本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型表達cry3a殺蟲蛋白的植物內(nèi)生工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

榆樹是多種天然林的重要組成部分。在我國，許多品種被用作道路觀賞、花園裝飾、土壤保護而廣泛種植。然而，近幾十年，許多成年榆樹死于蟲害。對此，許多森林保護者和研究人員在這一森林病害的防治上做了大量的工作，并開發(fā)了許多用于昆蟲防治的化學和生物制劑。然而，許多化學殺蟲劑，如有機磷農(nóng)藥、有機氯農(nóng)藥，已被證明對環(huán)境和人類健康造成傷害。

蘇云金芽孢桿菌bacillusthuringiensis(bt)分泌的殺蟲晶體蛋白(icps)因其對害蟲具有高度專一毒殺作用，且對環(huán)境和人畜安全的特性，成為世界上應(yīng)用最廣泛的一類微生物殺蟲劑。根據(jù)殺蟲晶體蛋白氨基酸序列的同源性，可將他們劃分為17群94亞類，目前已報道的編碼cry蛋白的基因達300多個，其中cry1類的表達產(chǎn)物對鱗翅目昆蟲有特異毒性，而cry3類的表達產(chǎn)物對鞘翅目昆蟲有特異毒性。國內(nèi)外一般都優(yōu)先選用cry3aa基因作為抗蟲基因轉(zhuǎn)入微生物構(gòu)建具有抗鞘翅目昆蟲殺蟲活性的bt工程菌。

公開號為cn105647952a的文獻公開了一種新型原核表達載體的構(gòu)建及生防菌開發(fā)應(yīng)用，方法通過orf對orf的方式替換掉原有載體的gfp蛋白，利用原載體翻譯gfp蛋白的啟動子來表達目的基因，通過重組構(gòu)建驗證，得到一種兼具殺蟲、抑菌功能的生防菌。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過優(yōu)化，創(chuàng)新改進現(xiàn)有常規(guī)表達載體難表達或不表達外源基因的缺陷，提供一種新型表達cry3a殺蟲蛋白的植物內(nèi)生工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，實現(xiàn)外源基因cry3a殺蟲蛋白在野生b.pyrrociniajk-sh007內(nèi)生菌中的高效表達。

本發(fā)明解決所述技術(shù)問題的方案是：一種新型表達cry3a殺蟲蛋白的植物內(nèi)生工程菌，該工程菌的dna序列如序列表seqidno：1所示。

一種新型表達cry3a殺蟲蛋白的植物內(nèi)生工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟，

(1)cry3aa的人工合成：cry3aa的密碼子序列來自于蘇云金芽孢桿菌，cry3aa根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好進行優(yōu)化，通過引物設(shè)計，合成dna；

(2)重組質(zhì)粒構(gòu)建：將t7rna聚合酶基因利用同源重組的方式連接到phkt2載體上，得到重組質(zhì)粒phkt2-t7rnapol；在重組質(zhì)粒phkt2-t7rnapol上構(gòu)建吡咯伯克霍爾德氏菌b.pyrrocinia-cry3aa表達載體質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒phkt2-cry3aa；

(3)cry3aa基因在吡咯伯克霍爾德氏菌b.pyrrociniajk-sh007中的表達：將重組質(zhì)粒phkt2-cry3aa導入b.pyrrociniajk-sh007感受態(tài)細胞,涂布濃度為50ug/ml含甲氧芐啶抗生素的lb抗性平板上，30℃過夜培養(yǎng)；cry3aa的蛋白表達通過將重組菌接于lb培養(yǎng)基，采用30℃，220r/min搖培，待od600＝0.8時,加終濃度為0.1mmol/liptg,并迅速升溫到42℃，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后取工程菌液離心，再將沉淀重懸于pbs緩沖液,利用超聲波破碎后離心收集細胞裂解液。

一種新型表達cry3a殺蟲蛋白的植物內(nèi)生工程菌在防治榆藍葉甲中的應(yīng)用。

本發(fā)明選用了針對鞘翅目害蟲的cry3a殺蟲蛋白，運用t7超表達系統(tǒng)，通過對cry3a密碼子的優(yōu)化、表達載體的篩選、插入位置的分析、誘導條件濃度等的組合優(yōu)化，實現(xiàn)了重組工程菌的構(gòu)建，使具有抑菌功效的植物內(nèi)生菌吡咯伯克霍爾德氏菌jk-sh007高效表達了cry3a蛋白。通過生測實驗，工程菌b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)被證明對榆樹甲蟲幼蟲具有較好的控制效果。本發(fā)明建立了以吡咯伯克霍爾德氏菌為宿主的蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白的表達系統(tǒng)，將有助于開發(fā)環(huán)保的生物農(nóng)藥，具有相當?shù)纳罎摿Α?/p>

