(jī)肥的應(yīng)用方法包含以下方面：在香蕉杯苗育苗基質(zhì)中，每杯苗按照2％比例添加上述生物有機(jī)肥，充分混勻；杯苗移栽時(shí)，在不破壞基質(zhì)形狀的前提下，將其移至盆栽土中；盆栽土在移栽前，預(yù)先施入所述生物有機(jī)肥，施入比例為1％。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
(1)本發(fā)明經(jīng)篩選得到一株香蕉枯萎病拮抗菌，該拮抗菌為貝萊斯芽孢桿菌，對(duì)香蕉枯萎病病原菌有顯著的平板抑制效果、溫室盆栽防控效果和田間防控效果。
(2)本發(fā)明還提供了香蕉枯萎病拮抗菌的液體菌劑，便于使用。
(3)本發(fā)明將拮抗菌菌劑與堆肥產(chǎn)品載體結(jié)合進(jìn)行二次固體發(fā)酵，有機(jī)載體可為拮抗菌的生長提供養(yǎng)分，有利于拮抗菌在土壤中的存活和定殖，保障其在防控中的應(yīng)用效果，可顯著提高生防效率。
(4)本發(fā)明提供的生物有機(jī)肥在香蕉育苗和移栽時(shí)期均添加，有利于在香蕉根際構(gòu)建拮抗菌群落體系，提高香蕉根際拮抗菌數(shù)量，從而增強(qiáng)香蕉根際對(duì)病原菌的抵抗力，降低病害發(fā)生。
附圖說明
為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中對(duì)篩選得到的香蕉枯萎病拮抗菌h-6制得的系統(tǒng)發(fā)育樹示意圖。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1
防控香蕉枯萎病拮抗菌的篩菌來源為發(fā)病蕉園中的健康香蕉植株根際土，以香蕉枯萎病病原菌4號(hào)生理小種作為指示菌，經(jīng)過平板初篩和復(fù)篩，獲得一株具有明顯平板抑制效果的拮抗菌，編號(hào)為h-6；通過劃線純化獲得所述拮抗菌單菌落。
1、h-6的形態(tài)及生理生化鑒定
挑取lb斜面上的拮抗菌h-6，接種于lb平板上劃線，30℃培養(yǎng)36h，觀察單菌落形態(tài)。采用hbi微生物生化鑒定條(海博生物公司，青島)進(jìn)行拮抗菌生理生化鑒定。菌株革蘭氏染色參照《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行。
鑒定結(jié)果：
菌株在lb平板上生長，單菌落呈近圓形，邊緣整齊，半透明，表面光滑，中間有突起，近白色。生理生化鑒定結(jié)果見表1。
表1h-6菌株的生理生化鑒定結(jié)果
2、h-6的16srrna基因鑒定
拮抗菌dna提取采用試劑盒提取方法，所用試劑盒由天根生化科技有限公司提供。菌株16srrna基因片段采用pcr擴(kuò)增，所用引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，引物序列為：27f(見seqidno.1)：agagtttgatcctggctcag；1492r(見seqidno.2)：ggttaccttgttacgactt。pcr反應(yīng)體系為50μl：dntp4μl，10×buffer5μl，mgcl25μl，模板dna1μl，引物各1μl，taq酶0.5μl，雙蒸水32.5μl。pcr擴(kuò)增條件：(1)預(yù)變性，94℃5min；(3)變性，94℃30s，退火，52℃30s，延伸，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；(3)終延伸，72℃10min；(4)保溫，10℃。pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送樣測(cè)序，測(cè)序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成，所得測(cè)序結(jié)果(見seqidno.3)上傳ncbi與genbank中的序列進(jìn)行blast比對(duì)分析，與現(xiàn)有的菌株比較，最大相似度為98％，應(yīng)用軟件mega6.0構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖1所示。
