本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種無(wú)血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液。

背景技術(shù)：

化學(xué)物直接接觸或者暴露于眼部，會(huì)引發(fā)刺激性以及局部毒性。因此，眼表刺激性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是危害評(píng)價(jià)以及風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避程序中非常需要的一項(xiàng)。傳統(tǒng)方法中對(duì)新型化合物的眼刺激潛在風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估主要依賴于體外的兔子實(shí)驗(yàn)，這種方法耗時(shí)耗力、且成本較高。因此，尋找快速、經(jīng)濟(jì)的化合物篩選方法成為該領(lǐng)域的一項(xiàng)迫切需求，并激發(fā)了大量的關(guān)于眼表刺激性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的體外替代方法的建立，例如牛角膜不透明度及滲透性檢測(cè)，雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)等，上述技術(shù)通過(guò)一定程度的組合可以實(shí)現(xiàn)體外眼刺激性評(píng)價(jià)，但卻都無(wú)法完全實(shí)現(xiàn)兔眼刺激實(shí)驗(yàn)的體外替代；另外，這些體外替代方法適用范圍有限，只能評(píng)價(jià)化妝品原料，不能評(píng)價(jià)化妝品成品。近年來(lái)，隨著體外器官培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，基于體外細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建的3d重組角膜上皮模型，在眼刺激風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)領(lǐng)域表現(xiàn)出特有的優(yōu)勢(shì)，類(lèi)似于人體角膜上皮的細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)，不僅可以更為真實(shí)的反映人體對(duì)化學(xué)物的響應(yīng)，準(zhǔn)確給出化學(xué)物刺激性的預(yù)測(cè)，對(duì)于化合物篩選的種類(lèi)也具有更寬的應(yīng)用范疇，不僅適用于化妝品原料的危害評(píng)價(jià)，還可以用于不同劑型的化妝品成品的危害評(píng)估。

目前，角膜上皮細(xì)胞是構(gòu)建體外三維角膜上皮組織模型最理想的種子細(xì)胞，構(gòu)建的三維角膜模型的生物學(xué)特性更能反映真實(shí)的角膜組織。然而由于分化后的角膜上皮細(xì)胞體外生長(zhǎng)的生命周期很短，只能傳2～3代，獲得的細(xì)胞數(shù)量少，花費(fèi)較高，限制了角膜組織的研究和組織工程化角膜的構(gòu)建。如何改進(jìn)體外培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)出分裂增殖能力強(qiáng)、能不斷分裂生長(zhǎng)的角膜上皮細(xì)胞，以補(bǔ)充細(xì)胞的不斷更新，成為獲得角膜上皮種子細(xì)胞的首要任務(wù)。另外，研究發(fā)現(xiàn)口腔黏膜上皮細(xì)胞與角膜上皮細(xì)胞特征相似，亦可以用于構(gòu)建角膜樣模型。

現(xiàn)如今，無(wú)論是角膜上皮細(xì)胞還是口腔黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)大多是參照皮膚kc的培養(yǎng)技術(shù)，早期多采用有血清培養(yǎng)基和組織塊法，血清成份占10-20%。souhtgaet等綜合分析了培養(yǎng)基中的各種成份對(duì)原代口腔上皮細(xì)胞生長(zhǎng)分化的影響，研究發(fā)現(xiàn)含血清10%的培養(yǎng)基成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)明顯，對(duì)正常的口腔上皮細(xì)胞造成嚴(yán)重的污染，影響口腔黏膜上皮細(xì)胞在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。隨后許多上皮細(xì)胞的培養(yǎng)采用酶解培養(yǎng)法，即用胰酶和dispaseⅱ酶酶解的方法分離上皮細(xì)胞，然后以3t3作為滋養(yǎng)層的技術(shù)來(lái)進(jìn)行的，但由于滋養(yǎng)細(xì)胞的存在影響試驗(yàn)結(jié)果的分析。而且，許多研究者相信3t3細(xì)胞和人細(xì)胞共同培養(yǎng)有可能引起突變或異種蛋白對(duì)人kc的轉(zhuǎn)染，強(qiáng)調(diào)在選擇性手術(shù)中盡量不用滋養(yǎng)層培養(yǎng)上皮細(xì)胞。為了避免使用滋養(yǎng)層，人們發(fā)展了多種方法：如培養(yǎng)皿表面涂細(xì)胞基質(zhì)成份；不同濃度的鈣和各種生物提取物、促分裂物和微量元素的添加。arehnoltibdnslev應(yīng)用含10%血清的無(wú)滋養(yǎng)層培養(yǎng)方法，上皮細(xì)胞可傳代兩次，細(xì)胞形成復(fù)層，培養(yǎng)基中的血清除了誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)度分化導(dǎo)致上皮復(fù)層化外，血清中不明蛋白的存在，對(duì)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞表面標(biāo)志形成干擾，另外，培養(yǎng)基中牛血清可能含外源性污染物和其它慢病毒，對(duì)人有潛在的危險(xiǎn)。