附圖說明

序列表seqidno:1是本發(fā)明生防菌的dna序列；

圖1為phkt2-t7rnapol質(zhì)粒圖譜；

圖2為t7rna聚合酶和phkt2線性化載體擴增電泳分析結(jié)果，其中，m為λ-ecot14i分子標記，條帶1為t7rna聚合酶，條帶2為phkt2線性化載體；

圖3為phkt2-cry3aa質(zhì)粒圖譜；

圖4為t7啟動子-cry3aa-t7終止子以及phkt2-t7rna線性化載體的電泳分析結(jié)果，其中，m為λ-ecot14i分子標記，條帶1位t7啟動子-cry3aa-t7終止子，條帶2為phkt2-t7rna聚合酶線性化載體；

圖5為吡咯伯克霍爾德氏菌jk-sh007重組子dna提取的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中，n為phkt2-t7rna聚合酶質(zhì)粒dna；

圖6為b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)重組子的pcr驗證圖，圖中，n為phkt2-t7rnapol陰性對照，條帶1到8為陽性重組子cry3a的pcr驗證；

圖7為b.pyrrociniajk-sh007表達cry3aa融合蛋白sds-page和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果，圖中，m為蛋白分子標記，條帶1為b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-t7rnapol)的全蛋白圖譜，條帶2為b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)的全蛋白圖譜，箭頭指的為cry3aa(about70kda)；

圖8為b.pyrrociniajk-sh007重組菌液對榆藍葉甲幼蟲的毒殺存活率統(tǒng)計圖，取中位濃度0.83g/l濕重的b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)工程菌及b.pyrrociniajk-sh007(陰性對照)(n＝15)。

具體實施方式

實施例1

一種新型表達cry3a殺蟲蛋白的植物內(nèi)生工程菌，該工程菌的dna序列如序列表seqidno：1所示。

上述工程菌的構(gòu)建方法如下：

(1)cry3aa的人工合成及優(yōu)化

cry3aa的密碼子序列來自于蘇云金芽孢桿菌bacillusthuringiensis[genbankid:m84650.1]，加上n末端6×his標簽，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好進行優(yōu)化，通過dnawork軟件進行引物設(shè)計，合成dna(https://hpcwebapps.cit.nih.gov/cgi-bin/dnaworks)。cry3aa核苷酸序列利用引物(如表1所示)通過重疊pcr技術(shù)拼接而成。

表1用于t7啟動子-6×his標簽-cry3aa-t7終止子dna合成的引物序列

(2)重組質(zhì)粒構(gòu)建

為了實現(xiàn)t7啟動子在jk-sh007中對cry3aa基因的表達，首先將t7rna聚合酶基因利用同源重組的方式連接到phkt2載體上，載體骨架片段通過反向的pcr技術(shù)從phkt2中擴增而來，引物為phkt2f1/r1(見表2)，t7rna聚合酶[產(chǎn)品編號：p001509]通過引物t7rnapolf/r(見表2)從大腸桿菌bl21(de3)擴增得到，然后將擴增的目的片段和載體按照1:3(100ng載體：300ngdna片段)的比例混合，然后轉(zhuǎn)移到大腸桿菌xl-10gold感受態(tài)細胞中，重組質(zhì)粒通過測序確定為phkt2-t7rnapol，具體如圖1～2所示。

吡咯伯克霍爾德氏菌b.pyrrocinia-cry3aa表達載體質(zhì)粒構(gòu)建方法同上，利用引物cry3af/r、phkt2f2/r2(見表2)分別擴增目的片段和載體片段，其中pbluescriptsk(+)載體利用反向pcr擴增出t7promoter-6×his-cry3aa-t7teldna結(jié)構(gòu),重組質(zhì)粒通過測序鑒定確定為phkt2-cry3aa，具體如圖3～4所示。

表2本研究中的引物序列

注：表中標注下滑線的序列分別為phkt2和phkt2-t7rnapol表達載體的同源臂。

(3)cry3aa基因在吡咯伯克霍爾德氏菌b.pyrrociniajk-sh007中的表達

將重組phkt2-cry3aa質(zhì)粒導入b.pyrrociniajk-sh007感受態(tài)細胞，重組菌通過dna提取及pcr驗證結(jié)果如圖5～6所示。然后涂布濃度為50ug/ml含甲氧芐啶抗生素的lb抗性平板上，30℃過夜培養(yǎng)。將新重組菌株命名為b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)。cry3aa的蛋白表達通過將重組菌接于lb培養(yǎng)基，采用30℃，220r/min搖培，待od600＝0.8時,加終濃度為0.1mmol/liptg，并迅速升溫到42℃，繼續(xù)培養(yǎng)4h.能后取工程菌液(6000×g,10min)離心，再將沉淀重懸于pbs(100mmol/l,ph7.8)緩沖液,利用超聲波破碎(10℃,120w,15min)，離心收集細胞裂解液進行sds-page分析。

