本發(fā)明涉及醫(yī)學領域，更具體的說是涉及一種大鼠纖維化肺細胞的培養(yǎng)方法及其檢測方法。
背景技術：
胺碘酮又稱乙胺碘呋酮，是含碘苯丙呋喃衍生物，作為ⅲ類抗心律失常藥物廣泛應用于臨床，主要用于治療室性心律失常和心房顫動。其副作用主要表現(xiàn)為肺毒性、甲狀腺毒性、心臟毒性、消化系統(tǒng)毒性等，其中肺毒性反應最為嚴重，其發(fā)生率在1％-10％，肺毒性主要表現(xiàn)為肺纖維化，因發(fā)病機制不明，臨床缺乏有效治療措施，其死亡率高達33％，嚴重影響人民生命健康。但胺碘酮在抗心律失常方面療效確切、穩(wěn)定，目前尚無其他類似藥物替代，在臨床上應用仍十分廣泛。因此，闡明胺碘酮誘導肺纖維化機制對降低其藥物毒副作用，逆轉(zhuǎn)或延緩肺纖維化進程、改善患者預后、提高生存率有重要的臨床意義。
肺纖維化的病理生理過程與機制非常復雜，發(fā)病過程主要為組織損傷、新組織生成、組織重塑，最后肺內(nèi)出現(xiàn)成纖維細胞灶和細胞外基質(zhì)的異常沉積為主要特征的肺纖維化。成纖維細胞灶的形成是肺纖維化的重要病理特征，其中以肌成纖維細胞為主要效應細胞。目前emt被認為可能是肌成纖維細胞形成的主要途徑之一，由于正常肺內(nèi)肌成纖維細胞數(shù)量不多，肺纖維化中約33％的肌成纖維細胞是由ⅱ型肺泡上皮細胞通過emt途徑轉(zhuǎn)化而來。因此，深入研究ⅱ型肺泡上皮細胞表型轉(zhuǎn)化調(diào)控及機制對延緩乃至逆轉(zhuǎn)胺碘酮誘導的肺纖維化來說意義重大。因此制備體外細胞模型，從細胞和分子水平進一步探索胺碘酮誘導肺纖維化機制的發(fā)病機制，對其治療的突破至關重要。
技術實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種大鼠纖維化肺細胞的培養(yǎng)方法及其檢測方法，從分子水平制備胺碘酮誘導肺纖維化細胞，其能夠準確反映體內(nèi)胺碘酮誘導肺纖維化情況。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術方案：一種大鼠纖維化肺細胞的培養(yǎng)方法及其檢測方法，包括以下步驟：
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分數(shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分數(shù)0.02％的edta，然后過濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉藥進行麻醉，腹腔注射肝素鈉2800-3000u，將大鼠處死后打開胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動水浴中孵育10-30min，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成1-3mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入3-6ml小牛血清滅活酶，將樣品離心5-10min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，加入37℃預溫的紅細胞裂解液，反復吹打混勻，室溫放置5-8min，使紅細胞完全裂解，將樣品離心5-10min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40-60min，將未貼壁的細胞吸出，將樣品離心5-10min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復3-4次，吸出未貼壁細胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-2h，收集未黏附游離細胞的混懸液，將樣品離心5-10min，棄上清液，將細胞種植于24孔板中，每孔0.6-1ml，于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細胞進行實驗研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為10-180umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為5-10μm的1-磷酸鞘氨醇，1-磷酸鞘氨醇對肺組織無毒副作用，于4-6℃儲存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng)板置于37℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；
步驟五、檢測：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測液；將加入cck8檢測液的培養(yǎng)板再次置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2小時；取出培養(yǎng)板，使用酶標儀在波長為450nm的條件下測定吸光度。
作為本發(fā)明的進一步改進，在所述步驟四中向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為1-5μm的激動劑sew2871，激動劑sew2871對肺組織無毒副作用。
作為本發(fā)明的進一步改進，在所述步驟四中向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1-0.5μm的二氫辣椒堿，二氫辣椒堿對肺組織無毒副作用。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟二中通過注射3％戊巴比妥0.2-0.3ml/100g對大鼠進行麻醉。
作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟二中重懸的沉淀物和紅細胞裂解液的體積比為1∶8。
作為本發(fā)明的進一步改進，在所述步驟二中用灌注液灌注肺泡腔后，放在37℃振動水浴中孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，在孵育過程中用手不斷按摩肺臟。
本發(fā)明大鼠纖維化肺細胞的培養(yǎng)方法及其檢測方法，通過對大鼠ⅱ型肺泡上皮細胞進行分離、純化和原代培養(yǎng)，然后用胺碘酮刺激ⅱ型肺泡上皮細胞得到纖維化肺細胞，能夠增加胺碘酮誘導的肺纖維的發(fā)生率，能在短時間內(nèi)獲取大量纖維化肺細胞，能夠準確反映體內(nèi)胺碘酮誘導肺纖維化情況，深入研究ⅱ型肺泡上皮細胞表型轉(zhuǎn)化調(diào)控及機制對延緩乃至逆轉(zhuǎn)胺碘酮誘導的肺纖維化來說意義重大，為從細胞和分子水平進一步探索胺碘酮誘導肺纖維化機制的發(fā)病機制提供研究客體。
具體實施方式
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳述。
實施例1
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分數(shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分數(shù)0.02％的edta，然后過濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)通過注射3％戊巴比妥0.2ml/100g對大鼠進行麻醉進行麻醉，腹腔注射肝素鈉2800u，將大鼠處死后打開胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動水浴中孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，在孵育過程中用手不斷按摩肺臟，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成1mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入3ml小牛血清滅活酶，將樣品離心5min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，按1∶8的體積比加入37℃預溫的紅細胞裂解液，反復吹打混勻，室溫放置5min，使紅細胞完全裂解，將樣品離心5min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40min，將未貼壁的細胞吸出，將樣品離心5min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復3次，吸出未貼壁細胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，收集未黏附游離細胞的混懸液，將樣品離心5min，棄上清液，將細胞種植于24孔板中，每孔0.6ml，于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細胞進行實驗研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為20umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為5μm的1-磷酸鞘氨醇，于4℃儲存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng)板置于37℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；