經(jīng)生理生化特性和16srrna基因鑒定，確定該拮抗菌為貝萊斯芽孢桿菌bacillusvelezensis。
實(shí)施例2
菌劑制備：挑取h-6拮抗菌的單菌落，接種于新鮮的lb試管培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)過夜后獲得拮抗菌種子液，培養(yǎng)條件為30℃，170r/min；將上述種子液按照2％比例轉(zhuǎn)接至裝有新鮮的lb培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床培養(yǎng)3d，檢測(cè)拮抗菌的數(shù)量達(dá)1.0×109cfu/ml后將菌液離心，離心條件為：10000r/min，5min，棄上清，收集菌體，用等體積去離子水重懸，拮抗菌的初始數(shù)量為1.0×109cfu/ml。
生物有機(jī)肥：將50kg牛糞堆肥產(chǎn)品與5kg花生麩和5kg菜籽粕混合均勻，添加12l拮抗菌菌劑調(diào)節(jié)混合后的堆體含水量至50wt％～60wt％，拮抗菌在堆體中的初始濃度約為1.0×108cfu/g干樣；充分?jǐn)嚢杈鶆?，使堆體養(yǎng)分和水分含量保持均一，堆體置于智能堆肥反應(yīng)器中開始二次發(fā)酵，每隔2d翻堆一次堆體；每隔1h通風(fēng)6min，通風(fēng)量為30l/min；堆體維持高溫35～45℃達(dá)5d左右，降溫至35℃以下后干燥堆體水分含量至30wt％～40wt％，獲得生物有機(jī)肥產(chǎn)品。
對(duì)照組1：常規(guī)化肥處理，施用尿素5.02g/10kg土，過磷酸鈣16.79g/10kg土，氯化鉀3.63g/10kg土。
對(duì)照組2：與上述生物有機(jī)肥不同的是，堆體添加12l純凈水替代菌劑，其他條件一致，即對(duì)照組2在有機(jī)肥發(fā)酵過程中不添加任何微生物菌劑。
應(yīng)用方法：育苗階段，對(duì)照組和生物有機(jī)肥處理組所用育苗基質(zhì)中均添加所述生物有機(jī)肥產(chǎn)品；移栽時(shí)，保持育苗基質(zhì)形狀，將整株苗移栽至盆栽土中；移栽前，對(duì)照組1、2及生物有機(jī)肥處理組的盆栽土中預(yù)先分別拌入化肥、對(duì)照有機(jī)肥和所述生物有機(jī)肥。對(duì)照組與生物有機(jī)肥處理對(duì)香蕉枯萎病的防控效果見表2。
表2生物有機(jī)肥對(duì)香蕉枯萎病的防控試驗(yàn)i
從表2可以看出，對(duì)照組的發(fā)病率明顯高于制得的生物有機(jī)肥組，并且，對(duì)照2處理的生防率為58.3％，而生物有機(jī)肥生防率達(dá)72.2％，本發(fā)明制得的生物有機(jī)肥生防效果顯著高于不加菌劑的對(duì)照組2。
實(shí)施例3
準(zhǔn)備拮抗菌菌劑：挑取h-6拮抗菌的單菌落，接種于新鮮的lb試管培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)過夜后獲得拮抗菌種子液，培養(yǎng)條件為30℃，170r/min；將上述種子液按照2％比例轉(zhuǎn)接至裝有新鮮的lb培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床培養(yǎng)3d，培養(yǎng)條件為30℃，170r/min；檢測(cè)所述三角瓶中拮抗菌的數(shù)量，達(dá)1.0×109cfu/ml后將菌液離心，離心條件為：10000r/min，5min，棄上清，收集菌體，用原菌液等體積量的去離子水將菌體重懸，充分混勻，獲得所述拮抗菌菌劑，所述菌劑中拮抗菌的初始數(shù)量為1.0×109cfu/ml。
生物有機(jī)肥：將50kg牛糞堆肥產(chǎn)品與5kg花生麩和5kg菜籽粕混合均勻，添加12l純凈水調(diào)節(jié)混合后的堆體含水量至50wt％～60wt％，充分?jǐn)嚢杈鶆颍苟洋w養(yǎng)分和水分含量保持均一，堆體置于智能堆肥反應(yīng)器中進(jìn)行二次固體發(fā)酵，每隔2d翻堆一次所述堆體；每隔1h通風(fēng)6min，通風(fēng)量為30l/min；堆體維持高溫35～45℃達(dá)5d以上，降溫至35℃以下后，添加12l拮抗菌菌液，充分混勻后干燥堆體水分含量至30wt％～40wt％，獲得生物有機(jī)肥產(chǎn)品。