針對(duì)上述問(wèn)題，許多學(xué)者正尋求和使用無(wú)血清培養(yǎng)基，目前已有商品化的無(wú)血清培養(yǎng)基如k-sfm和mcdb153。mcdb153是經(jīng)過(guò)多次改善得到的一款角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，但在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出局限性，繁殖和擴(kuò)增細(xì)胞的能力有限，研究發(fā)現(xiàn)如果角質(zhì)細(xì)胞在mcdb153中生長(zhǎng)至完全匯合，則快速地喪失其傳代能力。另外無(wú)血清培養(yǎng)基缺乏通用性，一種無(wú)血清培養(yǎng)基只能做到為一種或少數(shù)幾種細(xì)胞株設(shè)計(jì)或優(yōu)化出高密度生長(zhǎng)或高水平目的產(chǎn)物表達(dá)的培養(yǎng)基，而其他細(xì)胞在這樣的培養(yǎng)基體系中并不能較好的增殖生長(zhǎng)。

對(duì)于上皮細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，許多學(xué)者在基礎(chǔ)無(wú)血清培養(yǎng)液如k-sfm和mcdb153的基礎(chǔ)上，通過(guò)添加相關(guān)營(yíng)養(yǎng)成份如egf、胰島素、牛垂體提取液、氫化潑尼松、轉(zhuǎn)鐵蛋白和霍亂毒素等以及對(duì)其添加量進(jìn)行改進(jìn)，從而使其更適合于口腔黏膜上皮細(xì)胞或角膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，但是最多能夠傳至7-9代，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象比較明顯。主要原因是為了代替血清成份，在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加多種動(dòng)物提取物，導(dǎo)致出現(xiàn)某一種營(yíng)養(yǎng)成份過(guò)多而其他的另一種營(yíng)養(yǎng)成份缺乏的不均衡現(xiàn)象，一方面對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生慢性毒性損傷，另一方面細(xì)胞在快速增殖過(guò)程中產(chǎn)生自由基，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上，目前無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)程存在的缺點(diǎn)有：（1）無(wú)血清培養(yǎng)基缺乏通用性，一種無(wú)血清培養(yǎng)基只能做到為一種或少數(shù)幾種細(xì)胞株設(shè)計(jì)或優(yōu)化出高密度生長(zhǎng)或高水平目的產(chǎn)物表達(dá)的培養(yǎng)基，而其他細(xì)胞在這樣的培養(yǎng)基體系中并不能較好的增殖生長(zhǎng)，目前市場(chǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)液都是用于培養(yǎng)表皮細(xì)胞，沒(méi)有特有的培養(yǎng)口腔黏膜上皮細(xì)胞或角膜上皮細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)液；（2）無(wú)血清培養(yǎng)體系下培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，原有的干細(xì)胞特性下降，容易出現(xiàn)老化現(xiàn)象，很難大量擴(kuò)增，從而給大規(guī)模的組織工程構(gòu)建帶來(lái)困難；（3）無(wú)血清培養(yǎng)基為了代替血清中的營(yíng)養(yǎng)成份，會(huì)添加多種來(lái)自動(dòng)物的提取物，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成份不均衡，一些成份含量過(guò)多，使得細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生毒性物質(zhì)，從而損傷細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，黃素腺嘌呤二核苷酸或其鹽能夠顯著地抑制通過(guò)紫外線照射或干燥誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞的死亡。黃素腺嘌呤二核苷酸是體內(nèi)核黃素的活性型，作為某些氧化還原酶的輔基，參與體內(nèi)多種氧化脫氫反應(yīng)，但還沒(méi)有報(bào)道此化合物應(yīng)用于上皮細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種無(wú)血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，針對(duì)目前無(wú)血清培養(yǎng)體系下，上皮細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、原有的干細(xì)胞特性下降、細(xì)胞容易發(fā)生凋亡、出現(xiàn)老化現(xiàn)象、很難大量擴(kuò)增等一系列問(wèn)題，本發(fā)明在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，提供一種可使上皮細(xì)胞高密度增殖的無(wú)血清培養(yǎng)基體系，降低或者抑制在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性損傷，抑制細(xì)胞凋亡，延緩細(xì)胞衰老，使之在體外擴(kuò)增更多的倍數(shù)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明實(shí)施例采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明實(shí)施例提供一種無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、必需補(bǔ)充因子、生長(zhǎng)因子、貼壁因子、激素、細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子以及細(xì)胞凋亡抑制劑。