步驟五、檢測：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測液；將加入cck8檢測液的24孔板再次置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時；取出24孔板，使用酶標儀在波長為450nm的條件下測定吸光度。
實施例2
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分數(shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分數(shù)0.02％的edta，然后過濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)通過注射3％戊巴比妥0.3ml/100g對大鼠進行麻醉進行麻醉，腹腔注射肝素鈉3000u，將大鼠處死后打開胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動水浴中孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，在孵育過程中用手不斷按摩肺臟，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成3mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入6ml小牛血清滅活酶，將樣品離心10min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，按1∶8的體積比加入37℃預溫的紅細胞裂解液，反復吹打混勻，室溫放置8min，使紅細胞完全裂解，將樣品離心10min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育50min，將未貼壁的細胞吸出，將樣品離心10min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復4次，吸出未貼壁細胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，收集未黏附游離細胞的混懸液，將樣品離心10min，棄上清液，將細胞種植于24孔板中，每孔0.8ml，于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細胞進行實驗研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為50umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為8μm的1-磷酸鞘氨醇，于6℃儲存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng)板置于37℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；
步驟五、檢測：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測液；將加入cck8檢測液的24孔板再次置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時；取出24孔板，使用酶標儀在波長為450nm的條件下測定吸光度。
實施例3
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分數(shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分數(shù)0.02％的edta，然后過濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)通過注射3％戊巴比妥0.3ml/100g對大鼠進行麻醉進行麻醉，腹腔注射肝素鈉3000u，將大鼠處死后打開胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動水浴中孵育30min，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成3mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入5ml小牛血清滅活酶，將樣品離心6min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，按1∶8的體積比加入37℃預溫的紅細胞裂解液，反復吹打混勻，室溫放置7min，使紅細胞完全裂解，將樣品離心5min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40min，將未貼壁的細胞吸出，將樣品離心5min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復4次，吸出未貼壁細胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，收集未黏附游離細胞的混懸液，將樣品離心10min，棄上清液，將細胞種植于24孔板中，每孔0.8ml，于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細胞進行實驗研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為80umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為8μm的1-磷酸鞘氨醇，于6℃儲存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng)板置于37℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；
步驟五、檢測：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測液；將加入cck8檢測液的24孔板再次置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時；取出24孔板，使用酶標儀在波長為450nm的條件下測定吸光度。
實施例4
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分數(shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分數(shù)0.02％的edta，然后過濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)通過注射3％戊巴比妥0.2-0.3ml/100g對大鼠進行麻醉進行麻醉，腹腔注射肝素鈉3000u，將大鼠處死后打開胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動水浴中孵育20min，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成2mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入6ml小牛血清滅活酶，將樣品離心10min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，按1∶8的體積比加入37℃預溫的紅細胞裂解液，反復吹打混勻，室溫放置8min，使紅細胞完全裂解，將樣品離心10min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60min，將未貼壁的細胞吸出，將樣品離心10min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復4次，吸出未貼壁細胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，收集未黏附游離細胞的混懸液，將樣品離心5min，棄上清液，將細胞種植于24孔板中，每孔0.6ml，于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細胞進行實驗研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為110umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為9μm的1-磷酸鞘氨醇，于6℃儲存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng)板置于37℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；