(4)sds-page和蛋白濃度測定

蛋白樣品采用4％-12％(w/v)sds聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)分離。通過考馬斯亮藍r-250染色檢測目標蛋白條帶。用bradford蛋白濃度試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。

(5)蛋白質(zhì)印跡western-blot

蛋白質(zhì)樣品在4％–12％tris-glycine凝膠分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，膜浸泡在10毫升tbst(20mmol/ltris-hcl，150mol/lmnacl,0.05％吐溫20)和10％(w/v)脫脂奶中，室溫1h。westernblot分析采用了一抗(單克隆抗-6×hisigg抗體，1:3000稀釋)和二抗羊抗鼠igg-hrp(辣根過氧化物酶標記，1:5000稀釋)。采用ecl發(fā)光液檢測底物；信號經(jīng)x光壓片、洗片記錄。

經(jīng)sds-page和westernblot蛋白免疫鑒定分析，如圖7所示，結(jié)果清晰顯示工程菌phkt2-cry3aa在野生吡咯伯克霍爾德氏菌中成功表達分子量為70kda的蛋白。將此條帶割膠，進一步通過基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行質(zhì)譜進行分析，確定其為cry3aa殺蟲蛋白。使用bradford法對蛋白定量，獲得約3.05g/l的總蛋白濃度，通過定量計算得到了在誘導蛋白表達中，誘導表達的cry3aa殺蟲蛋白約占15.6％。

(6)b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)中cry3aa殺蟲蛋白生物活性評價

為檢驗工程菌jk-sh007(phkt2-cry3aa)毒殺二齡榆藍葉甲幼蟲活性，實驗選取了0.21-3.32g/l五個不同梯度濕重的發(fā)酵菌液浸泡榆樹葉，每個稀釋濃度接種15條二齡榆藍葉甲幼蟲，實驗做三個重復，死亡率采用每隔8h記錄一次，直到96h調(diào)查死亡結(jié)果。結(jié)果如圖8所示：b.pyrrociniajk-sh007重組菌對榆藍葉甲幼蟲致死效果明顯，尤其當濃度為3.32g/l時，b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)工程菌對榆藍葉甲幼蟲致死率高達88.89％。通過計算得出，b.pyrrociniajk-sh007(phkt2-cry3aa)的致死中濃度lc50為0.63(0.48-0.82)g/l。

sequencelisting

<110>湖州師范學院

<120>一種新型表達cry3a殺蟲蛋白的植物內(nèi)生工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

<130>2017

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cgctcctttccgcaacccgcacagccaggggcgtattcgtgaactgttcagccaagccga7740

aagccactttcgtaatagcatgccgtcgtttgcgattagcggttatgaagtcctgttcct7800

gaccacctatgcgcaggccgcaaatacccatcttttcctgcttaaggacgcccagatcta7860

tggtgaagaatggggctatgaaaaagaggatatcgcggaattttacaagcgtcaattaaa7920

gcttacccaggaatataccgaccattgcgtgaaatggtataacgttggcctggataagtt7980

acgtggcagctcctacgaatcttgggtgaatttcaatcgttaccgtcgggagatgacctt8040

aaccgtgctggatctgattgcgctgtttcccctgtatgatgtccgtctgtatccgaagga8100

agtgaaaaccgaactgacccgtgatgtgctgaccgatccgattgttggcgtgaacaacct8160

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tataatcacaagcccattttatgggaataagagcagcgagccggtgcagaatttagaatt8400

caacggcgaaaaagtatatcgtgctgtcgcgaataccaatcttgcggtgtggccatcggc8460

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ggtcaaagcctataagctgcagagcggagcgagcgtggtggctggaccacgtttcaccgg8820

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tgtgtcttatagccagaagtaccgggcacgtattcattacgcgagcacctcccagattac8940

ctttactctgagcctggacggtgcgccgttcaatcaatactactttgataaaaccattaa9000

caaaggcgataccctgacctataactcttttaacctggcatccttctcgactccctttga9060

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<210>2

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

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<210>3

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatca60

<210>5

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<212>dna

<213>人工序列

<400>5

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<210>6

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<212>dna

<213>人工序列

<400>6

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<210>7

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

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<210>8

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<212>dna

<213>人工序列

<400>8

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<210>9

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

<400>10

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<210>11

<211>60

<212>dna

<213>人工序列

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<210>12

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>60

<212>dna

<213>人工序列

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<211>60

<212>dna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<210>18

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>dna

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aggtcagggtatcgcctttgttaatggttttatcaaagtagtattgattgaacggcgcac60

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aattggcgtaaccggtctgtctgctggcgataaagtgtatatagataaaatcgagttcat60

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<400>63

cgttggccgattcattaatgcagct25