本發(fā)明提供一種無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，基礎(chǔ)培養(yǎng)液是無(wú)血清培養(yǎng)基是k-sfm或mcdb153或體積比為1∶3的f12和dmem混合培養(yǎng)液。

本發(fā)明提供的一種無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，必需補(bǔ)充因子為濃度為5-20μg/ml的胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白。

本發(fā)明提供的一種無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子egf、神經(jīng)生長(zhǎng)因子ngf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ和bpe，其中，表皮生長(zhǎng)因子egf、神經(jīng)生長(zhǎng)因子ngf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ和bpe的濃度均為5-50ng/ml。

本發(fā)明提供的一種無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，貼壁因子為濃度為5-50ng/ml的纖連蛋白。

本發(fā)明提供的一種無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，激素為濃度為1-10μm的氫化可的松。

本發(fā)明提供的一種無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子維甲酸、甘醇酸和cacl2，其中，維甲酸、甘醇酸和cacl2的濃度均為1-5μm。

本發(fā)明提供的一種無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞凋亡抑制劑為p53抑制劑pifithrin-α、天然提取的抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸fad中任意一種或者多種的組合，其中，p53抑制劑pifithrin-α、天然提取的抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸fad的濃度均為1-10μm。

本發(fā)明提供的一種無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，無(wú)血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基用于培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞或口腔粘膜上皮細(xì)胞。

本發(fā)明還提供一種無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液的配制方法，具體步驟為：

在基礎(chǔ)培養(yǎng)液k-sfm或mcdb153或體積比為1∶3的f12和dmem混合培養(yǎng)液中任選一種，依次添加濃度為5-20μg/ml的胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白，濃度為5-50ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子egf、神經(jīng)生長(zhǎng)因子ngf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、bpe和纖連蛋白，濃度為1-10μm的氫化可的松，濃度為1-5μm的維甲酸和甘醇酸等細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子，濃度為1-10μm的p53抑制劑pifithrin-α、天然提取的抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸（fad），最后添加cacl2，其濃度為1-10μm。攪拌待所有成份溶解，密封好后放置于4℃冰箱中備用。

本發(fā)明提供的一種無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液的有益效果在于：

（1）按照不同類(lèi)別上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，通過(guò)添加適量多類(lèi)型的營(yíng)養(yǎng)因子，從而避免培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)的不均衡出現(xiàn)上皮細(xì)胞由于缺乏某一種成份而發(fā)生生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象。例如，角膜周?chē)哂邪l(fā)達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)，在機(jī)體內(nèi)，神經(jīng)系統(tǒng)分泌多種的因子會(huì)滋養(yǎng)上皮細(xì)胞的增殖，所以在上皮培養(yǎng)液中添加神經(jīng)生長(zhǎng)因子以利于體外角膜上皮細(xì)胞的增殖。