對(duì)照組1：常規(guī)化肥處理，施用尿素5.02g/10kg土，過磷酸鈣16.79g/10kg土，氯化鉀3.63g/10kg土。
對(duì)照組2：與上述生物有機(jī)肥不同的是，堆體添加12l純凈水替代菌劑，其他條件一致，即對(duì)照組2在有機(jī)肥發(fā)酵過程中不添加任何微生物菌劑。
應(yīng)用方法：育苗階段，對(duì)照組和生物有機(jī)肥處理組所用育苗基質(zhì)中均添加所述生物有機(jī)肥產(chǎn)品；移栽時(shí)，保持育苗基質(zhì)形狀，將整株苗移栽至盆栽土中；移栽前，對(duì)照組1、2及生物有機(jī)肥處理組的盆栽土中預(yù)先分別拌入化肥、對(duì)照有機(jī)肥和所述生物有機(jī)肥。對(duì)照組與生物有機(jī)肥處理對(duì)香蕉枯萎病的防控效果見表3。
表3生物有機(jī)肥對(duì)香蕉枯萎病的防控試驗(yàn)ii
從表3可以看出，對(duì)照組的發(fā)病率明顯高于制得的生物有機(jī)肥組，并且，對(duì)照2處理的生防率為58.8％，而生物有機(jī)肥生防率達(dá)75.3％。本發(fā)明制得的生物有機(jī)肥生防效果顯著高于不加菌劑的對(duì)照組2。
實(shí)施例4
準(zhǔn)備拮抗菌菌劑：挑取h-6拮抗菌的單菌落，接種于新鮮的lb試管培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)過夜后獲得拮抗菌種子液，培養(yǎng)條件為30℃，170r/min；將上述種子液按照2％比例轉(zhuǎn)接至裝有新鮮的lb培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床培養(yǎng)3d，培養(yǎng)條件為30℃，170r/min；檢測(cè)所述三角瓶中拮抗菌的數(shù)量，達(dá)1.0×109cfu/ml后將菌液離心，離心條件為：10000r/min，5min，棄上清，收集菌體，用原菌液等體積量的去離子水將菌體重懸，充分混勻，獲得所述拮抗菌菌劑，所述菌劑中拮抗菌的初始數(shù)量為1.0×109cfu/ml。
生物有機(jī)肥：將50kg牛糞堆肥產(chǎn)品與5kg花生麩和5kg菜籽粕混合均勻，添加12l拮抗菌菌液調(diào)節(jié)堆體含水量至50wt％～60wt％，充分?jǐn)嚢杈鶆?，使堆體養(yǎng)分和水分含量保持均一，堆體置于智能堆肥反應(yīng)器中開始堆肥過程，每隔2d翻堆一次所述堆體；每隔1h通風(fēng)6min，通風(fēng)量為30l/min；堆體維持高溫35～45℃達(dá)5d以上，降溫至35℃以下后，再次添加12l拮抗菌菌液，充分混勻后干燥所述堆體水分含量至30wt％～40wt％，獲得生物有機(jī)肥產(chǎn)品。
對(duì)照組1：常規(guī)化肥處理，施用尿素5.02g/10kg土，過磷酸鈣16.79g/10kg土，氯化鉀3.63g/10kg土。
對(duì)照組2：與上述生物有機(jī)肥不同的是，堆體添加12l純凈水替代菌劑，其他條件一致，即對(duì)照組2在有機(jī)肥發(fā)酵過程中不添加任何微生物菌劑。
應(yīng)用方法：育苗階段，對(duì)照組和生物有機(jī)肥處理組所用育苗基質(zhì)中均添加所述生物有機(jī)肥產(chǎn)品；移栽時(shí)，保持育苗基質(zhì)形狀，將整株苗移栽至盆栽土中；移栽前，對(duì)照組1、2及生物有機(jī)肥處理組的盆栽土中預(yù)先分別拌入化肥、對(duì)照有機(jī)肥和所述生物有機(jī)肥。對(duì)照組與生物有機(jī)肥處理對(duì)香蕉枯萎病的防控效果見表4。
表4生物有機(jī)肥對(duì)香蕉枯萎病的防控試驗(yàn)iii
從表4可以看出，對(duì)照組的發(fā)病率明顯高于制得的生物有機(jī)肥組，并且，對(duì)照2處理的生防率為58.3％，而生物有機(jī)肥生防率達(dá)77.8％，本發(fā)明制得的生物有機(jī)肥生防效果顯著高于不加菌劑的對(duì)照組2。
實(shí)施例5