步驟五、檢測：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測液；將加入cck8檢測液的24孔板再次置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時；取出24孔板，使用酶標儀在波長為450nm的條件下測定吸光度。
實施例5
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分數(shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分數(shù)0.02％的edta，然后過濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)通過注射3％戊巴比妥0.2-0.3ml/100g對大鼠進行麻醉進行麻醉，腹腔注射肝素鈉2800-3000u，將大鼠處死后打開胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動水浴中孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，在孵育過程中用手不斷按摩肺臟，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成1mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入3ml小牛血清滅活酶，將樣品離心5min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，按1∶8的體積比加入37℃預溫的紅細胞裂解液，反復吹打混勻，室溫放置5min，使紅細胞完全裂解，將樣品離心5min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育45min，將未貼壁的細胞吸出，將樣品離心5min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復4次，吸出未貼壁細胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，收集未黏附游離細胞的混懸液，將樣品離心10min，棄上清液，將細胞種植于24孔板中，每孔0.8ml，于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細胞進行實驗研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為150umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為8μm的1-磷酸鞘氨醇，于4℃儲存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng)板置于37℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；
步驟五、檢測：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測液；將加入cck8檢測液的24孔板再次置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時；取出24孔板，使用酶標儀在波長為450nm的條件下測定吸光度。
實施例6
步驟一、培養(yǎng)基、灌注液和清洗液的配制：配制dmem培養(yǎng)基，再加入終濃度100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；配制灌注液，用pbs配制成質(zhì)量分數(shù)0.1％的胰蛋白酶，再加入終濃度100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和質(zhì)量分數(shù)0.02％的edta，然后過濾除菌得到灌注液；配制pbs清洗液，再加入終濃度100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
步驟二、取材：大鼠腹腔內(nèi)通過注射3％戊巴比妥0.3ml/100g對大鼠進行麻醉進行麻醉，腹腔注射肝素鈉3000u，將大鼠處死后打開胸腔，用清洗液經(jīng)右心室肺動脈洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振動水浴中孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，更換新的灌注液，再次孵育10min，在孵育過程中用手不斷按摩肺臟，去除氣管、大氣道和心臟，在含有dna酶ⅰ的培養(yǎng)皿中將肺切成2mm3的碎塊，往培養(yǎng)皿中加入4ml小牛血清滅活酶，將樣品離心10min，棄上清液，將沉淀物用清洗液重懸，按1∶8的體積比加入37℃預溫的紅細胞裂解液，反復吹打混勻，室溫放置8min，使紅細胞完全裂解，將樣品離心10min，棄上清液，將沉淀物在37℃培養(yǎng)基中重懸并計數(shù)；
步驟三、原代培養(yǎng)：將取材得到細胞接種在dmem培養(yǎng)基中，置于37℃、體積濃度5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育55min，將未貼壁的細胞吸出，將樣品離心5min，取下層沉淀，并接種于dmem培養(yǎng)基中，如此反復3次，吸出未貼壁細胞，然后將懸液接種入已用大鼠igg包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，收集未黏附游離細胞的混懸液，將樣品離心10min，棄上清液，將細胞種植于24孔板中，每孔1ml，于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后以原代細胞進行實驗研究；
步驟四、胺碘酮致纖維化肺細胞的培養(yǎng)：將胺碘酮加入無血清培養(yǎng)基dmem配成胺碘酮終濃度為160umolg/l的培養(yǎng)基，向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為5μm的1-磷酸鞘氨醇，于4℃儲存；將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的胺碘酮的新鮮培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng)板置于37℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；
步驟五、檢測：向上述培養(yǎng)板每孔中加入cck8試劑，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻cck8檢測液；將加入cck8檢測液的24孔板再次置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時；取出24孔板，使用酶標儀在波長為450nm的條件下測定吸光度。
實施例7
其它實驗條件和實施例6相同，但是在步驟四中向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為1、2、3、4或5μm的激動劑sew2871。
實施例8
實驗條件和實施例6相同，但是加入3μm的激動劑sew2871，在所述步驟四中向含有胺碘酮的培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4或0.5μm的二氫辣椒堿。
cck8檢測結(jié)果：
實施例7中添加不同濃度激動劑sew2871后，得到的成纖維細胞的增值情況，從表中可以看出，激動劑sew2871對成纖維細胞的增值具有促進作用，隨著激動劑sew2871濃度的增高，成纖維細胞的增值加快。
*p<0.05；**p<0.01
實施例8中添加不同濃度二氫辣椒堿濃度后，得到的成纖維細胞的增值情況，從表中可以看出，二氫辣椒堿濃度對成纖維細胞的增值具有促進作用，隨著二氫辣椒堿濃度的增高，成纖維細胞的增值加快。
*p<0.05；**p<0.01
羥脯氨酸含量測定
羥脯氨酸是膠原纖維中特有的一類氨基酸，測定肺部羥脯氨酸含量可以換算出膠原蛋白的含量，以判斷肺纖維化程度，按羥脯氨酸檢測試劑盒說明書方法測定培養(yǎng)基中羥脯氨酸含量，在酶標儀540nm處測定a值，樣品中羥脯氨酸質(zhì)量濃度(mg/l培養(yǎng)基)＝測定管a值×標準管濃度/標準液a值。測定胺碘酮致纖維化肺細胞中羥脯氨酸含量，結(jié)果如下：對照組為原代培養(yǎng)得到的ⅱ型肺泡上皮細胞
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的保護范圍并不僅局限于上述實施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術方案均屬于本發(fā)明的保護范圍。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。