（2）針對(duì)常規(guī)無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生，本發(fā)明的培養(yǎng)基中通過(guò)添加p53抑制劑、抗氧化劑和氧化代謝過(guò)程的相關(guān)酶來(lái)達(dá)到協(xié)同抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而能夠抑制或者清除在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物，延緩細(xì)胞的衰老，使之在體外擴(kuò)增更多的倍數(shù)；另外還添加了維甲酸/甘醇酸和cacl2等細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化，避免細(xì)胞的過(guò)渡分化而導(dǎo)致的增殖抑制現(xiàn)象。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的p53抑制劑pifithrin-α、天然提取的抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸（fad）協(xié)同抑制口腔黏膜上皮細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的口腔黏膜上皮細(xì)胞在本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液和無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153培養(yǎng)下，細(xì)胞凋亡率的比較；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的口腔黏膜上皮細(xì)胞在本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液和無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153培養(yǎng)下，細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)記物的mrna水平的表達(dá)情況比較；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的角膜上皮細(xì)胞在本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液和無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153培養(yǎng)下，培養(yǎng)不同時(shí)間，角膜上皮細(xì)胞增殖蛋白mrna含量的比較；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的角膜上皮細(xì)胞在本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液和無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153培養(yǎng)下，不同代次角膜上皮細(xì)胞活力的比較。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地描述。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明實(shí)施例中使用的k-sfm培養(yǎng)液、mcdb153培養(yǎng)液、f12/dmem培養(yǎng)液均購(gòu)自gibco公司，表皮生長(zhǎng)因子egf、神經(jīng)生長(zhǎng)因子ngf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、纖連蛋白、胰島素、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、cacl2、維甲酸以及p53抑制劑pifithrin-α、白藜蘆醇、黃素腺嘌呤二核苷酸或其鈉鹽均購(gòu)自sigma公司，牛垂體提取物（bpe）為本公司自行提取的。

實(shí)施例1

本發(fā)明實(shí)施例提供一種無(wú)血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，無(wú)血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液具體包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、必需補(bǔ)充因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子、激素、細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子以及細(xì)胞凋亡抑制劑。

其中，必需補(bǔ)充因子為濃度為5-20μg/ml的胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白；細(xì)胞生長(zhǎng)因子為濃度均為5-50ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子egf、神經(jīng)生長(zhǎng)因子ngf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ和牛垂體提取物（bpe）；貼壁因子為濃度為5-50ng/ml的纖連蛋白；激素為濃度為1-10μm的氫化可的松；細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子為濃度均為1-5μm的維甲酸、甘醇酸和cacl2；細(xì)胞凋亡抑制劑為濃度均為1-10μm的p53抑制劑pifithrin-α、抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸fad組合抑制劑。

需要說(shuō)明的是，基礎(chǔ)培養(yǎng)液為k-sfm培養(yǎng)液或者mcdb153培養(yǎng)液或者f12/dmem培養(yǎng)液，其中，所述f12/dmem培養(yǎng)液是f12培養(yǎng)液和dmem培養(yǎng)液以體積比1:3的比例混合的。

示例性的，在第一種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，本發(fā)明實(shí)施例提供的無(wú)血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液可以包括：以體積比為1∶3的f12和dmem混合培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制1l無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，具體配制過(guò)程如下：

（1）先在超凈臺(tái)中用無(wú)菌去離子水配制細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子的母液，其中必需補(bǔ)充因子胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的母濃度均為10mg/ml，細(xì)胞生長(zhǎng)因子表皮生長(zhǎng)因子egf、神經(jīng)生長(zhǎng)因子ngf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、牛垂體提取物（bpe）、貼壁因子纖連蛋白的母液濃度均為10mg/ml；氫化可的松母液濃度為10mm；細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子維甲酸、甘醇酸和cacl2母液濃度均為10mm；細(xì)胞凋亡抑制劑p53抑制劑pifithrin-α、抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸（fad）母液濃度均為10mm。