準(zhǔn)備拮抗菌菌劑：取所篩選出的拮抗菌的單菌落h-6，接種于新鮮的lb試管培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)過夜后獲得拮抗菌種子液，培養(yǎng)條件為30℃，170r/min；將上述種子液按照2％比例轉(zhuǎn)接至裝有新鮮的lb培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床培養(yǎng)3d，培養(yǎng)條件為30℃，170r/min；檢測(cè)所述三角瓶中拮抗菌的數(shù)量，達(dá)1.0×109cfu/ml后將菌液離心，離心條件為：10000r/min，5min，棄上清，收集菌體，用原菌液等體積量的去離子水將菌體重懸，充分混勻，獲得拮抗菌菌劑，菌劑中拮抗菌的初始數(shù)量為1.0×109cfu/ml。
生物有機(jī)肥：將1000kg牛糞堆肥產(chǎn)品與200kg花生麩和50kg米糠混合均勻，添加250l拮抗菌菌液調(diào)節(jié)堆體含水量至50wt％～60wt％，充分?jǐn)嚢杈鶆颍苟洋w養(yǎng)分和水分含量保持均一，將堆體移置于智能控制的槽式堆肥中進(jìn)行二次發(fā)酵，每隔1h通風(fēng)15min；每隔2d翻堆一次所述堆體。堆體維持高溫40～45℃達(dá)5d以上，降溫至35℃以下后出槽，再次添加250l拮抗菌菌液，充分混勻后干燥堆體水分含量至30wt％～40wt％，獲得生物有機(jī)肥產(chǎn)品。
對(duì)照組1：農(nóng)民常規(guī)施肥，作為基肥，施入與生物有機(jī)肥養(yǎng)分含量一致的復(fù)合肥，施用量為45kg/畝。
對(duì)照組2：與上述生物有機(jī)肥不同的是，堆體添加250l純凈水替代菌劑，其他條件一致，即對(duì)照組2在有機(jī)肥發(fā)酵過程中不添加任何微生物菌劑。
應(yīng)用方法：對(duì)照組和生物有機(jī)肥處理組所用育苗基質(zhì)中均按照3.0％～5.0％添加量添加所述生物有機(jī)肥產(chǎn)品，移栽時(shí)保持育苗基質(zhì)形狀，將整株苗移栽至大田中；其中大田中已預(yù)先施用500kg/畝比例生物有機(jī)肥產(chǎn)品作為基肥；對(duì)照組1和2也均在大田中預(yù)先分別施用復(fù)合肥和對(duì)照有機(jī)肥。不同處理對(duì)香蕉枯萎病的防控效果見表5。
表5生物有機(jī)肥對(duì)香蕉枯萎病的防控試驗(yàn)iv
從表5可以看出，在大田試驗(yàn)中，對(duì)照組的發(fā)病率仍然明顯高于制得的生物有機(jī)肥組，并且，本發(fā)明制得的生物有機(jī)肥生防效果顯著高于不加菌劑的對(duì)照組2。
需要說明的是，本發(fā)明實(shí)施例中所用的牛糞堆肥產(chǎn)品購自廣州穩(wěn)德農(nóng)業(yè)科技有限公司。實(shí)施例5中對(duì)照組1作為基肥施用的復(fù)合肥由兩種復(fù)合肥按照1:1比例混合組成，兩種復(fù)合肥均購自廣州市新農(nóng)科肥業(yè)科技有限公司，分別為新農(nóng)科復(fù)混肥料通用肥(粵農(nóng)肥(2007)準(zhǔn)字073號(hào)，15-0-15)和新農(nóng)科硫酸鉀復(fù)合肥(粵農(nóng)肥(2009)準(zhǔn)字0054號(hào)，15-15-15)。
此外，實(shí)施例2-5中，對(duì)照組2的生防率＝(對(duì)照組1的發(fā)病率-對(duì)照組2的發(fā)病率)/對(duì)照組1的發(fā)病率*100％，生物有機(jī)肥的生防率＝(對(duì)照組1的發(fā)病率-生物有機(jī)肥的發(fā)病率)/對(duì)照組1的發(fā)病率*100％。
盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。
<110>廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所
<120>香蕉枯萎病拮抗菌以及生物有機(jī)肥及其制備方法和應(yīng)用
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