（2）將購(gòu)自gibco的f12/dmem（1:3）粉末培養(yǎng)基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中，然后將燒杯置于攪拌機(jī)上，攪拌2h待溶解后，用0.22μm的過(guò)濾器過(guò)濾除菌，得基礎(chǔ)培養(yǎng)液；

（3）在超凈工作臺(tái)中向上述步驟2的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加步驟1所述各種因子母液，使得胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度均為12.5μg/ml，細(xì)胞生長(zhǎng)因子表皮生長(zhǎng)因子egf、神經(jīng)生長(zhǎng)因子ngf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、牛垂體提取物（bpe）、貼壁因子纖連蛋白濃度均為25ng/ml；氫化可的松濃度為5μm；細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子維甲酸、甘醇酸，其濃度均為4μm；細(xì)胞凋亡抑制劑pifithrin-α、天然提取的抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸（fad），其濃度均為10μm。攪拌混勻；

（4）最后，在超凈工作臺(tái)中添加濃度為5μm的cacl2，攪拌均勻；

（5）儲(chǔ)存處理：密封好后放置于4℃冰箱中備用。

示例性的，在第二種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，本發(fā)明實(shí)施例提供的無(wú)血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液可以包括：

以k-sfm作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制1l無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，具體配制過(guò)程如下：

（1）先在超凈臺(tái)中用無(wú)菌去離子水配制細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子的母液，其中必需補(bǔ)充因子胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的母濃度均為10mg/ml，細(xì)胞生長(zhǎng)因子表皮生長(zhǎng)因子egf、神經(jīng)生長(zhǎng)因子ngf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、牛垂體提取物（bpe）、貼壁因子纖連蛋白的母液濃度均為10mg/ml；氫化可的松母液濃度為10mm；細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子維甲酸、甘醇酸和cacl2母液濃度均為10mm；細(xì)胞凋亡抑制劑p53抑制劑pifithrin-α、抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸（fad）母液濃度均為10mm；

（2）將購(gòu)自gibco的k-sfm粉末培養(yǎng)基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中，然后將燒杯置于攪拌機(jī)上，攪拌2h待溶解后，用0.22μm的過(guò)濾器過(guò)濾除菌，得基礎(chǔ)培養(yǎng)液；

（3）在超凈工作臺(tái)中向上述步驟2的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加步驟1所述各種因子母液，使得胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度均為5μg/ml，細(xì)胞生長(zhǎng)因子表皮生長(zhǎng)因子egf、神經(jīng)生長(zhǎng)因子ngf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、牛垂體提取物（bpe）、貼壁因子纖連蛋白濃度均為50ng/ml；氫化可的松濃度為1μm；細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子維甲酸、甘醇酸，其濃度均為5μm；細(xì)胞凋亡抑制劑pifithrin-α、天然提取的抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸（fad），其濃度均為5μm。攪拌混勻；

（4）最后，在超凈工作臺(tái)中添加濃度為2.5μm的cacl2，攪拌均勻后，密封放置于4℃冰箱中備用。

示例性的，在第三種可能的實(shí)現(xiàn)方式中，本發(fā)明實(shí)施例提供的無(wú)血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液可以包括：

以mcdb153作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制1l無(wú)血清上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，具體配制過(guò)程如下：

（1）先在超凈臺(tái)中用無(wú)菌去離子水配制細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子的母液，其中必需補(bǔ)充因子胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白的母濃度均為10mg/ml，細(xì)胞生長(zhǎng)因子表皮生長(zhǎng)因子egf、神經(jīng)生長(zhǎng)因子ngf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、牛垂體提取物（bpe）、貼壁因子纖連蛋白的母液濃度均為10mg/ml；氫化可的松母液濃度為10mm；細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子維甲酸、甘醇酸和cacl2母液濃度均為10mm；細(xì)胞凋亡抑制劑p53抑制劑pifithrin-α、抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸（fad）母液濃度均為10mm；

（2）將購(gòu)自gibco的k-sfm粉末培養(yǎng)基倒入裝有800ml去離子水的2l燒杯中，然后將燒杯置于攪拌機(jī)上，攪拌2h待溶解后，用0.22μm的過(guò)濾器過(guò)濾除菌，得基礎(chǔ)培養(yǎng)液；

（3）在超凈工作臺(tái)中向上述步驟2的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加步驟1所述各種因子母液，使得胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度均為20μg/ml，細(xì)胞生長(zhǎng)因子表皮生長(zhǎng)因子egf、神經(jīng)生長(zhǎng)因子ngf、胰島素生長(zhǎng)因子igf-i、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfβ、牛垂體提取物（bpe）、貼壁因子纖連蛋白濃度均為5ng/ml；氫化可的松濃度為10μm；細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子維甲酸、甘醇酸，其濃度均為1μm；細(xì)胞凋亡抑制劑pifithrin-α、天然提取的抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸（fad），其濃度均為1μm，攪拌混勻；

（4）最后，在超凈工作臺(tái)中添加濃度為1μm的cacl2，攪拌均勻后，密封放置于4℃冰箱中備用。

實(shí)施例2

p53抑制劑pifithrin-α、抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸（fad）協(xié)同抑制細(xì)胞凋亡的研究。

實(shí)驗(yàn)操作方法：

首先，基于基礎(chǔ)培養(yǎng)基mcdb153和必需補(bǔ)充因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子、激素、細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)因子以及細(xì)胞凋亡抑制劑的基礎(chǔ)上，配制三類(lèi)培養(yǎng)基：（1）只添加天然提取的抗氧化劑白藜蘆醇；（2）只添加黃素腺嘌呤二核苷酸fad（3）只添加p53抑制劑pifithrin-α，（4）同時(shí)添加p53抑制劑pifithrin-α、天然提取的抗氧化劑白藜蘆醇和黃素腺嘌呤二核苷酸（fad）。

復(fù)蘇p1代的口腔黏膜上皮細(xì)胞，分別接種于含有這四種培養(yǎng)基的25ml的培養(yǎng)瓶中，然后置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2d更換1次培養(yǎng)液。待口腔粘膜上皮細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，消化傳代再培養(yǎng)，培養(yǎng)至第12代，培養(yǎng)過(guò)程中運(yùn)用mtt細(xì)胞活力檢測(cè)技術(shù)隔代進(jìn)行細(xì)胞活力的檢測(cè)。

結(jié)果顯示，從p10代開(kāi)始，單獨(dú)添加幾種細(xì)胞凋亡抑制劑的細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的凋亡，而三種凋亡抑制劑都添加的一組中細(xì)胞的活力基本沒(méi)有下降，與其他三組相比具有顯著性，由此可見(jiàn)，三者協(xié)同使用可以實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡的作用（附圖1）。

實(shí)施例3

采用無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153和本發(fā)明實(shí)施例提供的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)口腔黏膜上皮細(xì)胞，傳代培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞凋亡率的比較研究：

實(shí)驗(yàn)操作方法：

在無(wú)菌條件下，復(fù)蘇凍存的p2代口腔黏膜上皮細(xì)胞，然后分別接種于無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153和本發(fā)明實(shí)施例提供的的培養(yǎng)液的25ml培養(yǎng)瓶中，然后置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2d更換1次培養(yǎng)液。待口腔黏膜上皮細(xì)胞為80%～90%融合時(shí)，消化形成細(xì)胞懸液，然后按照6e4個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至第6天時(shí)運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡率。

結(jié)果顯示，無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153培養(yǎng)的口腔粘膜上皮細(xì)胞的凋亡率明顯高于本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞（附圖2）。

實(shí)施例4

采用無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153和本發(fā)明實(shí)施例提供的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)口腔黏膜上皮細(xì)胞，其表面標(biāo)記物表達(dá)情況的比較研究：

實(shí)驗(yàn)操作方法：

無(wú)菌條件下切取出生后1d的昆明小鼠口腔黏膜，修剪去除粘膜下組織并剪成約1mm×1mm大小的組織塊，用含雙抗的pbs沖洗3～4次。將標(biāo)本放入4mg/mldispaseⅱ中，37℃消化約15min，然后分離上皮層。pbs輕輕沖洗上皮層后，置于0.25%胰蛋白酶中，37℃消化約10min，終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，離心棄掉上清后，分別接種于無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153和本發(fā)明的培養(yǎng)基體系的25ml培養(yǎng)瓶中，然后置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2d更換1次培養(yǎng)液。待口腔黏膜上皮細(xì)胞為80%～90%融合時(shí)，消化傳代再培養(yǎng)，直到培養(yǎng)至第9代時(shí)，收集不同體系的細(xì)胞，裂解細(xì)胞，提取rna，運(yùn)通rt-pcr法進(jìn)行口腔黏膜細(xì)胞表面的標(biāo)記物ck14，sox2和lgr5的比較分析。

結(jié)果顯示，與原代細(xì)胞相比，本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液培養(yǎng)的p9代細(xì)胞中細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)有下降，但沒(méi)有顯著性；而用無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153培養(yǎng)的p9代細(xì)胞的表面標(biāo)記物極顯著性地下降，含量異常低（附圖3）。

實(shí)施例5

采用無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153和本發(fā)明實(shí)施例提供的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞，細(xì)胞增殖情況的比較研究：

實(shí)驗(yàn)操作方法：

在無(wú)菌條件下，復(fù)蘇凍存的p2代角膜上皮細(xì)胞，然后分別接種于無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153和本發(fā)明實(shí)施例提供的的培養(yǎng)液的25ml培養(yǎng)瓶中，然后置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2d更換1次培養(yǎng)液。待角膜上皮細(xì)胞為80%～90%融合時(shí)，消化形成細(xì)胞懸液，然后按照3e4個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至第6天時(shí)運(yùn)用rt-pcr法分析細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki67蛋白的mrna含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從第2天開(kāi)始，與無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153相比，本發(fā)明實(shí)施例提供的的培養(yǎng)液下細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki67的mrna水平顯著性升高，培養(yǎng)到第6天時(shí)，本發(fā)明的培養(yǎng)體系下細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki67的mrna水平極顯著性升高（附圖4）。

實(shí)施例6

采用無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153和本發(fā)明實(shí)施例提供的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞，傳代培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞凋亡率的比較研究：

實(shí)驗(yàn)操作方法：

在無(wú)菌條件下，復(fù)蘇凍存的p2代角膜上皮細(xì)胞，然后分別接種于無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153和本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液的25ml培養(yǎng)瓶中，然后置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2d更換1次培養(yǎng)液。待角膜上皮細(xì)胞為80%～90%融合時(shí)，消化傳代再培養(yǎng)，培養(yǎng)至第12代，其中培養(yǎng)過(guò)程中運(yùn)用mtt細(xì)胞活力檢測(cè)技術(shù)隔代進(jìn)行細(xì)胞活力的檢測(cè)。

結(jié)果顯示，與原代細(xì)胞相比，無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153和本發(fā)明實(shí)施例提供的培養(yǎng)液培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞活力都有所降低，但是無(wú)血清培養(yǎng)基mcdb153培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞活力下降程度顯著性低于本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞活力（附圖5）。

本發(fā)明實(shí)施例提供一種無(wú)血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液，必需添加因子、生長(zhǎng)因子、貼壁因子、激素、細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子以及細(xì)胞凋亡抑制劑。針對(duì)目前無(wú)血清培養(yǎng)體系下，上皮細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、原有的干細(xì)胞特性下降、細(xì)胞容易發(fā)生凋亡、出現(xiàn)老化現(xiàn)象、很難大量擴(kuò)增等一系列問(wèn)題，本發(fā)明在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，提供一種可使上皮細(xì)胞高密度增殖的無(wú)血清培養(yǎng)基體系，降低或者抑制在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性損傷，抑制細(xì)胞凋亡，延緩細(xì)胞衰老，使之在體外擴(kuò)增更多的倍數(shù)。

以上所述，僅為本申請(qǐng)的具體實(shí)施方式，但本申請(qǐng)的保護(hù)范圍并不局限于此，任何在本申請(qǐng)揭露的技術(shù)范圍內(nèi)的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本申請(qǐng)的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。